抗白堊病相關SNP位點C2587245T在意大利蜜蜂雄蜂幼蟲中的抗性鑒定

唐韶晗, 耿 龍, 武 尊, 曾照陽, 王子函, 梁立強,呂 洋,2, 許雪玲, 聶紅毅, 李志國,*, 蘇松坤,*

(1. 福建農林大學蜂學與生物醫藥學院, 福州 350002; 2. 黑龍江省農業科學院牡丹江分院, 牡丹江 157041)

蜜蜂是重要的傳粉媒介和農業作物高產的關鍵因素之一(Morse and Calderone, 2000),但蜜蜂的健康同時面臨著許多病原的威脅,例如蜜蜂病毒、真菌、寄生蟲等(Allen and Ball, 1996)。其中蜜蜂白堊病是蜜蜂最主要的病原之一,蜜蜂白堊病又稱美洲白堊病,是由寄生性病原引起的蜜蜂疾病,最早見于意大利蜜蜂Apismelliferaligustica(Aronstein and Murray, 2009),是由蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis感染蜜蜂幼蟲而引起的一種真菌性疾病。蜜蜂球囊菌是異宗配合的子囊菌,子囊菌的異性菌絲通過相互接觸產生孢子(P?ggeler, 2001; Heath, 2015)。球囊菌的孢子被幼蟲攝食后進入腸道,在腸道的圍食膜內萌發繼而菌絲穿透幼蟲體腔造成幼蟲死亡,幼蟲死亡后繼續脫水干燥形成白堊狀干尸(Spiltoir and Charles, 1955)。近年來,隨著蜜蜂球囊菌基因組測序工作的完成,人們對蜜蜂球囊菌的研究也從形態學、病理學和流行學逐漸深入到轉錄調控和免疫應答等研究領域(Ansarietal., 2017),研究人員一直致力于尋找與蜜蜂抗白堊病相關的基因和位點。一些研究表明,蜜蜂抗白堊病性狀可能與其免疫系統中的一些關鍵基因和單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)位點有關(劉元珍等, 2019),如Defensin和Toll受體基因家族,這些基因在蜜蜂的免疫應答中起著重要作用(Aronstein and Saldivar, 2005; Wuetal., 2020),這些研究結果為我們后續進一步從分子層面防治蜜蜂白堊病奠定了基礎(Qinetal., 2006)。

SNP是一種分子標記技術,具有準確度高、特異性強、重復性好、易檢測、微量高效等特點,廣泛應用于遺傳育種的各個領域(Duan and Zhang, 2015; Keaneetal., 2016)。SNP技術在蜜蜂育種領域同樣具有重要的應用,它可以幫助育種者更準確地選擇具有期望性狀的蜜蜂個體,從而加速育種進程、提高育種效率進而改進蜜蜂生產性狀相關的品質(Jonesetal., 2020)。此外該技術也可分析蜜蜂基因組數據可用性,并發展多種遺傳工具,通過SNP分析,育種者可以鑒定與抗病性相關的基因和位點,并選擇攜帶這些有利基因的個體進行繁殖,從而提高整體蜜蜂群體的抗病能力(Liuetal., 2016)。育種者還可以使用SNP技術對蜜蜂個體進行基因分型,選擇育種目標相關的基因進而培育具有高產、高抗病性、溫和性格等優良經濟性狀的蜜蜂品系。此外數量性狀位點(quantitative trait locus, QTL)的定位也可以識別與調控數量性狀基因有關的DNA區,以及現代基因組技術(如微陣列和RNA-seq)也可用于基因表達分析,這些技術都加深我們對于蜜蜂轉錄網絡這一問題的認識(Pageetal., 2016; Malankhanovaetal., 2017)。不僅如此,這類技術還可以方便地為育種項目尋找實用價值,并通過鎖定候選基因培養具抗寄生蟲、抗病原體的蜜蜂群體,從而快速地進行遺傳篩選,進而降低種群選擇的時間與費用。

隨著分子技術的發展,蜜蜂幼蟲抗白堊病能力相關基因位點篩選也較為完善。通過對不同蜂群進行病原接種,采用QTL技術,發現了幼蟲11號染色體可能與幼蟲抗白堊病具有顯著聯系(Hollowayetal., 2013),為幼蟲抗白堊病研究提供了方向。后續對抗病蜂群和易感病蜂群的工蜂幼蟲進行PCR和Sanger測序,從而篩選出和蜜蜂幼蟲抗白堊病相關的SNP位點,最后篩選出1個可以評估蜂群抗白堊病能力的SNP位點C2587245T(Liuetal., 2016),并建立了分子標記輔助選育抗白堊病蜂群的理論基礎。之后在SNP位點C2587245T的基礎上,通過轉錄組測序技術對相關差異工蜂幼蟲進行差異分析,篩選出抗白堊病相關的基因(Nieetal., 2020),為蜜蜂抗白堊病選育提供了研究基礎。前人關于蜜蜂抗病性狀相關的研究多以蜂王及工蜂為主,而雄蜂抗病能力的強弱對于蜂群抗病能力同樣有很大影響,因此,雄蜂健康與品質已經成為蜜蜂抗病育種中一個不可忽視的方面(Rangel and Fisher, 2019)。以蜂王為首的蜂群顯示了較強的抗病力與生產力,繼而提高整個蜂群腸道菌群與整體穩態(Nowaketal., 2021)。但因各個蜂群中缺少抗病性雄蜂,導致蜂王婚飛質量不高,造成種群內部遺傳多樣性不足,打破種群內部穩態,給養蜂人帶來經濟損失(Rangel and Fisher, 2019)。雄蜂與雌性蜜蜂之間的基因表達差異可能對抗病性產生影響,為驗證標記能否穩定地遺傳到雄蜂體內,有必要在蜂群外接種并培育在SNP位點C2587245T具有不同基因型的雄蜂并分析其抗病性。本研究結合雄蜂單倍體的生物學特性,通過培育SNP位點C2587245T純合的不同基因型的雄蜂從而成功地在雄蜂幼蟲中表現出該位點的抗病強度,為分子標記輔助育種直接用于生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試蟲

本研究所用意大利蜜蜂蜂群購買自福州市福清蜂場,蜂種為蜂強1號,飼養于福建農林大學蜂學與生物醫藥學院。

1.2 主要試劑及儀器

Chelex-100(索寶來,北京), 1 mol/L DTT, Proteinase K和PCR反應體系試劑盒(Vazyme公司,南京),BWS-5恒溫水槽水浴鍋(一恒,上海)、低溫高速離心機(Applied Biosysems,美國)、電泳儀(六一,北京)、全自動凝膠成像分析儀JS-690D型(培清,上海)、 PCR儀(Bio-Rad,美國)、 顯微鏡(Leica,德國)。

1.3 無傷害提取DNA

分別收集意大利蜜蜂蜂王蛻皮、1/2翅和1/3后足于1.5 mL離心管中,加入200 μL 5%的Chelex 100溶液、10 μL 20 mg/μL蛋白酶K和7 μL DTT溶液,觀察樣本位置,確保所有樣本都浸泡在溶液里,55 ℃金屬浴20 h,取出震蕩混勻,100 ℃金屬浴8 min,使蛋白酶變性,13 000 g離心3 min,吸取上清液,移至新的1.5 mL離心管中(蘇松坤等, 2008)。根據DNA質量,選擇最優的實驗部位,進行后續實驗。

1.4 蜜蜂球囊菌純化培養、鑒定和孢子液的制備

制作MY-20培養基(葡萄糖200 g,瓊脂粉20 g,蛋白胨4 g,酵母提取物3 g,使用無菌水定容至1 000 mL)。收集福建農林大學蜂場蜂箱巢門前的白堊病蟲尸,將用次氯酸鈉清洗過的白堊病蟲尸剪成小段,放于培養基上,轉移至33 ℃培養箱中。3 d后,將長出的白色菌絲用接種環接種在新的培養基上,進一步純化待鑒定菌,7～10 d后菌絲間隙就可長出黑色孢子。取部分待鑒定菌菌絲收集于1.5 mL離心管中,采取酚氯仿提取DNA(王雪研, 2020),用提取的DNA為模板進行PCR,蜜蜂球囊菌5.8S rRNA基因擴增引物:F:5′-TGTCTGTGCGGCTAGG TG-3′;R:5′-CCACTAGAAGTAAATGATGGTTAGA-3′(James and Skinner, 2005)。PCR反應體系: Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.2 μL, 2×Phanta Max Buffer 5 μL, dNTP Mix 0.2 μL, 正反向引物 (10 μmol/L)各0.4 μL, 水2.8 μL, 蜜蜂球囊菌DNA模板 1 μL。反應程序: 94 ℃預變性5 min; 94 ℃變性30 s, 64 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 35個循環; 72 ℃延伸8 min。委托福州博尚生物公司測序。將測序菌株命名為BE-1,將其與NCBI數據庫里進行5.8S rRNA基因序列比對。從GenBank數據庫中選取同源性較高的蜜蜂球囊菌菌株和不同親緣關系的菌株5.8S rRNA基因序列,共選取14種菌株5.8S rRNA基因序列,加上本實驗測定的BE-1,利用MEGA 7.0軟件構建基于5.8S rRNA基因序列的系統發育樹。

收集BE-1黑色孢子充分研磨破壁,10 000 g離心10 min,去上清液,重復3～5次,收集孢子懸浮液采用血球計數板統計孢子液濃度,將孢子液濃度稀釋至5×104個孢子/μL,4 ℃保存。收集綠豆大小的BE-1孢子沉淀于1.5 mL離心管中,加500 mL電鏡固定液室溫固定2 h,委托武漢塞維爾生物公司進行電鏡透射掃描,觀察其孢子形態結構。

1.5 SNP位點C2587245T為T/T和C/C基因型的蜂王的篩選和處女王的培養

SNP位點C2587245T引物:F: 5′-GTCAAGGTA TCACAAGCGTCA-3′;R: 5′-ATAGTTCGCCCACGAC CA-3′(Liuetal., 2016)。對意大利蜜蜂多個蜂群蜂王進行取樣,采用1.3節的方法提取蜂王DNA進行PCR,反應體系和程序同1.4節。PCR產物委托博尚公司測序,篩選出SNP位點為C/C和T/T基因型的蜂王。從篩選出的每個蜂群中收集40頭未出房的工蜂幼蟲,并對其進行SNP位點檢測,統計其后代C/C和T/T基因型占比。選取C/C和T/T基因型占比高的蜂王進行移蟲。在篩選出的蜂群中選取1-2日齡幼蟲,用移蟲針轉移到育王杯中。放入1群哺育力強的蜂群中,從放入蜂群的那一天算起10 d時用囚王籠罩住王臺,保護培育的處女王,避免出現部分蜂王提前出房而殺死其他未出房處女王的現象。等到處女王出房后,對培育出房的處女王進行基因型篩選,選擇C/C和T/T基因型處女王,用CO2迷暈處女王幾次,進而刺激處女王生產雄蜂卵。

1.6 雄蜂幼蟲的室內飼養和抗病性檢測

雄蜂幼蟲食物:66%蜂王漿,3%果糖,3%葡萄糖, 28%無菌水(Behrensetal., 2007)。溫度為34.5 ℃,相對濕度為97%左右。在C/C和T/T基因型處女王蜂群中用針式扣王籠將蜂王控制在一張新雄蜂脾上使之產卵,3 h后取下扣王籠,待蜂王爬到巢脾另一處后,再次進行限王產卵,3 h后重復以上步驟。移取雄蜂2日齡幼蟲至放有預熱好的50 μL食物的48孔板中,24 h后吸取殘留食物,并繼續飼喂雄蜂幼蟲50 μL新鮮食物,4日齡時,在24孔板中加入100 μL新鮮食物,把48孔板中的幼蟲個體轉移至24孔板中,繼續飼喂。后續每天同一時間飼喂150 μL新鮮食物,同時清理殘留食物。直至飼喂到7日齡時停止飼喂,幼蟲開始排泄時,則停止飼喂。記錄該飼養方法下雄蜂幼蟲的生長狀態和計算進入育蛹期的比例。

采用上述飼養方法,3日齡時實驗組T基因型雄蜂和C基因型雄蜂飼喂10 μL孢子濃度為5×104個孢子/μL的BE-1孢子懸液,對照組飼喂等量的無菌水,其他飼養條件與上述方法一致。接種BE-1當天為0 d,每24 h記錄1次發病幼蟲數量。每天觀察并記錄正常生長的幼蟲數量,計算存活率,及時清理發病幼蟲,避免發病幼蟲對存活幼蟲的影響。

1.7 數據分析

通過GramphPad Prism 8繪制生存曲線圖,同時使用SPSS 24.0t檢驗對T基因型和C基因型雄蜂幼蟲存活率進行進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 蜜蜂球囊菌的形態學鑒定和分子生物學鑒定結果

待測菌白色菌絲由3處接種點長出,蔓延至整個培養基,在兩部分菌絲交界處,長出黑色孢子(圖1: A),該結果符合球囊菌孢子需要雌株和雄株交配才能產生的特性(Aronstein and Holloway, 2013)。通過對分離純化的孢子進行掃描電子顯微鏡發現(圖1: B),孢子呈現出直徑3～4 μm×1.4～2 μm的橢圓形顆粒,該孢子的形狀大小與蜜蜂球囊菌孢子的形態大小相一致。

對PCR擴增獲得的490 bp的5.8S rRNA基因片段測序,將該序列提交至NCBI數據庫進行相似度分析,分離菌BE-1的5.8S rRNA基因與蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis5.8S rRNA基因序列一致性最高。系統發育樹結果顯示(圖2),BE-1 5.8S rRNA基因與參考蜜蜂球囊菌5.8S rRNA基因(GenBank登錄號: MN701962.1)的親緣關系最近。通過對分離菌的形態學鑒定和分子生物學鑒定可知,分離出來的菌株為蜜蜂球囊菌,可以用于后續實驗。

圖2 基于菌株BE-1和其他球囊屬菌株5.8S rRNA基因序列構建的系統發育樹

2.2 篩選到的SNP位點C2587245T C/C和T/T基因型蜂王和后代工蜂基因型占比

從每頭蜂王不同組織中提取的DNA,發現翅和后足提取的DNA質量最高且最穩定,翅相較于后足對蜂王影響最小,故從多頭蜂王翅DNA的PCR增產物中根據SNP位點C2587245T等位基因頻率,篩選出4頭C/C基因型蜂王和4頭T/T基因型蜂王,其后代工蜂測序結果顯示(圖3),4頭C/C基因型蜂王后代C/C基因型工蜂占比分別為40%, 30%, 0和20%。4頭T/T蜂王后代T/T工蜂占比分別為90%, 50%, 30%和100%。后續處女王的培養從后代純合度最高的幾頭蜂王中培育。

圖3 意大利蜜蜂蜂王SNP位點C2587245T 等位基因頻率測序

2.3 人工飼養的SNP位點C2587245T C和T基因型意大利蜜蜂雄蜂幼蟲及其抗病性

對照組在飼喂無菌水后6 d時雄蜂幼蟲的生長發育狀況良好,有95%的幼蟲個體完成排泄進入預蛹期,并無發病跡象(圖4: A, B),該飼養方法可以保證意大利蜜蜂雄蜂幼蟲在實驗室條件的正常生長發育。在處理組中,接種5×104個孢子/μL蜜蜂球囊菌懸液后3 d時T基因型雄蜂幼蟲已經開始出現死亡,部分個體長出白色菌絲(圖4: C),C基因型雄蜂幼蟲發育正常,沒有出現任何死亡和發病跡象(圖4: D)。在接種后6 d時T基因型雄蜂幼蟲已經大面積長出白色菌絲,只有個別幼蟲個體存活(圖4: E),但C基因型雄蜂幼蟲個別長出白色菌絲,部分幼蟲個體死亡(圖4: F),可以得出,C基因型雄蜂和T基因型雄蜂對抵抗白堊病的能力具有差異。

2.4 接種蜜蜂球囊菌后SNP位點C2587245T C和T基因型意大利蜜蜂雄蜂幼蟲存活率

根據圖5幼蟲存活率曲線可知,C和T基因型雄蜂幼蟲之間存活率從接種蜜蜂球囊菌后3 d時開始出現差異,隨后差異在接種后6 d時達到最大值。飼喂無菌水的對照組中,排除機械操作死亡的個體,其存活率一直為100%。C和T基因型雄蜂幼蟲3～10 d存活率具有極其顯著差異(P<0.0001),其中在接種后6 d時存活率差異達到最大,T基因型雄蜂幼蟲在接種后3 d時開始出現發病個體,發病占比為6.63%,接種后6 d時發病個體占比達到55.61%。相比之下,C基因型雄蜂幼蟲在接種后5 d時才開始出現發病個體,發病個體占比1.02%,到接種后6 d時其發病率為7.14%。

圖5 SNP位點C2587245T C和T基因型意大利蜜蜂雄蜂3日齡幼蟲接種蜜蜂球囊菌后存活率曲線

3 討論

目前多個物種都已經開發出無傷害提取DNA的技術,可以確保不損傷個體的前提下,獲取該個體的DNA,進行后續實驗。在螺類上,潘賢輝等(2022)開發了一種無傷害提取螺類DNA的方法,這種方法通過使用一種特殊的化學試劑,將DNA從外殼表面或者體液中提取出來,而不需要破壞細胞膜;在甲螨上,陳燕南等(2022)結合了試劑盒DNA提取法,提出一套針對甲螨無形態損傷的高效DNA提取方法;而高艷和卜云(2014)結合自行配制的試劑和商業化試劑盒, 以彈尾綱(Collembola)、雙尾綱(Diplura)和原尾綱(Protura)3類微小節肢動物為實驗材料, 摸索出一種可望在微小節肢動物中推廣的無形態損傷的DNA提取方法;在克氏原鰲蝦上,陸超平和馬源潮(2018)通過裂解液和蛋白酶K放入粘液里水浴裂解細胞的方式快速有效的獲取克氏原螯蝦DNA,不受蛋白質的污染。本研究采取的無傷害提取活體蜜蜂DNA的方法可以在不傷害蜜蜂的情況下提取高質量的蜂王和雄蜂的DNA。蜂王在其婚飛歸巢后,幾乎不會再出蜂巢活動,所以在獲取蜂王1/3翅后,不會影響蜂王的正?；顒?。在分子輔助選育的過程中,提取蜜蜂DNA用于篩選特定基因型的蜜蜂是必不可少的環節,對于育種者來說,具有優良性狀的蜜蜂是很珍貴的,所以該方法對于在不影響蜜蜂生活的前提下來篩選出需要的特定基因型的蜂群至關重要。

從對照組的幼蟲生長狀況可以看出,本研究采用的雄蜂飼養技術滿足雄蜂幼蟲的正常生長條件,可以使95%的雄蜂幼蟲進入育蛹期,該方法可以用于實驗室內雄蜂幼蟲的飼養方法。目前相比較于工蜂的人工飼養方法,幾乎沒有關于雄蜂幼蟲的飼養方法,而雄蜂和工蜂的生物學差異,致使很難通過工蜂的飼養條件來飼養雄蜂,這也從根本上阻礙了雄蜂的相關研究,本研究的飼養方法為后續雄蜂幼蟲的相關實驗提供了研究基礎。此外,接種后的4-10 d時C基因型雄蜂幼蟲和T基因型雄蜂幼蟲之間的存活率差異都為極其顯著,然而在接種后6 d時差異達到最大值(圖5)。T基因型雄蜂幼蟲在接種后3 d時開始出現發病個體,發病占比為6.63%,接種后6 d時發病個體占比達到55.61%。相比之下,C基因型雄蜂幼蟲在接種后5 d時才開始出現發病個體,發病個體為1.02%,到接種后6 d時其發病率為7.14%。這說明在該SNP位點差異的雄蜂在抗白堊病的能力上確實存在顯著的差異。雄蜂在蜂群中承擔著與處女蜂王交尾的作用。相對于工蜂和蜂王,雖然雄蜂在蜂群中的數量較少,產生的直接經濟價值較少,且其生命周期較短。進而造成雄蜂的抗病性研究相對較少的現象,大部分關注點還是在工蜂和蜂王的抗病性研究上。然而,雄蜂的健康狀況對整個蜂群的生存和繁殖至關重要。雄蜂由于其具有單倍體、可以自由進出其他蜂群等特點,相比于工蜂和蜂王而言,更容易受到病原體感染,如狄斯瓦螨、球囊菌等。在被病原侵染后,雄蜂在生理和基因表達方面可能與其他蜜蜂個體有所不同。本研究為日后雄蜂幼蟲的人工飼養提供了方法基礎并為后續培育抗白堊病蜂群中雄蜂的選擇提供了依據。

隨著蜜蜂抗病育種的發展,分子標記輔助已經成為目前培育高產抗病蜂種的研究重點,目前在抗螨、微孢子蟲、白堊病和美洲幼蟲腐臭病等方面都已經篩選出許多QTL(Behrens Detal., 2011, 2014; Hollowayetal., 2013; Huangetal., 2014),但由于小樣本作圖QTL區間過大,且數量性狀受環境影響過大(Würschum and Kraft, 2014),可能會導致QTL的檢測和對QTL效應評估發生偏離,許多檢測出來的位點,在一個群體或者家系中定位到的QTL可能不適用于另一個家系或者群體。因此QTL的驗證和鑒定時非常重要。研究人員Holloway等(2013)開展了一項研究,探究蜜蜂幼蟲的抗白堊病性狀與SNP位點之間的關系,發現蜜蜂幼蟲第2和11號染色體上的SNP位點與抗病性狀有顯著關聯,這項研究為蜜蜂抗白堊病的分子輔助選育提供了基礎。2014年通過重測序技術篩選出蜜蜂中特有的1 620個與抗白堊病相關的SNP位點,這些篩選出來的SNP位點有680個位點位于編碼區,其中在蜜蜂第11號染色體上有118個SNP位點,第2號染色體上有52個SNP位點(晏勵民, 2014)。之后劉元珍等通過篩選出了抗病幼蟲個體和易感病幼蟲個體,得到了一個能夠評估蜂群抗白堊病能力的SNP位點C2587245T(Liuetal., 2016)。該標記位于MRJP5基因的第2個內含子區域內。在抗白堊病蜂群中,C等位基因頻率顯著高于易感病蜂群,且具有高C位點頻率的蜂群白堊病發病率較低。王雪妍(2020)在該SNP位點C2587245T基礎上,對C/C基因型工蜂和T/T基因型工蜂進行了轉錄組測序,篩選西方蜜蜂工蜂抗白堊病的相關基因。本研究在SNP位點C2587245T的基礎上,利用雄蜂單倍純合體的生物學特性,進行白堊病抗性實驗,相比其他SNP位點的驗證而言,增加了活體雄蜂幼蟲的抗病性實驗,進一步驗證該SNP位點的遺傳穩定性和抗病性。結果證明該SNP位點C2587245T,有助于增加蜜蜂種群的整體抗病能力,降低白堊病等疾病的發生率。通過培育抗性強的蜜蜂品種能夠減少疾病給蜜蜂業帶來的經濟損失,提高蜜蜂產品的產量和品質。并且培育抗病性強的蜜蜂品種有助于減少對化學藥物的依賴,降低對蜜蜂和環境的負面影響。

在本研究中發現,感染蜜蜂球囊菌的意大利蜜蜂C和T基因型雄蜂幼蟲在發病時間和發病癥狀等方面具有極其顯著的差異(圖4),對于意大利蜜蜂雄蜂幼蟲中抗白堊病相關SNP位點的抗性鑒定研究,能夠揭示該位點的差異與抗白堊病之間的相關性。通過確定這種關聯,我們可以更好地了解這個位點的差異對蜜蜂免疫系統的影響,不僅如此,通過抗白堊病相關SNP位點的抗性鑒定研究還能夠幫助我們更好地了解雄蜂幼蟲免疫系統的免疫機制,并為培育更抗病的蜜蜂品種提供重要的信息和指導。這為后續雄蜂轉錄組測序的差異樣本選擇提供了選擇基礎。也為后續通過轉錄組測序,篩選出相關免疫的差異基因;為探究雄蜂和工蜂在免疫相關基因表達方面的差異提供基礎。此SNP位點C2587245T在蜜蜂抗白堊病抗性機制中具體發揮的作用有待于后續通過RNAi和CRISP/Cas9等技術手段進一步探究。