天水地區花牛蘋果主栽品種香氣成分研究

張鈺敏，魏珊杉，林積紅，李 昭,2，李一婧,2*

（1.天水師范學院生物工程與技術學院，甘肅 天水 741001；2.甘肅省大櫻桃技術創新中心，甘肅 天水 741001）

我國常見的蘋果品系有富士系、元帥系、金冠系與國光系，其中元帥系在甘肅省天水市花牛鎮花牛村被廣泛栽培，而被命名為花牛蘋果。國家大力組織并實施開發‘新紅星’等元帥系蘋果后，花牛蘋果在人工的不斷移植與雜交下種類也逐漸增加，使天水地區成為全國規模最大的‘元帥’系蘋果種植地[1]，花牛蘋果已成為地方特色[2]，2007 年國家質檢總局對天水花牛蘋果實施地理標志性產品保護，花牛蘋果為甘肅天水的鄉村脫貧致富、全面推進鄉村振興做出了巨大貢獻[3]?，F天水地區主栽花牛蘋果的品種有‘俄矮二號’‘天汪一號’‘首紅’‘栽培二號’等。其中‘俄矮二號’為元帥系第五代蘋果，1988 年于河北省中國果樹所引入天水[4]?！焱粢惶枴翘焖麡溲芯克?980 年發現的元帥系第三代紅星樹短枝型新品種[5]?！准t’在1988 年于河北省中國果樹所引入天水，是元帥系蘋果第四代濃紅型短枝芽變品種[6]?！耘喽枴癁?995 年從鄭州果樹所引入天水的‘元帥’系第五代品種[7]。多方引入的新品種構成了天水地區豐富的花牛蘋果種質資源，也為當地作物經濟發展提供了基礎。

國內對花牛蘋果的品質評價指標主要包含單果質量、果形指數、果實硬度、可溶性固形物含量、可滴定酸含量、固酸比和維生素C 含量等[8]。但隨著果品市場的不斷發展，國內外對果品品質的要求也越來越高，尤其是天然風味物質在果品加工與銷售中的重要性逐漸凸顯[9]。眾多因素會影響果品香氣成分的變化，其中果品的種類是影響香氣成分構成的重要因素之一。杜薇等[10]通過分析不同種類果品的種質資源香氣物質，對比出了4 種香氣成分是5 個野生蘋果種共有的特征香氣，并且通過主成分分析方法得出特征香氣物質以反式-2-己烯醛等醛類物質為主。除種類以外，果品的采摘時間[11-13]、施肥條件[14]、生長環境[15]等差異對果品香氣物質具有顯著影響。由于香氣成分現已成為評價果品品質的重要指標之一，而果品的香氣成分又受到種植條件和果園管理水平等多因素的影響，所以對不同品種果品香氣成分的深入研究，不僅是品種選擇和引種的依據，還為標準化栽培管理規程的制訂提供參考。天水花牛蘋果作為國家地理標志保護產品，對其主栽品種的香氣成分研究卻鮮有報道，這不利于品牌市場認可度的確立和保護。本研究通過分析花牛蘋果主栽品種的揮發性風味成分組成，旨在為種植基地的品種選擇和品質鑒定標準的制訂提供依據，為進一步研究花牛蘋果的品質變化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

花牛蘋果由天水市兩區五縣共23 個管理相當的種植基地提供，有‘俄矮二號’‘天汪一號’‘首紅’和‘栽培二號’4 個品種。采樣時間為2020 年8 月底至10 月初，果品大小均一，無病蟲害。

1.2 香氣成分測定

在一種樣品中隨機抽取3 個樣品果，不分離果皮果肉，切至1 cm3大小碎塊后混勻，取5.0 g 裝入頂空進樣專用20 mL 螺口瓶中，每個樣品設置3 個平行。

GC 檢測條件為TG-1MS 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；柱溫程序：初始溫度為35 ℃，以8 ℃/min 的速率升溫至180 ℃，保持1 min；再以15 ℃/min 的速率升溫至230 ℃，保持4 min；繼續以15 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，保持5 min；進樣口：控制毛細管柱（不分流）進樣；MS測定使用電子轟擊電離源（EI）；傳輸線溫度280 ℃，離子源溫度300 ℃；載氣為高純He；掃描方式：全掃描，范圍25～500 amu。

1.3 標準譜庫檢索匹配度的選擇

依據公式（1） 對檢測到的化合物相對含量（Peak Area）進行歸一化處理[16]，將原始數據進行變換把數據映射到[0,1]之間，而后采用CRITIC 權重法對比不同匹配度的準確性和適用性[17-18]。CRITIC 權重法是一種客觀賦權法。權重計算時，將樣本數據進行無量綱化處理，如歸一化處理，即得到最終的權重，后用權重計算樣本綜合得分，綜合得分是結合權重和具體數據相乘，得到的一個綜合值，可用于綜合數據進行評價，分值越高代表該數據價值越高。

式中，x*i為歸一化后的值，xi為原始值，xmin為最小值，xmax為最大值。

1.4 數據處理

根據GC-MS 得到的總離子流色譜圖，在NIST 譜庫中進行自動檢索，確定出揮發性香氣成分，根據峰面積進行歸一化，得出香氣物質的相對含量，使用Xcalibur 軟件對質譜數據進行分析。用R 語言Factoextra 包和FactoMineR 包進行主成分分析（PCA）及作圖。

2 結果與分析

2.1 標準譜庫檢索匹配度的選擇

為鑒別‘元帥’系花牛蘋果香氣成分構成，本試驗利用GC-MS 全掃描模式對樣品中所含有的全部香氣成分進行測定，通過在NIST 譜庫中檢索，對檢出化合物進行定性分析。由于受到儀器設備和樣品的影響，GC-MS 檢測到的物質在譜庫檢索時是以匹配度（Probability）進行排序，通常選擇匹配度最高的化合物進行定性。但匹配度的閾值選擇尚沒有統一的標準，設置的標準譜庫匹配度條件不同，篩選出的離子數量便有所變化。因此，本研究使用CRITIC 權重分析法評定了30%和50%兩個匹配度在蘋果香氣成分檢測中的可信度[19-20]。通過對‘俄矮二號’香氣組分與標準譜庫匹配度分別為≥30%和≥50%的化合物相對含量進行CRITIC 權重分析，結果見表1、2（兩種條件下所得相對含量相同的物質不計入）。由表可知，標準譜庫匹配度≥30%條件下‘俄矮二號’香氣組分的綜合指數=14%×丁酸乙酯指數+14%×異丁酸己酯指數+14%×丁酸己酯指數+30%×3,7,11-三甲基-(Z,E)-1,3,6,10-十二碳四烯指數+14%×己酸己酯指數+14%×2-甲基丁酸乙酯指數，結果為0.3。同理可得，標準譜庫匹配度≥50%為條件下結果為0.7。標準譜庫匹配度≥50%條件下，CRITIC 權重分析得分較高，故選用匹配度≥50%的檢測結果進行分析。

表1 化合物相對含量原始分析數據Table 1 Original analysis data of relative content of compounds

表2 CRITIC 權重計算結果Table 2 CRITIC weight calculation results

2.2 花牛蘋果主栽品種香氣組成成分分析

不同所屬族系的果實之間，香氣成分構成存在一定差異。如‘元帥’系和‘富士’系的果實風味較豐富，‘國光’系次之，‘金冠’系的果實風味豐富度最小[21]。因此，對果品香氣成分的深入分析，可為區別不同族系果實的鑒定方法提供一定依據。本研究選取‘俄矮二號’‘天汪一號’‘首紅’和‘栽培二號’4 個常見花牛蘋果栽培品種進行香氣成分的分析，選取標準譜庫匹配度≥50%的香氣化合物進行定性，共檢出22 種可揮發性成分，結果如表3 所示。

表3 花牛蘋果4 個主栽品種果實中揮發性成分匯總表Table 3 Summary of volatile components in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

由表3 可知，在匹配度≥50%條件下共檢出22 種香氣成分，其中，酯類物質21 種，烴類物質1 種。在‘俄矮二號’‘栽培二號’‘天汪一號’和‘首紅’4 個主栽品種中均檢出的香氣物質有12 種，分別為異戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯、乙酸己酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸己酯、己酸己酯、丁酸2-甲基丁酯、2-甲基丁酸丙酯和辛酸乙酯。

其中，‘俄矮二號’的香氣物質種類最多，共檢出20種，包含酯類物質19 種，烴類物質1 種?！准t’‘天汪一號’‘栽培二號’三個品種中分別檢出16、15、14 種香氣物質，全部為酯類化合物。

由圖1 可知，‘俄矮二號’所含香氣物質種類較多，其中同一香氣物質在不同品種中的相對含量有一定差別。如‘天汪一號’品種中異戊酸己酯占比高達49.75%，在其他品種中占比相對較少；2-甲基丁酸乙酯在‘首紅’中占比為42.95%，是‘栽培二號’中占比的2.8 倍；乙酸乙酯的占比相較于其他三種，在‘俄矮二號’中最高，占比17.54%，其次為‘首紅’中12.73%，‘栽培二號’11.66%和‘天汪一號’6.86%。由此結果可得出，在‘元帥’系花牛蘋果主栽品種中，都存在酯類物質較豐富的現象，這表明酯類物質對果實香氣組成起重要作用，與魏玉梅等[22]的研究結果一致。

圖1 花牛蘋果4 個主栽品種果實中香氣物質分布及相對含量Fig.1 Distribution and relative content of aroma substances in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

比較了4 個主栽品種果實中的香氣物質組成，結果如圖2 所示，由圖知，在4 個品種中酯類物質的相對含量占比均在99%以上。共有的12 種香氣物質中，異戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸乙酯的相對含量在4 品種中均較高，在‘俄矮二號’中分別為18.45%、31.61%和17.54%；在‘天汪一號’中分別為49.75%、26.40%和6.86%；在‘首紅’中分別為19.92%、42.95%和12.73%；在‘栽培二號’中分別為35.10%、14.96%和11.66%。

圖2 花牛蘋果4 個主栽品種果實中香氣物質組成Fig.2 Composition of aroma substances in fruits of four main cultivars of Huaniu apple

對以上結果分析可知，四個花牛蘋果品種都含有較高比重的異戊酸己酯香氣成分，這與路翔等[21]研究結果一致。證明此種香氣物質可作為區分于其他族系蘋果的特征香氣成分之一，為各族系蘋果提供通過香氣成分鑒定的手段，也為打造花牛蘋果品牌提供依據。

2.3 花牛蘋果主栽品種香氣特征成分分析

隨著天水地區花牛蘋果品種的不斷豐富，其銷售市場不斷擴大，品牌知名度不斷上升。但是現階段各品種之間沒有明確的品質鑒定與區分規程，使得農戶在種植與栽培的過程中，多憑經驗進行品種區分，存在較大的不確定性與誤差性，進而可能導致栽培基地產出的果品質量不統一，影響當地品牌的建立與自身市場競爭力。

為解決主栽花牛蘋果不同品種果實間不易區分的問題，本試驗對天水地區花牛蘋果主栽的品種進行了特征香氣成分分析。利用主成分分析方法，對4 個主栽花牛蘋果品種所測定的果實香氣成分數據進行分析，結果如圖3 所示。

圖3 花牛蘋果4 個主栽品種果實香氣成分PCA 分析（標準譜庫匹配度≥50%）Fig.3 PCA analysis of aroma components in fruits of four main apple cultivars (standard spectral library matching degree ≥50%)

由圖3 可知，按照標準譜庫匹配度≥50%條件下，PCA 分析提取出2 個主成分，PC1、PC2 累計貢獻率為82.00%，可有效代表原始數據。PC1 中癸酸乙酯、己酸己酯、2-甲基丁酸丙酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、丁酸2-甲基丁酯、乙酸丁酯、丁酸乙酯、正己酸乙酯相關系數較大。PC2 中乙酸己酯、乙酸乙酯、丁酸辛酯、異丁酸乙酯、3,7,11-三甲基-(Z,E)-1,3,6,10-十二碳四烯、己酸丙酯、2-甲基丁基乙酸酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸2-甲基丁酯、順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯相關系數較大。結果顯示4 個品種分別位于4 個象限中，且距離較遠，各種香氣物質的分布與品種形成一定聚類趨勢。其中，異戊酸己酯、2-甲基丁酸乙酯和乙酸乙酯在4 個品種中相對含量均較高，而在某一品種中相對含量遠高于其它品種的香氣物質可作為該品種的特征香氣物質，即‘俄矮二號’為乙酸乙酯（17.54%），‘天汪一號’為異戊酸己酯（49.75%）和異丁酸己酯（2.90%），‘首紅’為2-甲基丁酸乙酯（42.95%）。僅在某一品種中檢出（其它品種中未檢出） 的香氣物質亦可作為該品種的特征香氣物質，‘俄矮二號’為丁酸辛酯（0.24%）、異丁酸乙酯（0.04%）和己酸丙酯（0.06%）；‘首紅’為順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯（0.06%）；‘栽培二號’為乙酸丁酯（2.33%）。

3 結論

本文對GC-MS 標準譜庫篩選條件的可靠性進行了研究，將元帥系花牛蘋果主栽品種所共有和不同品種之間所有的香氣成分進行了分析鑒定。通過CRITIC 權重分析將標準譜庫匹配度≥50%設置為篩選條件更為合理。在此條件下，4 個花牛蘋果主栽品種共檢出香氣物質22 種，分別為酯類和烴類，其中12 種為4 個品種所共有，且酯類物質含量最豐富，均在99%以上。對4 個品種中香氣物質的相對含量進行主成分分析，得到‘俄矮二號’特征香氣成分為高豐度的乙酸乙酯和特異性香氣成分丁酸辛酯、異丁酸乙酯、己酸丙酯；‘天汪一號’的高豐度香氣成分為異戊酸己酯和異丁酸己酯；‘首紅’特征香氣成分為高豐度的2-甲基丁酸乙酯與特異性香氣成分順式-3-己烯醇2-甲基丁酸酯；‘栽培二號’中的特征香氣成分為特異性的香氣成分乙酸丁酯。由以上結果可知，不同品種花牛蘋果之間存在香氣成分構成差異，擁有各自對應于品種的特征香氣成分。如‘新紅星’品種的成熟果實中，2-甲基丁酸乙酯香氣物質能夠被檢出，這與本試驗新紅星分支下，‘首紅’品種的特征香氣物質分析結果能夠相互印證[23]。靳蘭等[24]得出‘元帥’完整果實的主要香氣成分為乙酸-2-甲基丁酯、乙酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸丁酯等，這與本試驗結果不同，可能與栽培方式、施肥條件、土壤元素等培育條件的影響有關。陶茹等[25]研究表明，套袋的栽培方式會使酯類香氣產生量顯著降低2.98 倍。因此，由于地理環境、土壤條件等因素使天水地區的元帥系蘋果產生特有的香氣物質，也構成了所屬于天水地區獨有的花牛蘋果品牌。本試驗通過分析甘肅天水地區不同主栽品種花牛蘋果果實香氣成分，對比了各品種之間所存在的香氣成分差異，得出不同品種的特征香氣成分。本研究確定的花牛蘋果各品種的特征香氣成分可作為地理標志農產品的判定依據之一，為花牛蘋果品質鑒定和品種鑒別提供可靠的技術支持，為建立花牛蘋果種質資源庫提供客觀依據。