兩種桑黃多糖的結構分析及其抗炎活性研究

劉利娜,王仁中,吳絲雨,金傳山,2

(1.安徽中醫藥大學,安徽 合肥 230012;2.中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室,安徽 合肥 230012)

桑黃始載于《神農本草經》,名曰“桑耳”,為桑黃孔菌屬真菌桑黃Sanghuangporussanghuang的子實體,分布于中國暖溫帶和溫帶多個省份以及韓國、日本和緬甸[1]。桑黃具有活血止血、化飲、止瀉之功效[2]?，F代藥理研究[3-5]表明,其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖等多種生物活性。由于生境和生長年限的制約,野生桑黃難以滿足市場的需求,人工培植的瓦尼桑黃S.vaninii和鮑姆桑黃S.baumii等已成為市場主要產品[6-7]。多糖是桑黃的主要活性物質,存在于子實體、菌絲體及發酵液中,在抗腫瘤、免疫調節、抗炎和抗氧化等方面表現出的生物活性使其成為研究和開發應用的熱點[8-10]。本實驗觀察了人工培育的瓦尼桑黃子實體中兩種酸性多糖分離純化過程,分析其結構特征,以及對以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的小鼠RAW264.7巨噬細胞中一氧化氮(nitric oxide,NO)及炎癥因子的影響,為桑黃資源的高效利用及桑黃多糖產品的開發提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器 F50型全波長酶標儀:美國Tecan公司;傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)儀:美國賽默飛世爾科技有限公司;SIGMA HD掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM):德國蔡司公司;CO2培養箱:美國Thermo公司;ICS5000離子色譜儀:美國Thermo公司;U3000高效液相色譜儀:美國Thermo公司;Optilab T-rEX示差檢測器和DAWN HELEOS Ⅱ激光散射檢測器:美國Wyatt 科技;凝膠排阻色譜柱Ohpak SB-805 HQ(8 mm×300 mm)、Ohpak SB-804 HQ(8 mm×300 mm)和Ohpak SB-803 HQ(8 mm×300 mm):日本昭和電工株式會社。

1.2 藥材與試劑 桑黃采自安徽省森湶谷藥業股份有限公司種植基地,經安徽中醫藥大學楊青山副教授鑒定為瓦尼桑黃Sanghuangporousvaninii(Pilát) L.W. Zhou &Y.C. Dai的子實體,標本保存于安徽中醫藥大學藥學院標本中心,標本號為AHTCM20220520。巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古羅糖醛酸標準品:美國Sigma-Aldrich化學有限公司;二乙氨基纖維素-52(diehlaminowthy, DEAE-52)(批號120D014)和Sephadex G-100(批號1018B021):北京索萊寶科技有限公司;RAW264.7細胞:中國科學院上海生科院細胞資源中心;胎牛血清(批號11011-8611):浙江天杭生物科技股份有限公司;DMEM高糖培養基(批號C11885500):上海玉博生物科技有限公司;LPS(批號S11060):上海源葉生物科技有限公司;NO試劑盒(批號S3090):上海碧云天生物技術有限公司;白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)ELISA試劑盒(批號110712001202681104)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)ELISA試劑盒(批號110712001104841104)和白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)ELISA試劑盒(批號110712001184421104):上海將來實業股份有限公司。

2 方法

2.1 桑黃多糖的制備 取瓦尼桑黃子實體1.0 kg,粉碎,加10倍量水,煎煮3次,每次2 h。合并提取液,減壓濃縮,加4倍量乙醇沉淀,放置過夜,抽濾。沉淀用蒸餾水溶解,醇沉,反復3次,干燥,獲得桑黃粗多糖(Sanghuang Polysaccharide, SHP)提取物。粗多糖提取物用Sevage法(氯仿—正丁醇4∶1)脫除蛋白,經3 500 Da截留量的透析袋透析48 h處理,袋內溶液濃縮,冷凍干燥得到SHP[11]。將SHP溶解于蒸餾水中,流經DEAE-52纖維素柱(1.6 cm×35 cm),分別用蒸餾水和不同濃度(0.1～0.5 mol/L)的NaCl溶液以1 mL/min流速洗脫,硫酸—苯酚法檢測,收集各高峰部分洗脫液,合并,濃縮,透析,冷凍干燥,得到0.1 mol/L和0.2 mol/L NaCl中獲得的兩個組分,分別命名為SHP-1和SHP-2。二者經Sephadex G-100 進一步純化,得到SHP-1-1和SHP-2-1。

2.2 桑黃多糖結構特征分析

2.2.1 化學組成分析 總多糖含量以葡萄糖對照品為對照,苯酚—硫酸法測定[12]。蛋白質含量以牛血清白蛋白為對照,考馬斯亮藍染色法測定[13]。糖醛酸含量測定時,以半乳糖醛酸對照品為對照,采用間羥基聯苯法測定[14]。

2.2.2 分子量的測定 取SHP-1-1和SHP-2-1樣品適量,精密稱定。置于2 mL容量瓶中,加0.1 mol/mL NaNO3水溶液(含0.02% NaN3,w/w)中,配制成終濃度為1 mg/mL的樣品溶液,經0.45 μm微孔濾膜濾過,備用。100 μL樣品溶液經凝膠排阻色譜[Ohpak SB-805 HQ(8 mm×300 mm)、Ohpak SB-804 HQ(8 mm×300 mm)和Ohpak SB-803 HQ(8 mm× 300 mm)串聯],以0.1 mol/mL NaNO3(含0.02% NaN3)水溶液為流動相,柱溫45 ℃,流速0.5 mL/min,等度洗脫,測定分子量。

2.2.3 單糖組成檢測 取適量SHP-1-1和SHP-2-1粉末,于5.0 mL三氟乙酸溶液(2 mol/L)溶解,120 ℃水解2 h。取出,氮氣吹干。加入甲醇溶解,氮氣吹干,重復3次,除去多余的酸。殘渣加入1 mL超純水溶解,經0.45 μm微孔濾膜過濾,備用。取單糖標準品適量,加去離子水配制成10 mg/mL單糖標準溶液貯備液,臨用時配制成不同濃度的混合標準品溶液,備用。經Thermo ICS5000離子色譜系統,電化學檢測器對單糖進行檢測。采用DionexTMCarboPacTMPA20色譜柱(150 mm×3.0 mm,10 μm),柱溫30 ℃;以流動相A(H2O)、流動相B(0.1 mol/L NaOH)、流動相C[0.1 mol/L NaOH)水溶液(含0.2 mol/L NaAc)]組成流動相進行梯度洗脫。洗脫條件:0～26 min,95%～85% A,5%～5% B;26～42 min,85%～85% A,5%～5% B;42～52 min,85%～60% A,5%～0% B;52～60 min,60%～95% A,0%～5% B,流速0.5 mL/min;進樣量為5 μL。

2.2.4 FT-IR分析 稱取4.0 mg的SHP-1-1和SHP-2-1干燥粉末,置于石英研缽,加入200 mg KBr,研勻,壓片。于FT-IR上,采集400～4 000 cm-1范圍內吸收數據。

2.2.5 SEM分析 將適量的SHP-1-1和SHP-2-1干燥粉末均勻平鋪在導電膠上,真空噴鍍儀在其表面噴一層導電膜,SEM觀察兩種多糖的表面微觀結構(加速電壓3.0 kV)。

2.3 抗炎活性研究

2.3.1 RAW264.7細胞活力測定 取對數生長期的RAW264.7細胞,以1×105/mL密度鋪于96孔板中培養24 h,棄去培養液,正常組加入100 μL DMEM培養基,給藥組加入100 μL DMEM溶解的多糖樣品溶液(濃度為10、15、50、100、200、400 μg/mL),每孔各加100 μL,重復6次。培養24 h后,每孔加10 μL CCK8,繼續培養2 h,取出,避光,于酶標儀450 nm波長處測定吸收度(A),計算細胞活力。細胞活力=[A(給藥組)-A(空白組)]/[A(正常組)-A(空白組)]×100%。

2.3.2 RAW264.7細胞中NO含量及炎癥細胞因子水平測定 取對數生長期的細胞,以1×105/mL鋪于96孔板中培養24 h,棄去培養液,正常組(高糖培養基)、模型組(培養基+0.5 μg/mL LPS溶液)和藥物組(培養基+0.5 μg/mL LPS溶液+培養基溶解的不同濃度多糖),每孔各加100 μL,設置6個復孔,培養24 h。將細胞培養液1 000 r/min離心5 min后收集上清。采用NO檢測試劑盒檢測NO含量。采用ELISA試劑盒檢測細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

3 結果與分析

3.1 分子量的測定 經凝膠滲透色譜—示差—多角度激光散器 (gelpermeation chromatography-refractive index-multi angle laser scattering, GPC-RI-MALS) 分析后,運用馬克·霍溫克方程計算每個組分對應的分子量。SHP-1-1的重均分子量(weight-average molecular weight,Mw)、數均分子量(number-average molecular weight, Mn)和均分子量(average molecular weight, Mz)分別為333.599、43.427、3 516.544 kDa,多分散系數(polydispersity, Mw/Mn)為7.682。SHP-1-1的Mw、Mn和Mz分別為563.032、59.641和4 205.062 kDa,Mw/Mn為9.44。二者的Mw/Mn表明桑黃酸性多糖是具有較寬分子量分布的高度異質多糖。SHP-1-1和SHP-2-1的分子構型圖均產生一條斜率小于1/3的線,表明SHP-1-1和SHP-2-1均是一種球形分子。見圖1、圖2。

注:絕對分子量分析圖中紅線表示多角度激光光散射信號;藍線表示差信號;黑線表示兩種信號擬合出的分子量

圖2 SHP-1-1(左)和SHP-2-1(右)的分子構型圖

3.2 單糖組成測定 將SHP-1-1和SHP-2-1用三氟乙酸水解,離子色譜法測定單糖組成。SHP-1-1由巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸組成,其摩爾比為11.48∶0.18∶0.28∶17.86∶27.71∶0.64∶11.75∶0.94;SHP-2-1由巖藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸組成,其摩爾比為0.73∶0.14∶0.32∶1.13∶14.96∶1.04∶3.79∶1.50。SHP-1-1主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖以及巖藻糖4種單糖組成,SHP-2-1主要由葡萄糖、甘露糖和甘露糖醛酸3種單糖組成。見表1。

表1 SHP-1-1和SHP-2-1單糖組成分析

圖3 SHP-1-1和SHP-2-1 的FT-IR光譜圖

3.4 SEM分析 SEM圖中可以觀察到,SHP-1-1呈不規則片狀,較為完整,表面相對光滑,部分凹凸不平,有孔洞,部分區域有不規則碎屑出現;SHP-2-1呈不規則碎片狀,相互堆積結果表面粗糙無孔洞。從放大5 000倍的SEM圖中可以觀察到,SHP-1-1表面形態為多孔網狀結構,且相互連接,可能與多糖分子間受力作用不同有關。SHP-2-1表面粗糙,有不規則結晶狀凸起,可能是多糖晶體結構。見圖4。

圖4 SHP-1-1和SHP-2-1 SEM圖

3.5 SHP-1-1和SHP-2-1抗炎活性研究

3.5.1 SHP-1-1和SHP-2-1對RAW264.7細胞活力的影響 SHP-1-1和SHP-2-1在10～400 μg/mL濃度范圍內未呈現明顯細胞毒活性;與對照組比較,SHP-1-1組和SHP-2-1組RAW264.7細胞活力顯著升高,且在10～100 μg/mL范圍內呈劑量依賴性。見圖5。

注:A.正常組;B.10 μg/mL組;C.25 μg/mL組;D.50 μg/mL組;E.100 μg/mL組;F.200 μg/mL組;G.400 μg/mL組;與正常組比較,*P<0.05

3.5.2 SHP-1-1和SHP-2-1對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放NO含量及炎癥細胞因子分泌的影響 SHP-2-1對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放的NO及分泌的炎癥細胞因子的半抑制濃度(50% inhibitory concentration, IC50)較SHP-1-1低,SHP-1-1能較好地抑制IL-6的分泌,SHP-2-1能較好地抑制NO的釋放和IL-1β的分泌。瓦尼桑黃中分離得到的兩種酸性多糖均能不同程度地抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞中NO釋放,降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平,減輕炎癥損傷,發揮抗炎作用。見圖6、表2。

表2 SHP-1-1和SHP-2-1對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放的NO及分泌的炎癥細胞因子的IC50值比較

注:A.正常組;B.模型組;C.25 μg/mL SHP-1-1組;D.50 μg/mL SHP-1-1組;E.100 μg/mL SHP-1-1組;F.25 μg/mL SHP-2-1組;G.50 μg/mL LPS+SHP-2-1組;H.100 μg/mL SHP-2-1組;與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

4 討論

本實驗選用LPS誘導RAW264.7巨噬細胞為炎癥模型,評價桑黃酸性多糖SHP-1-1和SHP-2-1的體外抗炎作用。SHP-1-1和SHP-2-1在安全濃度內均能降低LPS誘導RAW264.7巨噬細胞釋放的NO含量,抑制TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌,表現出良好的抗炎活性。