辣椒離體培養及再生體系的建立

李浩宇，賈利，宋婷婷，汪勝，張于，方凌，張其安，嚴從生，隋益虎，江海坤*

〔1 安徽科技學院，安徽鳳陽 233100；2 安徽省農業科學院園藝研究所，園藝作物種質創制及生理生態安徽省重點實驗室，農業農村部園藝作物種質創制與利用重點實驗室（部省共建），安徽合肥 230031〕

辣椒（CapsicumannuumL.）為茄科一年生或有限多年生草本植物，原產于中南美洲熱帶地區，在亞洲、歐洲等地廣泛栽培。辣椒含有豐富的VC、β-胡蘿卜素、葉酸等成分，含有的辣椒素還具有抗炎抗氧化作用，深受廣大消費者喜愛（朱麗等，2023）。

目前，辣椒組織培養已經通過子葉（楊博智等，2022）、上胚軸（鐘源源 等，2019）、下胚軸（Won et al.，2021）、帶柄子葉（徐建中 等，2015）、 莖尖、 花藥（ 張天翔 等，2020）、Flamingo-bill（高玉堯 等，2014）等組織獲得再生植株。Kim 和Lim（2019）從辣椒CM334 和甜椒Dempsey 的子葉上成功誘導出白色和淡黃色的愈傷組織，并且能夠增殖，建立了葉源性愈傷組織形成的條件，最終應用基因組編輯工具來提高辣椒的品質。O?uz 等（2021）第一次報道了使用根外節為外植體，在3 種茄科作物（辣椒、番茄、茄子）上比較了3 種細胞分裂素〔BAP、TDZ（苯基噻二唑基脲）、GA3（赤霉素）〕對芽再生能力的影響。Won 等（2021）選取辣椒幼苗第一片葉、子葉和下胚軸3 種外植體，用含8 mol · L-16-BA（6-芐基腺嘌呤）和6 mol · L-1IAA（吲哚乙酸）的不定芽誘導培養基（SIM）誘導外植體產生芽，誘導率分別為69.8%、25.5%和19.5%。

目前在國內外辣椒組織培養成功的報道中，普遍存在不定芽伸長困難、分化率低、培養周期長等問題，限制了辣椒基因工程的發展。本試驗采用子葉、Flamingo-bill 和下胚軸為外植體，對影響辣椒離體再生的多個因素進行探討，旨在建立辣椒高效離體再生體系，為進一步開展辣椒遺傳轉化奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試5 種基因型不同的辣椒材料均由安徽省農業科學院園藝研究所提供，代號分別為綠皮羊角椒9931、綠皮燈籠椒WJ-10、綠皮朝天椒22-33、紫皮燈籠椒H18 和紫皮朝天椒M13。試驗于2022 年在安徽省農業科學院園藝研究所進行。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 選取顆粒飽滿、色澤鮮艷的種子，先用溫水浸泡6～8 h，75%酒精消毒1 min，無菌水清洗3 次，再用2.5% NaClO 消毒30 min，無菌水清洗8～10 次后，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS 固體培養基（4.74 g · L-1MS 粉 + 30 g · L-1蔗糖 + 8 g · L-1瓊脂）中。溫度27～28 ℃，暗培養至種子露白，再置于光照下培養，光照強度1 600～1 800 lx，溫度24～26 ℃，培養無菌苗。

1.2.2 不定芽的誘導和分化 選取不同苗齡的無菌苗，制備Flamingo-bill 外植體：將無菌苗的一側子葉從葉柄基部連同頂芽及周圍分生組織全部切去，留下另一側子葉與下胚軸、胚根作為一個外植體。Flamingo-bill 切下來的一片子葉用于制備子葉外植體（0.5 cm × 0.5 cm），將Flamingo-bill 外植體、子葉外植體和下胚軸（切去胚根和上部，切成1 cm的小段）接種于MS 添加不同激素（6-BA 為1、3、5、6 mol · L-1，IAA 為0.3、0.5、1.0 mol · L-1）配比的誘導培養基上。每個處理30 個外植體，3次重復，每2 周繼代1 次，培養條件同1.2.1，30 d后統計不定芽分化率。

不定芽分化率 = （分化外植體數/接種外植體數）× 100%

1.2.3 不定芽伸長 將分化出不定芽的外植體接種至MS 添加不同激素（6-BA 為1、2、3 mol · L-1，IAA 為2 mol · L-1，GA3為0、0.5、1.0、1.5 mol · L-1）配比的伸長培養基上，每2 周繼代1 次，培養條件同1.2.1，30 d 后統計伸長率。

伸長率 = （伸長不定芽數/接種發生分化外植體數）× 100%

1.2.4 不定芽生根 將伸長的不定芽從母體基部切除，接種于MS 添加不同濃度NAA（0、0.1、0.3、0.5 mol · L-1）的生根培養基上，20 d 后觀察不定芽生根情況，統計生根率。

生根率 = （生根不定芽數/接種不定芽數）× 100%

當再生苗長至10～15 cm 時即可煉苗移栽。先在組培室內開瓶煉苗2 d，再放至室外煉苗2 d，之后沖洗干凈根部的培養基，移栽至營養土中，待緩苗過后移栽至溫室管理直至開花結果。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 軟件統計和處理數據。

2 結果與分析

2.1 苗齡對辣椒不定芽分化的影響

不同基因型不同苗齡的Flamingo-bill 外植體的不定芽分化有著較大差異。由圖1 可知，隨著苗齡的增加，不定芽分化率呈現先升高后降低的趨勢，苗齡10 d 時，Flamingo-bill 外植體分化率最高，達81.4%～91.1%；苗齡14 d 時，不定芽分化率最低為61.5%，最高為69.4%；苗齡大于14 d，不定芽分化率大幅下降；苗齡16 d 時，不定芽分化率最低僅為48.8%，且多數只形成愈傷組織。由此得出，制備Flamingo-bill 外植體最適苗齡為10 d。

圖1 苗齡對辣椒不定芽分化的影響

2.2 不同外植體和激素配比對辣椒不定芽分化率的影響

將5 種基因型辣椒的Flamingo-bill 和子葉外植體接種到添加不同濃度6-BA 和IAA 組合的MS 分化培養基上（表1），培養1 周左右，在其切口處開始形成愈傷組織，2 周左右開始形成白色松軟（圖2-a）、綠色緊實（圖2-b）或紫色緊實（圖2-c）的愈傷組織，4 周左右分化形成不定芽。

圖2 子葉再生過程中不同愈傷組織

從表1 還可以看出，在6-BA 濃度為1～6 mol ·L-1、IAA 為0.3～1.0 mol · L-1范圍內，5 種基因型辣椒外植體的不定芽分化率均隨著激素濃度的升高而升高，其中以綠皮羊角椒9931 在6-BA、IAA 濃度分別為6.0 mol · L-1和1.0 mol · L-1時最高（圖3、4），Flamingo-bill 和子葉的不定芽分化率分別達到100.0%和86.7%。

圖3 9931 的Flamingo-bill 離體再生情況

圖4 9931 的子葉離體再生情況

同時，不同基因型辣椒不定芽分化率也有較大差異，綠皮辣椒9931、WJ-10、22-33 的Flamingobill 和子葉不定芽分化率最高分別為100.0%、90.0%、96.7% 和86.7%、73.3%、80.0%，紫皮辣椒H18 和M13 Flamingo-bill 不定芽分化率最高均為100.0%，但子葉外植體均沒有不定芽分化，只形成紫色緊實的愈傷組織（圖2），后續采用ZT（玉米素）和IAA 激素組合也沒有誘導出不定芽。5 種基因型的辣椒下胚軸均沒有誘導出不定芽，且下胚軸容易誘導形成不定根。試驗過程中發現子葉和下胚軸外植體容易發生褐化，但Flamingo-bill 外植體未出現該現象。在培養基中添加了5.0 mol · L-1的AgNO3后，褐化現象得到明顯改善。綜合試驗結果，選用9931 進行下一步不定芽伸長和生根工作。

2.3 不同激素配比對辣椒不定芽伸長的影響

由子葉外植體誘導分化出的不定芽呈叢生狀，多數為葉狀體，不定芽較難分辨，因此將叢生芽連同愈傷組織一同移至伸長培養基誘導伸長。結果表明（表2），Flamingo-bill 外植體不定芽伸長率隨著GA3濃度升高不斷增加，在不添加GA3的條件下仍達到22.2%。將子葉產生的不定芽轉至較低濃度6-BA 的培養基上，伸長率為僅4.4%；在添加GA3的培養基上，配合6-BA和IAA能有效伸長不定芽，GA3濃度為1.5 mol · L-1時，與3.0 mol · L-1的6-BA和2.0 mol · L-1的IAA 配合使用，不定芽伸長效果最好，子葉和Flamingo-bill 不定芽伸長率分別達到30.0%和66.7%。由此得出辣椒9931 不定芽最優伸長培養基配方為：MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3。

表2 不同激素配比對辣椒不定芽伸長的影響

2.4 不同NAA 濃度對辣椒不定芽生根的影響

試驗過程中發現9931 的Flamingo-bill 外植體生根較容易，在不添加任何激素的MS 培養基上，20 d 就可生根，生根率為100.0%。由子葉外植體形成的不定芽，在低濃度NAA 培養基下，根系生長緩慢，不定根瘦弱短細，多數為雞爪根（圖5-a、b），且移栽較難成活，NAA 濃度為0.3～0.5 mol · L-1時，不定根生長正常，主根粗壯，須根較多（圖5-c、d），移栽成活率為100.0%（表3）。由此得出最適子葉生根培養基配方為：MS + 0.5 mol · L-1NAA。

表3 不同濃度NAA 對辣椒不定芽生根的影響

圖5 添加不同濃度NAA 對不定芽生根的影響

3 討論

3.1 苗齡對辣椒不定芽分化的影響

在外植體制備時，不同苗齡階段所獲取的外植體具有不同的分化能力。以子葉為外植體時，生長周期過短，兩片子葉尚未平展，切取時不易操作；培養周期過長，植株生長消耗大量養分，同時會降低不定芽的分化能力。以Flamingo-bill 為外植體時，生長周期過短，莖尖生長點還未發育完全，制備時無法完全切除，從而導致后期遺傳轉化時出現假陽性植株；培養周期過長，植株生長消耗大量養分，長勢太快，不易操作且不定芽分化率也大大降低。試驗過程中發現，不同基因型的辣椒無菌苗生長也有較大差異，這可能與不同品種的發育快慢有關（蔡文，2018）。李偉等（2014）研究發現，不同苗齡的朝天椒子葉外植體，其芽分化率差別較大，隨著子葉外植體苗齡的增大，不定芽分化率呈先增大后減小的趨勢。子葉誘導、分化能力以苗齡14 d 時最強，且能不經愈傷而直接誘導形成不定芽。本試驗采用苗齡10 d 的幼苗制備外植體時，不定芽分化率較高，再生效果較好。

3.2 不同激素配比對辣椒不定芽分化的影響

影響辣椒離體再生的因素有多個方面，首先，不定芽的誘導和分化起著關鍵作用；其次，不定芽的伸長是離體再生過程中的重難點。多數研究認為6-BA、IAA 等激素對芽分化有誘導作用。高藝等（2021）用5.0～9.0 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1IAA 誘導分化，子葉的分化率高達100%，用5.0～9.0 mol · L-16-BA 與3.0～9.0 mol · L-1ZT 配比組合，離體子葉再生形成的葉狀體大部分呈玫瑰花瓣狀，少部分呈正常長條形，且生長速度較快。鐘源源等（2019）發現NAA 與6-BA 相配合可協同促進不定芽分化，通過優化試驗得到高辣度辣椒不定芽分化最優的培養基組合為MS + 2.5 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1NAA + 5 mol · L-1AgNO3，平均誘導率達93.3%。張根蓮等（2019）以子葉和下胚軸為外植體，在添加1.0 mol · L-1IAA + 5.0 mol ·L-16-BA 的基礎上再添加2.0 mol · L-1ZT，可加快誘導外植體的分化，但形成的葉狀體呈簇狀生長，后期導致不定芽伸長困難，由此說明ZT 對不定芽分化無明顯促進作用。覃芳（2016）認為最適合誘導芽的植物生長調節劑組合是3 mol · L-16-BA + 0.8 mol · L-1NAA。由此可見，較高濃度的6-BA（3～6 mol · L-1）在辣椒不定芽誘導分化過程中起著重要作用。本試驗采用6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol · L-1IAA 誘導再生芽分化，可得到80%以上的分化率。此外，蔡文（2018）以辣椒59 號的子葉、帶柄子葉、下胚軸和Flamingo-bill 為外植體，發現Flamingobill 外植體不定芽分化率最高（85%），子葉和帶柄子葉容易形成簇狀芽，下胚軸容易出現生根現象，后期莖伸長培養困難，這與本試驗過程中遇到的問題相似。

3.3 不同外植體對辣椒不定芽誘導率的影響

近年來辣椒離體再生所用的外植體大致為子葉、帶柄子葉、上胚軸、下胚軸、莖尖、真葉和Flamingo-bill，不同外植體的不定芽誘導率差異較大。王佳偉（2022）以觀賞辣椒子葉、帶柄子葉、下胚軸為外植體，篩選出最佳外植體類型為帶柄子葉，愈傷組織誘導能力強弱依次為帶柄子葉 ＞ 子葉 ＞ 下胚軸?？佃ぃ?013）研究發現3 種外植體的分化能力從強到弱依次為Flamingo-bill ＞ 下胚軸 ＞ 帶柄子葉。羅紅萍（2010）和蔡文（2018）認為分化能力從強到弱依次為Flamingo-bill ＞ 帶柄子葉 ＞ 子葉。曹艷玲（2009）和徐建中等（2015）研究發現，不同外植體芽分化率呈現帶柄子葉 ＞子葉塊 ＞ 下胚軸。本試驗中，不定芽分化率呈現Flamingo-bill ＞ 子葉 ＞ 下胚軸，由于Flamingobill 保留了一片子葉和胚根，極大程度減少了外植體的損傷，同時能夠產生大量的營養物質和生長激素，能夠保證不定芽的形成，而子葉外植體容易形成簇狀芽，較難伸長，下胚軸容易出現生根現象，因此外植體的選擇對不定芽誘導有至關重要的影響。

3.4 不同激素配比對辣椒不定芽伸長的影響

不定芽伸長是離體再生的關鍵，但多數研究發現辣椒不定芽伸長尤為困難。大多數學者認為在伸長培養基中加入GA3可以促進不定芽伸長，同時通過降低6-BA 濃度、增加IAA 濃度對不定芽伸長效果也有一定影響。Gammoudi 等（2018）研究發現用GA3處理辣椒8 號，子葉誘導率為33.5%，下胚軸誘導率為62.6%。徐建中等（2015）和臧順（2014）認為在MS 培養基中添加2.0 mol · L-1GA3促進芽伸長的效果最好，當GA3水平達到4.0 mol ·L-1時，不定芽伸長率反而降低，伸長的不定芽細長瘦弱，不易生長為正常植株，可能是GA3在體內累積過多引起的。本試驗中，在含有6-BA、IAA 和GA3組合中，不定芽伸長率隨著6-BA、GA3濃度升高而增加，在3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol · L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3時，不定芽伸長率最高。同時，不同外植體的不定芽伸長效果有明顯差異，Flamingo-bill 外植體不定芽伸長率最高達到66.7%，明顯大于子葉外植體不定芽伸長率，這可能是由于Flamingo-bill 外植體留下的子葉與胚根能產生大量的營養物質和生長調節激素，而頂端分生組織也會產生大量的調節激素，從而有利于愈傷組織分化和促進不定芽形成（高玉堯 等，2014）。

3.5 不同激素配比對辣椒不定芽生根的影響

辣椒不定芽生根相對容易，本試驗發現，Flamingo-bill 外植體在不添加任何激素的MS 培養基中，不定芽能正常生根。子葉外植體形成的不定芽在添加少量的NAA 或者搭配IAA 使用的MS 培養基中能得到較好的生根效果。

4 結論

本試驗建立了綠皮羊角椒9931 Flamingo-bill和子葉外植體的高效離體再生體系，其不定芽分化的最適培養基為MS + 6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol ·L-1IAA + 5.0 mol · L-1AgNO3，Flamingo-bill 和子葉誘導率分別為100.0%和86.7%；不定芽伸長的最適培養基為MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3，Flamingo-bill 和子葉不定芽伸長率分別為66.7%和30.0%；不定芽生根的最適培養基為MS + 0.5 mol ·L-1NAA，生根率均為100.0%。