豬去氧膽酸對脂肪變性肝細胞活性的影響及其機制

汪遠遠， 鄒 艷， 劉朝霞， 陽學風

1 南華大學附屬南華醫院 a. 消化內科， b. 手足外科， 湖南 衡陽 421002

2 湖南省代謝相關脂肪性肝病臨床研究中心， 湖南 衡陽 421002

目前，代謝相關脂肪性肝?。╩etabolism-associated fatty liver disease，MAFLD）已成為我國慢性肝病的第一大原因，患病率高達30%，且預計仍會進一步升高［1］。MAFLD 與代謝性疾病發病密切相關，如肥胖、高血壓、2型糖尿病以及心血管疾病等［2］。

脂質代謝異常是MAFLD 的關鍵問題之一［3］，肝臟的脂肪酸大多來自脂肪中甘油三酯分解，通過血液循環至肝臟吸收［4］。膽汁酸由膽固醇代謝產生，可以通過激活肝臟內的法尼醇X 受體（farnesoid X receptor，FXR），調節脂肪酸合成、氧化和運輸等過程，從而影響脂肪代謝［5］。筆者預實驗通過質譜分析發現豬去氧膽酸（hyodeoxycholic acid，HDCA）在MAFLD 患者的血液和糞便樣本中含量明顯高于健康人，但HDCA 在MAFLD 發病中的作用及機制尚不清楚。本課題組采用棕櫚酸（palmitic acid， PA）誘導L02 細胞構建脂肪變性肝細胞模型，分析HDCA 對脂肪變性肝細胞活性的影響；并構建FXR 低表達肝細胞株，研究HDCA 是否通過FXRPI3K/AKT 途徑對脂肪變性肝細胞的活性發揮作用，從而探討HDCA 在MAFLD 發生發展中的作用及其機制，為MAFLD的預防和治療提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 L02 細胞（HL7702）購自上海佰曄生物科技公司。DMEM 高糖完全培養基包含10%胎牛血清（FBS）和1%青鏈霉素混合液（×100），L02 細胞接種于25 cm2底面積的培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱內培養。0.2 mmol/L的PA誘導L02細胞脂肪變性。

1.2 PA 的配置 取25.642 mg PA 加入至1 mL 無水乙醇中水浴加熱，配得濃度為100 mmol/L 的PA 溶液①。另取50 mg 無脂肪酸牛血清白蛋白（BSA）加入至10 mL 1640 培養基中并混勻，配得BSA 濃度為0.5%。PA 溶液①取0.2 mL 加入至9.7 mL 的BSA 與1640 培養基的混合液中，配得濃度為2 mmol/L 的PA 溶液②。然后將PA溶液②置于55 ℃水浴鍋中水浴30 min。細菌濾過器過濾除菌兩次。過濾后的PA 溶液②與完全培養基按照體積比1∶9 混合稀釋10 倍配置成0.2 mmol/L 的PA 混合液。剩余的PA 溶液②按照每次實驗預估用量分裝，-20 ℃冰箱儲存。

1.3 HDCA 的配置 20 mg 的HDCA 溶于100 μL 的二甲基亞砜（DMSO），震蕩混勻直至完全溶解，配置成濃度5×106μmol/L 的HDCA 溶液①。HDCA 溶液①取8 μL，加入992 μL 含10% FBS 的DMEM 高糖完全培養基，配置成濃度為4 000 μmol/L 的HDCA 溶液②。HDCA 溶液②與完全培養基按照體積比1∶9 稀釋10 倍配置成濃度400 μmol/L 的HDCA 溶液③。100、200、300 μmol/L 的HDCA 溶液從HDCA 溶液③逐步稀釋。400 μmol/L 的HDCA 溶液中DMSO 的含量為0.08%，低于DMSO 對細胞安全界限0.1%，故本實驗不設立DMSO 對照組。剩余的HDCA 溶液③，標記時間和藥品名稱，密封放入-20 ℃冰箱凍存，避免反復凍融。

1.4 細胞活性測定 用CCK8 試劑測定細胞活性，每100 μL DMEM 完全培養基加入10 μL CCK8 試劑混勻。吸棄原液，每孔加入100 μL 的混合液，將96 孔板置于37 ℃細胞培養箱中孵育0.5～2 h，酶標儀測量450/620 nm處的光密度（OD）值。細胞活性計算公式如下：細胞活性（%）=［OD（加藥組）-OD（空白組）］/［OD（正常組）-OD空白組）］×100%。

1.5 實時熒光定量PCR （qRT-PCR） 將L02 細胞接種于6 孔板，PA 誘導24 h 后，HDCA 處理24 h。通過qRTPCR 檢測L02 細胞中FXR、增殖細胞核抗原（PCNA）、周期蛋白D1（Cyclin D1）、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）和蛋白激酶B（AKT）的mRNA 表達。引物（表1）大部分源于Primer Bank［6］，部分引物參考的編碼序列設計來源于NCBI 基因（存在多個轉錄本時，可對各轉錄本的保守區域進行引物設計），并以GAPDH 作為內參基因。所有引物均在Primer-Blast 中驗證了其特異性。合成由長沙鼎國生物科技有限公司完成。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.6 Western Blot 處理后的L02脂肪變性肝細胞用含有蛋白酶抑制劑復合物的冷RIPA 緩沖液裂解。收集上清液，12 000×g離心15 min，使用BCA 檢測試劑盒測定總蛋白濃度。主要使用的抗體包括FXR（1∶1 500）、PCNA（1∶2 000）、Cyclin D1（1∶2 000）、PI3K（1∶2 000）、p-PI3K（1∶1 500）、AKT（1∶2 000）、p-AKT（1∶1 500）和GAPDH（1∶2 000）。條帶采用Image J軟件進行密度分析。

1.7 FXR siRNA FXR siRNA 依據其基因序列（序列來源參考NCBI GeneBank數據庫［7］）在廣州市銳博生物科技有限公司設計并合成3條特異性干擾鏈。細胞密度達到50%，進行轉染。配置混合轉染試劑：5 μL Lipofectamine 3000 轉染試劑+5 μL FXR siRNA 混勻，室溫靜置30 min?；旌系霓D染試劑加入L02 細胞，轉染時間24～48 h。棄去原有的培養液，PBS 洗滌并更換新的不含雙抗的培養基。提取6 孔板細胞的總RNA，qRT-PCR 方法檢測3 條FXR siRNA 干擾鏈作用下，FXR mRNA 的表達情況并分析表達差異。選擇FXR mRNA 降低最明顯的一條作為實驗干擾組。

1.8 統計學方法 所有實驗數據均使用仙桃學術進行統計分析。計量資料以±s表示，服從正態分布且方差齊時多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey HSD 檢驗；服從正態分布但方差不齊時采用Welch 方差分析，進一步兩兩比較采用Games-Howell 檢驗。兩組間比較采用成組t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂肪變性肝細胞模型的構建及PA 對肝細胞活性的影響 采用甘油三酯含量測定和油紅O 染色方法觀察肝細胞脂肪變性模型是否構建成功。結果顯示油紅O染色后，顯微鏡下觀察到L02 細胞組細胞質中沒有大的紅色脂滴，在細胞膜上存在小而均勻的紅色脂滴；PA 誘導的L02 細胞組中細胞質內存在明顯的大而深紅色的脂滴（圖1）；與0 h 比較，L02 細胞在PA 誘導后不同時間段甘油三酯水平有不同程度的升高（圖2），表明模型構建穩定，將構建成功的脂肪變性肝細胞定義為M 組進行后續研究。CCK8 實驗檢測顯示，PA 誘導L02 細胞24 h后細胞活性明顯下降（1.000±0.084 vs 0.668±0.022，t=-18.663，P＜0.001）。

圖1 油紅O染色結果（×20）Figure 1 Results of the oil red O staining

圖2 PA誘導L02細胞后甘油三酯水平隨時間的變化Figure 2 Changes in triglyceride levels over time after PA induction in L02 cells

2.2 HDCA 對正常肝細胞及脂肪變性肝細胞活性的影響 為了研究HDCA 對脂肪變性肝細胞的影響，將不同濃度的HDCA 加入L02 細胞和脂肪變性肝細胞。CCK8實驗檢測結果顯示，與L02細胞組相比，L02+100 μmol/L HDCA 組和L02+200 μmol/L HDCA 組中L02 細胞活性沒有改變，L02+300 μmol/L HDCA 組和L02+400 μmol/L HDCA 組中L02 細胞活性明顯下降（P值均＜0.001）（圖3a）。與M 組相比，M+100 μmol/L HDCA 組和M+200 μmol/L HDCA 組細胞活性無明顯改變，M+300 μmol/L HDCA 組和M+400 μmol/L HDCA 組細胞活性均顯著降低（P值均＜0.001）（圖3b）。以上實驗證明300 μmol/L的HDCA抑制了L02細胞和脂肪變性肝細胞活性。為了觀察隨著300 μmol/L HDCA 處理時間的延長，脂肪變性肝細胞的活性是否發生改變，通過CCK8檢測結果顯示，M+300 μmol/L HDCA 組細胞活性隨時間的變化而發生改變（P值均＜0.001）（圖3c）。后續實驗HDCA濃度均采用300 μmol/L。

注：a，不同濃度HDCA對L02細胞活性的影響；b，不同濃度HDCA對PA誘導的脂肪變性肝細胞活性的影響；c，HDCA（300 μmol/L）不同時間對PA誘導的脂肪變性肝細胞活性的影響。

2.3 HDCA 對脂肪變性肝細胞FXR-PI3K/AKT 通路關鍵分子及PCNA 和Cyclin D1 表達的影響 為了進一步研究HDCA（300 μmol/L）抑制脂肪變性肝細胞活性的機制，通過Western Blot 檢測發現，M+HDCA 組中FXR 蛋白的表達高于M 組（t=4.492，P＜0.05）（圖4）。qRT-PCR 檢測M 組和M+HDCA 組的FXR、PCNA、Cyclin D1 以及PI3K/AKT 通路關鍵分子mRNA 的表達變化，結果顯示，相比于M 組，M+HDCA 組中FXR mRNA 表達升高，PCNA、Cyclin D1、PI3K 和AKT mRNA 表達均明顯下降（P值均＜0.05）（表2）。

圖4 HDCA對脂肪變性肝細胞FXR表達的影響Figure 4 Effect of HDCA on the expression of FXR in steatotic hepatocytes

表2 HDCA對脂肪變性肝細胞FXR、PI3K、AKT、PCNA和Cyclin D1 mRNA表達的影響Table 2 Effect of HDCA on the mRNA expression of FXR，PI3K， AKT， PCNA， and Cyclin D1 in steatotic hepatocytes

2.4 FXR低表達肝細胞株的構建及HDCA對脂肪變性肝細胞FXR mRNA表達的影響 為了驗證HDCA（300 μmol/L）是否通過FXR 抑制脂肪變性肝細胞活性，選擇干擾FXR受體，在3 條FXR siRNA（FXR siRNA 1、2、3）中篩選出干擾效果最強的干擾鏈。結果如圖5a 所示，相比于M 組，M+FXR siRNA 3的干擾效果最好（P＜0.01）。qRT-PCR檢測FXR siRNA 3 干擾鏈對HDCA 刺激脂肪變性肝細胞FXR mRNA表達的干擾效果，結果顯示，相比于M+HDCA組，M+FXR siRNA 3+HDCA 組的FXR mRNA 表達水平明顯降低（P＜0.05）（圖5b）。

圖5 FXR siRNA干擾效果及HDCA對脂肪變性肝細胞FXR表達的影響Figure 5 Effect of FXR siRNA interference and the effect of HDCA on FXR expression in lipid-denatured hepatocytes

2.5 低表達FXR 脂肪變性肝細胞中FXR-PI3K/AKT 通路關鍵分子及PCNA 和Cyclin D1 蛋白表達的變化 應用Western Blot 檢測FXR、PCNA、Cyclin D1、PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達水平。結果顯示，相比于M+HDCA 組，M+FXR siRNA 3+HDCA 組中FXR 蛋白表達下降，PCNA、PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 蛋白表達增加，差異均有統計學意義（P值均＜0.05）（圖6）。

圖6 抑制FXR表達后脂肪變性肝細胞FXR-PI3K/AKT通路關鍵分子及PCNA和Cyclin D1蛋白表達的變化Figure 6 Changes in the expression of key molecules of FXRPI3K/AKT pathway and PCNA and Cyclin D1 proteins in steatosis hepatocytes after inhibition of FXR expression

3 討論

MAFLD 發展包括單純脂肪肝（以往稱非酒精性脂肪肝）、脂肪性肝炎（以往稱非酒精性脂肪性肝炎）、脂肪性肝纖維化、肝硬化及肝癌等階段［8］。MAFLD 一旦進入脂肪性肝炎階段，肝細胞脂毒性損傷以及炎癥因子的大量浸潤，會加快肝纖維化、肝硬化和肝癌的進展速度［9-10］，因此脂肪性肝炎階段早期防治尤為重要。

膽汁酸是由肝臟合成的雙性分子。在肝細胞胞質和微粒體中，膽固醇通過經典和替代兩種途徑生成初級膽汁酸［11］。初級膽汁酸分泌進入腸道后，在腸內細菌的作用下，轉化為次級膽汁酸。HDCA是一種次級膽汁酸，存在于豬、鼠和人的膽汁中，在豬和鼠的膽汁中含量較高［12］，其對動物機體的脂質代謝有著重要的調控作用［13］。Sehayek 等［14］發現在野生型C57BL/6 小鼠中，飼喂HDCA可以減少飲食中膽固醇從腸道吸收，對治療小鼠血漿膽固醇升高和動脈粥樣硬化有較好的效果。Shih等［15］研究顯示，飼糧中添加1.25%的HDCA 可通過改善高密度脂蛋白功能來抑制低密度脂蛋白受體基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的形成。目前，HDCA 對MAFLD 發生發展的影響未見文獻報道。本研究發現濃度低于200 μmol/L 的HDCA 對正常肝細胞及脂肪變性肝細胞活性無明顯影響，300 μmol/L 及以上濃度的HDCA 處理的L02 肝細胞和L02 脂肪變性肝細胞活性明顯下降，同時PCNA、Cyclin D1 的mRNA 表達降低，表明較高濃度的HDCA 對脂肪變性肝細胞增殖活性具有抑制作用。

FXR 由Forman 等［16］于1995 年在大鼠中發現。FXR是膽汁酸代謝的重要受體，通過調節膽汁酸在肝臟和腸道的合成、結合、攝取和轉運以維持膽汁酸的動態平衡。疏水性膽汁酸鵝去氧膽酸對FXR的激活作用最強［17］，其次是脫氧膽酸和石膽酸，而親水性膽汁酸熊去氧膽酸是最弱的FXR激動劑［18］。GW4064、奧貝膽酸和Fexaramine等人工合成的FXR激動劑對FXR的激活作用更強［19-20］。?；?β-鼠膽酸和甘氨熊脫氧膽酸是FXR的拮抗劑［21-22］。本研究發現300 μmol/L 的HDCA 處理24 h 后，脂肪變性肝細胞FXR 蛋白表達明顯增加，提示HDCA 對FXR 具有激活作用，能夠上調肝細胞FXR的表達。

FXR 在各種代謝過程中發揮調節作用，包括脂肪代謝、膽汁酸平衡、葡萄糖平衡和細胞活性［23］。在肝臟中，FXR 通過激活FXR 信號通路，促進脂肪酸的β 氧化和膽汁酸的合成，減少脂肪酸的合成和蓄積，改善肝脂肪代謝異常［24-25］。FXR 還與肝細胞的生長、凋亡以及炎癥等生物學過程密切相關［26-27］。此外，FXR 通過調節腸道菌群的組成和代謝產物的生成，參與肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發生和發展［28-29］。FXR 發揮各種代謝調節作用與PI3K/AKT信號通路有關。Xu等［30］研究發現激活FXR活性，能夠抑制PI3K/AKT信號通路的活化，降低脂肪分解，增加脂肪生成，進而增加魚體內的脂質積累。本研究結果顯示，干擾FXR 表達后，脂肪變性肝細胞PI3K/AKT 信號通路關鍵分子，如PI3K、p-PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達明顯增加，提示FXR對PI3K/AKT信號通路關鍵分子表達具有抑制作用；同時還發現，干擾脂肪變性肝細胞FXR表達后，反映細胞增殖活性的PCNA蛋白表達增加，提示FXR對脂肪變性肝細胞增殖具有抑制作用。以上結果表明HDCA通過上調FXR表達抑制PI3K/AKT信號通路，從而造成脂肪變性肝細胞活性下降。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：汪遠遠負責實驗設計和實施，撰寫論文；鄒艷負責數據收集與分析；劉朝霞負責圖表制作；陽學風指導撰寫文章并最后定稿。