高效液相色譜法測定黑米花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷方法的建立

夏 輝,劉 旭,蔣國振,劉 萍,姬玲霞

陜西省糧食質量安全中心 (西安 710016)

黑米,禾本科稻屬一年生草本植物。黑米呈黑色或黑褐色,稻粒外觀長橢圓形,稻殼灰褐色。黑米原產中國,主要分布在中國西南高原地區,以云南、貴州、陜西、廣東、廣西較為集中。黑米以營養豐富、滋補保健而著稱,李時珍《本草綱目》記載:黑米名為“梗谷奴”,有“滋陰補腎,健脾暖肝、明目活血”之作用,被譽為“補血米”“長壽米”。因其含有滋陰、益腎、補胃、等多種食療功能,歷代均被列為“貢米”[1]。

近年來,市場上出現了部分假冒黑米食品,這種黑米大多使用煤焦色素或苯胺色素等人工合成色素,由于人工合成色素穩定性比天然色素高,不易褪色,且價格低廉,常為不法商販所青睞。人們經常食用這種染色黑米后會誘發基因突變、癌癥等疾病[2]。天然的黑米花色苷主要是矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、芍藥素-3-O-葡萄糖苷,而芍藥素-3-O-葡萄糖苷含量會隨著黑米的儲藏期延長而下降[3]?；ㄉ赵谒嵝匀芤褐酗@紫紅色,在堿性溶液中顯藍色,而染色黑米不具備這些化學特性。因此,研究分析黑米花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的檢測方法,對于辨別真假黑米尤為重要,它可為食品市場監管執法提供可靠依據。

目前,國內尚無關于黑米等食品中花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷檢測方法的國家標準,其測定方法只有部分行業標準、團體標準的報道。國內外有研究采用pH 示差法、近紅外光譜法[4-6]、液質法測定花色苷含量,但pH 示差法和近紅外光譜法準確度不高[7-8],液質法檢測成本較高。本文采用高效液相色譜法測定黑米花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量,所建立的方法準確、靈敏、重現性好。為確保黑米產品的質量和品質安全提供了可靠的檢測方法保證。

1 材料與方法

1.1 儀器

1260型高效液相色譜儀,配有自動進樣器、UVD檢測器和CDS工作站,美國Agilent公司;AE200型電子天平,瑞士Mettler Teledo公司;Mili-Q超純水機,美國Milipore公司。

1.2 材料與試劑

黑米、大米,超市市售;矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品,含量98.8%,德斯特生物技術有限公司;甲醇,色譜純,德國Merck公司;甲酸,色譜純,德國Merck公司;鹽酸,優級純;超純水。

1.3 方法

1.3.1標準儲備液的配制

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷儲備液(100 mg/L):取10.0 mg(精確至0.000 1 g)矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準品于100 mL棕色容量瓶中,用甲醇鹽酸溶液(95∶5,v/v)溶解并定容,搖勻,備用。

1.3.2標準工作溶液的配制

分別移取0.02 mL、0.05 mL、0.20 mL、0.50 mL、2.00 mL、5.00 mL、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷儲備液于6個10 mL棕色容量瓶中,用甲醇鹽酸溶液(95∶5,v/v)定容至刻度,制備成0.20 mg/L、0.50 mg/L、2.00 mg/L、5.00 mg/L、20.00 mg/L、50.00 mg/L的標準工作溶液。

1.3.3儀器條件

色譜柱:C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,4 μm);流動相,甲醇∶0.5%甲酸水溶液(10∶90,v/v);梯度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫30 ℃;進樣量10 μL;紫外檢測器,紫外波長520 nm。

1.3.4標準工作曲線的繪制

將矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準工作溶液10 μL注入液相色譜儀進行分析,在520 nm波長下記錄矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積,以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積為縱坐標,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷濃度為橫坐標,繪制矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準曲線。

1.3.5樣品前處理

取黑米稻谷樣品去除稻殼、稻谷和其他雜質,混勻后采用四分法分樣,取樣品20 g置于磨粉機上磨成粉末,過0.25 mm孔徑的篩子后,低溫冷藏備用。準確稱取黑米粉樣品0.50 g(精確至0.000 1 g)于15 mL具塞離心管中。加入10 mL甲醇鹽酸溶液(95∶5,v/v),搖床震蕩提取30 min,4 000 r/min離心10 min后,將上清提取液轉移至50 mL具塞離心管中,再在樣品中加入10 mL甲醇鹽酸溶液(95∶5,v/v),搖床震蕩提取30 min,5 000 r/min離心10 min后,將上清并入之前的提取液中,混勻后過0.45 μm有機相濾膜,待上機分析。

1.3.6樣品測定

液相色譜自動進樣器吸取10 μL樣品測試液注入液相色譜儀,按照1.3.3的儀器條件測定,記錄矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積,根據樣品測試液的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積與標準曲線比較,計算出矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的濃度。

矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量計算公式如下:

式中:X為試樣中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量,mg/kg;C為從標準曲線得到的待測液中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的濃度,μg/mL;V為總提取液體積,mL;W為樣品水分含量,%;m為試樣質量,g。

2 結果與討論

2.1 線性結果

將1.3.2配制的標準工作溶液分別按液相色譜的儀器條件進樣,以目標峰的峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標進行線性回歸分析,得到矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的回歸方程(n=6)為:Y=19.896 238 1X-1.756 439 2 (R2=0.999 894)。結果表明:矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在0.20～50.0 μg/mL范圍內線性關系較好。結果如圖1所示。

圖1 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準曲線

2.2 檢出限和定量限

取標準曲線最低點濃度為0.20 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準工作液,用甲醇不斷稀釋,當信噪比為3時,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的檢出限為0.1 mg/kg。當信噪比為10時,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的檢出限為0.3 mg/kg。圖2為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷檢出限色譜圖。

圖2 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷檢出限色譜圖

2.3 精密度

取濃度為2.0 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準工作液按液相色譜儀器條件連續進樣6次,記錄色譜圖,比較色譜峰面積。精密度試驗結果見表1,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷色譜圖見圖3。

表1 精密度試驗結果

圖3 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷(2.0 μg/mL)色譜圖

由表1可知,測得矢車菊素-3-O-葡萄糖苷峰面積的RSD為0.1%,結果表明,此方法精密度較好。

2.4 重復性

取不同黑米樣品6份,每份樣品稱取2個平行樣,前處理后按色譜儀器條件做重復性試驗,記錄色譜圖,分別計算矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量,比較重復性,試驗結果見表2。

表2 重復性試驗結果

由表2可知,6份黑米樣品的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的重復性為0.2%～1.3%,滿足GB/T 32465—2015《化學分析方法驗證確認和內部質量控制要求》對重復性的要求。結果表明,樣品重復性較好。

2.5 加標回收率

按照黑米產品國家標準中矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量要求,分別稱取空白大米樣品9份,分成3組,每組3分樣品,每份0.5 g(精確至0.1 mg),再分別移取濃度為100 μg/mL的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標準工作液1.5 mL、3.0 mL、4.5 mL于空白樣品中,每組濃度重復3次,按照前處理提取方法配成低、中、高濃度的待測樣品加標液,按本試驗方法測定,計算加標回收率。加標回收液相色譜圖如圖4～圖6所示,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷加標回收率試驗結果見表3。

表3 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷加標回收率試驗結果

圖4 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷加標量300 mg/kg液相色譜圖

圖5 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷加標量600 mg/kg液相色譜圖

圖6 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷加標量900 mg/kg液相色譜圖

由表3可知,矢車菊素-3-O-葡萄糖苷低、中、高濃度平均回收率分別為96.5%、98.4%、100.7%,RSD分別為0.4%、0.2%、0.3%,表明該方法回收率穩定。

3 結論

采用酸性甲醇溶液提取黑米中的花色苷,結合高效液相色譜法測定黑米花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的含量是一種線性良好,準確度和精密度高,重復性和回收率較好的檢測方法。該方法對矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的檢出限為0.1 mg/kg,定量限為0.3 mg/kg,該方法適用于黑米花色苷矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的測定。該方法的研究,可為黑米食品花色苷檢測方法國家標準、糧食行業標準的提出提供參考,也為保障市場監管部門執法,保護消費者合法權益和人們身體健康提供可靠依據。