苗藥組方熏蒸療法對家兔早期膝骨性關節炎模型的差異基因分析及聚類分析*

張力文，王興桂，李 春，龐 平

貴州中醫藥大學，貴州 花溪 550025

膝骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）作為骨科常見疾病，在臨床上主要見于40 歲以上人群，年齡越大，患病率越高，女性發病多于男性［1］。主要臨床表現為膝關節腫脹、疼痛、僵硬、畸形及關節活動障礙，嚴重者可出現膝關節內、外翻，導致行走困難，嚴重影響人們的生活質量。近年來人口的老齡化趨勢加劇，早期KOA 患者日益增多［2］。研究表明，慢性勞損、肥胖、遺傳、氣候、飲食、細胞因子異常及自身免疫反應等因素與早期KOA 的發病有密切聯系，其中遺傳因素是早期KOA 發病的最重要因素。同時，國內外眾多研究者認為基因變異是早期KOA 的發病的關鍵因素。申成凱等［3-4］發現白細胞介素1、轉化生長因子β1的基因變異可加重早期KOA 的患病風險。流行病學研究表明，KOA 影響因素是眾多的，但是影響KOA進展的關鍵因素是遺傳因素［5-7］?，F在基因表達方面的研究主要依靠基因芯片的檢測技術，治療KOA 的研究重點是找尋易感部位，因此運用基因芯片檢測技術篩選出的差異基因表達，可作為KOA 早診斷和靶向治療的生物標記物［8］。前期實驗表明，苗藥熏蒸療法可以改善早期KOA 的關節運動，同時具有很好的止痛作用，苗藥熏蒸療法主要是經皮直接作用，使熏蒸產生的藥氣通過皮膚黏膜滲入，是苗醫獨特的“以毒攻毒”治療方法，具有操作簡便、綠色、副作用小等特點。但是這種治療早期KOA 的外治療法的具體機制以及其在基因表達譜方面有何改變，目前尚不清楚，因此本研究的主要目的是探索苗藥熏蒸療法治療早期KOA 在基因表達譜方面的改變，以期探明其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3 月齡新西蘭兔40 只，雌雄各半，體質量（0.50±0.10）kg，由廣州醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCKK（黔）2018-0001。飼養條件：在室溫下標準育成飼料飼養，自由飲水，飲用干凈的自來水，飼養室溫度控制在24 ℃～25 ℃，相對濕度控制在7%左右。

1.2 實驗藥物經貴州中醫藥大學周漢華教授鑒定的貴州苗族熏蒸外用處方［9］，藥物組成：透骨香30 g，艾納香30 g，白龍須6 g，大血藤10 g，五香血藤10 g，土一枝蒿10 g，艾葉10 g 等。將上述藥物煎煮成68%～70%藥液后備用。

1.3 試劑及儀器HB-4000 型中藥熏蒸機（蘇州好博醫療器械有限公司）；SIM-E124 型制冰機（三洋）；Leica2135 型切片機（泰州市開發區鵬翔機械設備有限公司）；TXS-SP2 型激光共聚焦顯微鏡（德國LEICA 公司）；TRIzol（Invitrogen 公司）；Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix，批號：900433）；Ambion? WT Expression Kit※（Affymetrix，批號：4011974）；WT Terminal Labeling Kit：（Affymetrix，批號：900671）；4-20% TBE Gel、1.0，mm、12，well（Invitrogen，批號：EC62252）；SYBR Gold（目錄號：S-11494）；Molecular Probes10 bp DNA ladder（Invitrogen，批號：10821-015）；100 bp DNA ladder（Invit-rogen，批號：15628-019）；NeutrAvidin Biotin Binding Protein（Pierce Chemical，批號：31000）；Eukaryotic Hybridization Control Kit（Affymetrix，批號：900454）；Hybridization、Wash、and Stain Kit（Affymetrix，批號：901667）；Hybridization Module from Box 1（Affymetrix 5X WT Hyb Add1，批號：901618）；Wash Buffers A and B from Box2（Affymetrix，批號：901625）。

1.4 造模方法按照文獻［10］的造模方法：將含量為1.6%的木瓜蛋白酶0.5 mL 注入兔的右側膝關節腔內，隔3 天后再注射1 次，共2 次。造模成功后，隨機抽取2 只，通過觀察其關節外形變化、光鏡觀察及Mankin，s評分［11］鑒定是否造模成功。

1.5 分組及處理將40 只3 月齡新西蘭兔隨機分為空白組、模型組、苗藥熏蒸組、清水組，每組10 只?？瞻讓φ战M：普通飼料喂養，不造模，每天驅趕其不停運動20 min。模型對照組：普通飼料喂養，造模后每天驅趕其不停運動20 min。苗藥熏蒸組：普通飼料喂養，造模的第1 天就開始熏蒸治療，每天將提前煎好的藥液放于熏蒸器里，加熱到39～40 ℃時，開始熏蒸治療，每次10 min。清水熏蒸組：普通飼料喂養，造模的第1 天就開始熏蒸治療，每天將清水放于熏蒸器里，加熱到39～40 ℃時，開始熏蒸治療，每次10 min。當治療滿20 天后處死。

1.6 取材方法將上述處死后的兔右膝關節軟骨，用1%DEPC 水沖洗后，用切取l cm×l cm 全層軟骨，用低溫PBS 液反復沖洗后，置于凍存管內迅速放入液氮罐中。

1.7 觀察指標

1.7.1 軟骨的RNA 提取法 將取得的軟骨組織稱量后研磨成粉狀，然后放于含有Trizol 液的離心管中?？俁NA 的提取是參照異丙醇沉淀法［12］；純化按照試劑盒說明書來操作，最后置于-20 ℃中保存。

1.7.2 軟骨組織的基因表達譜的測定 采用異丙醇沉淀法提取total RNA，取2 μL 提取出的RNA，進行電泳，通過28S、18S 條帶的清晰度判斷RNA 的純度，當RNA 的吸光度值（A260/A280、A260/A230）和濃度是1.8～2.0 時，說明RNA 的純度高。然后行基因表達譜芯片檢測程序，所有的芯片檢測及數據匯總由北京博奧生物醫學科技有限公司完成。

1.8 統計學方法將基因芯片檢測獲得的數據，導入分析軟件，得到ratio值后，使用GeneAtlas?Workstation 將芯片的熒光掃描圖像保存成.ga.DAT文件，并進行數據預處理。用RMA算法預處理數據，并進行DEG 分析，然后將每個樣品的全基因表達，進行聚類分析，數據的分析由北京博奧生物醫學科技有限公司完成。

2 結果

2.1 軟骨組織的RNA 提取結果RNA 純度：A260/280≥1.70，RNA 總量：總量≥1 μg，符合實驗要求。RNA 完整性：RNA 樣品電泳條帶清晰，28S：18SrRNA條帶亮度大于或接近1∶1，質量符合實驗要求。見圖1，表1。

圖1 實驗組電泳圖

2.2 聚類分析結果每個組別的標本大體可歸為一類，每個標本重復性好，每個治療組與對照組的基因表達有各自特點，軟骨組織改變是KOA 發生發展的關鍵，且通過苗藥熏蒸治療后它的分子機制及基因表達發生特殊改變。見圖2。

圖2 實驗樣品的聚類分析結果（具體編號同電泳圖）

2.3 芯片雜交掃描結果各組熒光信號強度較高、背景均一，未見缺陷，符合基因芯片結果分析的標準。

2.4 芯片雜交結果分析散點圖結果模型對照組與空白對照組比較基因表達上調，差異顯著且數量最多，進一步分析得出苗藥熏蒸組與模型對照組相對清水熏蒸組與模型對照組比較，有差異的基因最顯著且數目最多。見圖3—5。

圖3 清水熏蒸組與模型對照組重疊的散點圖比較

圖4 苗藥熏蒸組與模型對照組重疊的散點圖比較

圖5 模型對照組與空白對照組重疊的散點圖比較

2.5 DEG總體分析結果

2.5.1 模型對照組與空白對照組重疊后差異基因 對兩個樣本分別進行差異基因的分析，進行重疊后鑒定出差異基因總數共23283個，其中827個基因表達差異顯著，392 個下調，435 個上調，大于2倍308個，大于3倍60個，大于4倍20個，大于5 倍18 個，大于6 倍7 個，大于7 倍12 個，大于8 倍4 個，大于10 倍1 個，大于11 倍2 個，大于13 倍1個，大于16倍1個，大于17倍1個。由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻，將目前已知學術界認同的影響KOA 發生發展相關的模型對照組顯著表達的基因進行簡單描述。見表2。

表2 模型對照組影響KOA發生發展顯著表達的基因

2.5.2 苗藥熏蒸組相對模型對照組重疊后差異基因 對兩個樣本分別進行差異基因的分析，進行重疊后鑒定出差異基因符合有效信號標準的基因總數共23283 個，與模型組相比較苗藥熏蒸組存在差異表達顯著的基因有208 個，96 個下調，112 個上調，大于2 倍87 個，大于3 倍10 個，大于4倍4 個，大于5 倍4 個，大于6 倍1 個，大于7 倍2個，大于9 倍1 個，大于12 倍1 個，大于20 倍1 個，大于24倍1個。由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻，將目前已知學術界認同的影響KOA 發生發展相關的苗藥熏蒸組顯著表達的基因簡單描述。見表3。

2.5.3 清水熏蒸組相對模型對照組重疊后差異基因 對兩個樣本進行差異基因分析，進行重疊后鑒定出符合有效信號標準的基因總數共23283個，其中有152 個基因表達顯著差異，93 個上調，59 個下調，大于2 倍63 個，大于3 倍18 個，大于4倍的有6 個，大于5 倍的有1 個，大于6 倍的有2個，大于9 倍的有1 個，大于11 倍的有1 個，大于19 倍的有1 個，由于目前研究兔子很多基因的功能和名稱等還不清楚，大量的查閱文獻，將目前已知學術界認同的影響KOA 發生發展相關的清水熏蒸組顯著表達的基因進行簡單描述，見表4。

表4 清水熏蒸組影響KOA發生發展顯著表達的基因

2.5.4 3 組重疊差異基因表達數目 通過上面描述，我們對三組重疊差異基因表達數目進行比較。見表5。

表5 3組差異基因統計表

3 討論

KOA 是中老年人群的常見病與多發病，女性發病率高于男性，臨床主要以膝關節腫脹、變形、疼痛、活動受限為主要臨床表現［13］。人體最重要的負重關節是膝關節，人體的行走、運動等功能的正常與否直接與膝關節息息相關，KOA 的發生會使人體活動受限，而且KOA 患者會有不同程度的疼痛，嚴重降低了患者的生活質量，導致患者長期缺乏鍛煉而發生其他疾病。目前KOA 的發病機制還不清楚，目前治療KOA 以西醫對癥治療為主，可以改善患者關節功能、緩解臨床癥狀，病情進展時時采取手術療法，但是治療的效果有限，費用昂貴、容易復發、副作用大［14］。

本研究采用的苗藥熏蒸療法是貴州地區治療KOA 最常用的治療方法，歷史悠久且應用基礎良好。我們在前期開展了相關的一系列實驗研究及臨床研究，證明本苗藥經驗方治療KOA 療效顯著。隨著現代醫學及分子生物的發展，相關研究表明對KOA的發生具有決定性作用的是遺傳因素［15-17］。因此通過研究苗藥經驗方治療KOA 的差異性基因的篩選和研究將為早期KOA 的診治、預防、診斷提供理論依據及參考?；蛐酒瑱z測技術融合了分子生物學、計算機信息技術等眾多學科技術，作為一項研究基因組前沿生物技術，具有多樣化、自動化、微型化、高通量及高集成等優點。

本研究發現：1）空白對照組與模型對照組差異表達基因有827 個，435 個上調，392 個下調，通過分析這些差異基因與早期KOA 軟骨組織的改變，得到一系列與KOA相關基因。有研究發現KOA的發生原因是關節軟骨的降解，這與MMPs 在滑膜組織中的顯著表達有關［18］。在本研究中，我們發現促進軟骨細胞外基質降解的基質金屬蛋白酶MMP14（NM-001082793）等基因上調，抑制軟骨細胞外基質降解的蛋白酶抑制劑TIMP4（NM-001195690）等基因下調，模型成功的關鍵與軟骨細胞外基質降解、軟骨細胞凋亡導致軟骨損傷有關。模型組中BCL2L1（NM-001082135）基因發生上調，該基因可促進軟骨細胞的凋亡，因此該基因的差異表達與本模型復制成功相關，同時在研究中我們還發現本實驗模型的復制成功與影響細胞增殖的核糖體蛋白類RPL22（ENSOCUT00000028925）、LOC100354714（XM-002718133）、LOC100352995（XM-002709326）等基因表達有關，因為在本研究中它們均發生了下調?？傊?，通過對模型對照組差異基因進行分析，發現本模型復制是成功的，且得出KOA 是一種多基因疾病。2）苗藥熏蒸組與模型對照組差異基因有208 個，有112 個上調，有96 個下調。通過整體分析這些差異基因與KOA 軟骨組織的改變，得到一系列與KOA表達相關的差異基因。我們發現，苗藥熏蒸療法可以促進細胞增殖KGF（NM-001195837）、微纖蛋白類MFAP5（ENSOCUT00000-002406）等上調，可以通過增強軟骨細胞的活性，抑制軟骨細胞的凋亡，從而延緩關節軟骨退變。同時本課題還發現苗藥熏蒸療法可以上調保護軟骨周圍組織不被過度的酶解，保證彈性蛋白酶發揮正常，這是通過被抑制的組織蛋白酶ECTSE（NM-001082244）實現的。與細胞免疫相關的中性粒細胞激活肽ENA-78（AF123437）基因、巨噬細胞清道夫受體MSR1（NM-001082248）基因等上調，和能量相關及內吞的肌聯蛋白TTN（Y18102）基因、整合素ITGB8（NM-001082304）等上調，調節炎性因子的趨化配體CCL14（ENSOCUT00000027247）等下調，苗藥熏蒸療法可以通過提高能量代謝、增加細胞免疫、抑制炎癥和促進內吞作用來延緩KOA 的發生發展。3）清水熏蒸組與模型對照組有152個差異基因，有93個上調，59個下調，通過分析我們得出，細胞免疫相關中性粒細胞激活肽ENA-78（AF123437）等上調，能量相關的輔肌動蛋白ACTN3（X62075）基因等上調，清水熏蒸法可以通過它的熱療法來提高能量代謝、增加細胞免疫等作用來緩解KOA關節軟骨的發生發展。4）通過研究我們發現苗藥熏蒸法與清水熏蒸法延緩早期KOA 的關節軟骨退變，但是苗藥熏蒸的差異基因更為顯著（＞20 倍的差異基因有2 個）：而與能量相關的MYL1（NM-001101713）基因上調（＞24 倍），苗藥熏蒸有208個基因發生顯著差異，清水熏蒸僅有152 個基因發生顯著差異。進一步分析這些DEG，苗藥熏蒸DEG顯著表達與早期KOA的發生發展密切相關，因此苗藥熏蒸療法延緩早期KOA 的發生發展可以通過它的藥療和熱療共同作用來實現，療效優于清水熏蒸法，今后我們將進一步探討起作用的“關鍵基因”。

綜上所述，通過基因芯片檢測技術篩選出與早期KOA發生發展相關的差異基因，發現早期KOA的發病是多基因的共同作用，進一步對這些基因進行分析，可以找到苗藥熏蒸療法治療KOA 的關鍵基因，為早期KOA的診治提供新方法、新思路。