結核分枝桿菌EsxV∕W 融合蛋白對恥垢分枝桿菌表型及巨噬細胞功能的影響

余海燕，李玉潔，任 芹，楊國平

（大理大學基礎醫學院，云南 大理 671000）

結核病是由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一種持續并嚴重危害公眾健康的慢性傳染病?？ń槊缡悄壳拔ㄒ慌鷾是覐V泛用于預防結核病的疫苗，但只對兒童具有保護作用，且保護力在80%左右〔1〕，不能保護青少年和成人免受感染〔2〕。因此，迫切需要開發新的更有效的抗結核疫苗和闡明MTB 與宿主之間的相互作用機制用于結核病的預防和治療。

研究〔3〕顯示MTB 中的基因與卡介苗存在16 個差異區域（region of difference，RD）1~16，其中11 個MTB 特異性基因組區域（RD1、RD4~7、RD9~13 和RD15）在所有卡介苗菌株中缺失。MTB 的Rv3619c和Rv3620c分別編碼EsxV 和EsxW 蛋白，位于MTB的RD9 區，是卡介苗中缺失基因，參與MTB 的毒力發揮，有利于桿菌在宿主細胞內的存活；此外，研究〔4-6〕發現EsxV 與EsxW 可誘導Th1 型保護性免疫，是重要的T 細胞抗原，可調節機體免疫應答反應，提示esxV和esxW是MTB中的毒力基因及與宿主相互作用中發揮免疫調節的基因。與同屬于ESAT-6 家族的早期分泌靶抗原6（early secretory anti-gen-6，ESAT-6）和培養濾液蛋白10（culture filtrate protein 10，CFP-10）在MTB 感染中發揮的作用相似，研究〔7-9〕表明編碼ESAT-6 及其伴侶CFP-10的Rv3875和Rv3874基因位于MTB 特異性基因組RD1 區，是卡介苗中的缺失基因及MTB 重要的毒力因子，對MTB 感染中毒力的發揮和免疫調節起關鍵作用。

與卡介苗生長緩慢、基因操作困難、在免疫功能低下人群存在感染的風險相比，恥垢分枝桿菌（Mycolicibacterium smegmatis，MS）是一種生長快，與MTB 基因高度同源，能高效表達外源性基因的非致病性分枝桿菌，被廣泛用于MTB 感染免疫研究的模式替代菌株〔10〕。研究〔11〕還發現esxV與esxW在MS 基因組中缺失，不表達EsxV 和EsxW 蛋白，為此本研究構建能表達EsxV∕W 融合蛋白的重組MS，體外模擬構建重組MS 入侵巨噬細胞時面臨的壓力條件，探究其在多種壓力環境中的耐受情況以及對巨噬細胞功能的影響，為闡明EsxV∕W 融合蛋白在MTB與宿主相互作用中的功能提供研究基礎。

1 材料

1.1 菌株、載體、細胞及實驗動物恥垢分枝桿菌mc2155株、穿梭質粒pMV261、表達質粒pET-28a、ANA-1巨噬細胞由大理大學基礎醫學院微生物學與免疫學教研室保存；6~8 周齡BALB∕c 小鼠，體質量18~20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-004。

1.2 主要試劑質粒小提試劑盒、DNA 產物純化試劑盒、DNA Marker、Pro-Light HRP 化學發光檢測試劑（天根生化科技有限公司，批號：U9225、U8717、W9319、W9924）；限制性內切酶EcoR Ⅰ及Hind Ⅲ、T4 DNA 連接酶（Thermofisher公司，批號：91282203、9126655、01035784）；小鼠抗組氨酸（histidine，His）標簽抗體、蛋白Marker、青∕鏈霉素混合液（100×）、牛血清白蛋白（組分V）、溶菌酶、咪唑、SDS、吐溫-80（Solarbio 公司，批號：20200631、PR1950、20220310、128P05727、423Q049、1224P031、712L031、1114D016）；可顯影蛋白Marker（Servicebio 公司，批號：MPC2209003-1）；粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）（peprotech 公司，批號：315-03）；HRP標記的羊抗小鼠IgG（博士德生物工程有限公司，批號：BST15F19BG50）；南美血源胎牛血清、細胞培養基RPMI 1640（Gibco 公司，批號：2176404、8123163）；ELISA 試劑盒（欣博盛生物科技有限公司，批號：M230427-102b）；NO 檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號：110922230303）；Middlebrook7H9 培養基（美國BD 公司，批號：928045）；胰蛋白胨、酵母提取物（Solarbio 公司，批號：I607BA0035、I606BA0002）。

2 方法

2.1 重組融合基因序列的構建及引物的設計從NCBI 的Gene數據庫中獲取Rv3619c和Rv3620c的堿基序列，去掉Rv3619c基因末端終止子和Rv3620c基因啟動子，經疏水性Linker連接。選擇合適的酶切位點并加上保護性堿基。使用Primer Premier 5軟件設計esxV/W重組基因序列的擴增引物，上游引物：5'-GGAATTCATGACCATCAAC-3'，含EcoRⅠ酶切位點；下游引物：5'-CCCAAGCTTTCAGCTGCTG-3'，含Hind Ⅲ酶切位點。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35 個循環；72 ℃繼續延伸10 min。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定。重組克隆質粒pMD18-T-esxV∕W的基因序列和引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

2.2 重組蛋白EsxV∕W 的誘導表達、純化及鑒定使用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質粒pMD18-T-esxV∕W及表達載體pET-28a 以形成黏性末端，回收雙酶切產物esxV∕W重組基因和pET-28a，經T4 DNA 連接酶連接后熱激轉入大腸桿菌DH5α 感受態細胞，涂布于LB 固體平板（含50 mg∕mL 卡那霉素），37 ℃倒置培養過夜，挑取卡那霉素抗性篩選的單克隆菌落經PCR 鑒定后，提取菌液中重組表達質粒pET-28a-esxV∕W，熱激轉入表達菌株BL21（DE3）感受態細胞。將鑒定正確的對數生長期pET-28a-esxV∕W重組BL21 菌株按1∶100 比例接種于LB 培養液，37 ℃、200 r∕min，振蕩培養至OD600=0.6 后加入終濃度為0.8 mmol∕L 的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG），于16 ℃誘導表達20 h，冰水浴超聲裂解菌體后收集上清，用吸附鎳柱純化，經10、20、30 mmol∕L咪唑溶液洗滌雜蛋白后，用100 mmol∕L 咪唑溶液洗脫目的蛋白EsxV∕W，對純化后的蛋白進行SDSPAGE和Western blot驗證。

2.3 鼠抗EsxV∕W 重組蛋白多克隆抗體的制備純化的EsxV∕W 重組蛋白以50 μg+（GM-CSF 蛋白佐劑）∕只，經皮下注射免疫BALB∕c 小鼠，共3 只。對照組3 只注射等體積0.9%氯化鈉溶液（只首次免疫注射）。每2 周免疫1 次，共3 次，第3 次免疫后1 周內眥取血，分離血清，-80 ℃保存備用。

2.4 esxV/W 融合基因重組MS 的構建及表達鑒定使用限制性內切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切重組克隆質粒pMD18-T-esxV∕W及穿梭載體pMV261，回收雙酶切產物esxV∕W和pMV261，經T4 DNA 連接酶連接后熱激轉入大腸桿菌DH5α 感受態細胞，涂布于LB 固體平板（含50 μg∕mL 卡那霉素），37 ℃倒置培養過夜，挑取卡那霉素抗性篩選的單克隆菌落經PCR 鑒定后，提取陽性菌液中重組表達質粒pMV261-esxV∕W，電擊轉入MS 感受態細胞，涂布于2×YT 固體平板（含50 μg∕mL 卡那霉素），挑取篩選陽性的單克隆菌落經PCR 鑒定正確后將重組菌命名為MS-EsxV∕W，同時構建含空載質粒pMV261 的重組菌MS-vec。取對數期的MS-EsxV∕W 菌液45 ℃熱擊誘導1 h 后于冰上超聲裂解菌體，收集裂解上清液及沉淀，以制備的鼠抗EsxV∕W 融合蛋白多克隆抗體為一抗，HRP-IgG 為二抗，Western blot鑒定重組融合蛋白EsxV∕W 在MS中的表達。

2.5 重組MS菌落形態、成膜能力及生長曲線的測定將OD600值一致的MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液稀釋后涂布于2×YT固體平板，37 ℃培養3~5 d，觀察重組菌的菌落形態并拍照；取OD600值一致的MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液，接種于含7H9-OADC、蘇通、2×YT、LB 液體培養基的12 孔板中，37 ℃培養箱中靜置培養3~5 d，觀察生物膜的形成情況并拍照；使MS-vec 與MS-EsxV∕W 重組菌的菌液初始OD600=0.02，37 ℃、200 r∕min 振蕩培養，每6 h取菌液測其OD600值并繪制生長曲線。

2.6 菌落計數法檢測重組MS在不同環境條件下的耐受力取1.0 mLOD600值一致的對數期MS-vec、MS-EsxV∕W 重組菌菌液接種于20 mL 2.5 mg∕mL 溶菌酶（處理0、3 h）、1 μg∕mL 孔雀綠（處理0、6 h）、pH 3.0（處理0、3、6 h）、0.02% SDS（處理0、2、4、6 h）、5 mmol∕L H2O2（處理0、3、6 h）及10 mmol∕L NaNO2（處理0、3、6 h）的M7H9 培養基，分別在上述不同時間吸取100 μL 菌液進行10 倍梯度稀釋，取適宜稀釋度的100 μL稀釋菌液涂板，37 ℃倒置培養3~5 d，計算重組MS 的存活率。細菌存活率=（處理組菌落數∕對照組菌落數）×100%。

2.7 重組MS 對ANA-1 細胞NO、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）釋放的影響取對數生長期的MS-vec 與MS-EsxV∕W，按10︰1 的感染復數侵染ANA-1 細胞，分別于侵染后12、24、36、48 h 收集培養上清液，Griess 法檢測上清液中NO 的含量，ELISA法檢測上清液中TNF-α及IL-6含量。

2.8 重組MS在ANA-1細胞中的存活情況分別于MS-vec、MS-EsxV∕W 侵染ANA-1 細胞24、48、72 h，以終濃度為0.025%的SDS裂解細胞15 min，將細胞裂解液均勻涂布于2×YT 固體培養基，37 ℃倒置培養3~5 d，計算重組MS 的胞內存活率，分析重組菌在胞內的存活情況。細菌胞內存活率=（存活菌落數∕初始菌落數）×100%。

2.9 統計分析所有實驗均采用3 個及以上獨立樣本數據的均值進行比較，使用Graphpad Prism 9.4軟件進行統計分析，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，3 組及3 組以上采用Two-Way ANOVA 進行比較，以α=0.05 為檢驗水準，P<0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 原核表達載體和MS-EsxV∕W 的構建及鑒定重組克隆質粒pMD18-T-esxV∕W經內切酶EcoRⅠ、Hind Ⅲ雙酶切后，獲得大小約為637 bp 的單一目的條帶。見圖1A。將其克隆至pET-28a載體中，菌落PCR 顯示esxV∕W重組基因成功插入pET-28a 載體。見圖1B。取雙酶切產物esxV∕W基因與穿梭質粒pMV261連接后經PCR鑒定構建的重組穿梭表達質粒pMV261-esxV∕W成功。見圖1C。電轉至MS感受態細胞中，建立過表達EsxV∕W 的MS，即MSEsxV∕W，通過PCR 擴增鑒定目的基因esxV∕W的表達，結果表明含重組基因的MS-EsxV∕W 構建成功。見圖1D。

圖1 esxV∕W融合基因的PCR擴增及重組菌的PCR鑒定電泳圖

3.2 融合蛋白EsxV∕W 的原核誘導表達、純化及鑒定含重組表達質粒pET-28a-esxV∕W的BL21經0.8 mmol∕L IPTG、16 ℃、誘導20 h 后，收集裂解細菌上清液及沉淀，上清液中的EsxV∕W 融合蛋白經吸附鎳柱純化，100 mmol∕L 咪唑溶液洗脫獲得大小約為28 kDa 的單一目的條帶，大小與預期相符。見圖2A。經Western blot 檢測，在大小為28 kDa 位置顯現出清晰條帶。見圖2B。表明所得蛋白為EsxV∕W融合蛋白。重組菌MS-EsxV∕W 經熱擊誘導后進行Western blot 檢測，結果顯示重組融合蛋白在22~28 kDa 位置間出現單一條帶。見圖2C。表明重組融合蛋白EsxV∕W 在MS中表達成功。

圖2 融合蛋白EsxV∕W的誘導表達、純化電泳及Western blot鑒定圖

3.3 重組MS 的菌落形態、生物膜的形成及生長曲線檢測結果單菌落觀察顯示，MS-vec 與MSEsxV∕W 在平板上菌落均呈干燥的淡黃色菜花樣，菌落直徑MS-vec 為（0.95±0.05）cm，MS-EsxV∕W 為（1.00±0.05）cm，大小相近，差異無統計學意義（P>0.05）；生物膜檢測結果顯示，MS-vec、MSEsxV∕W 在M7H9、蘇通、LB 及2×YT 液體培養基中生物膜形成情況基本一致；通過檢測重組菌在不同時間點的生長情況可以看出，MS-vec 與MSEsxV∕W 在生長的各個時間點生長速率無明顯變化（P>0.05）。見圖3。以上結果表明EsxV∕W 融合蛋白異源表達于MS，對其菌落形態、生物膜形成及生長速率無顯著影響。

圖3 MS-vec與MS-EsxV∕W生長曲線

3.4 重組MS在不同環境條件下存活能力分析結果顯示，與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W 在溶菌酶、孔雀綠及低pH 等環境條件下存活率無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4A~C。在SDS 環境條件下存活率顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4D。在H2O2及NaNO2環境條件下存活率顯著增高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖4 E~F。表明EsxV∕W 融合蛋白異源表達于MS后不改變MS 對溶菌酶、孔雀綠及低pH 應激環境的耐受力，但降低對SDS 的耐受力，增強對H2O2及NaNO2環境的耐受力。

圖4 MS-vec、MS-EsxV∕W在不同環境條件下存活能力比較

3.5 重組MS 對ANA-1 細胞NO、TNF-α 及IL-6 釋放的影響檢測結果表明侵染后與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W ANA-1 細胞NO 釋放量在48 h 顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖5A。TNF-α釋放量在12、24、36 h 均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖5B。IL-6 釋放量在36 h 顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖5C。表明過表達EsxV∕W 融合蛋白的重組MS 可促進ANA-1 細胞TNF-α和晚期NO、IL-6的釋放。

圖5 MS-vec、MS-EsxV∕W對ANA-1分泌NO及細胞因子的影響

3.6 重組MS 在巨噬細胞內的存活菌落計數法檢測重組MS 在ANA-1 內的存活情況，結果顯示與MS-vec 相比，MS-EsxV∕W 的胞內存活率更高，差異有統計學意義（P<0.01）。見圖6。表明過表達EsxV∕W融合蛋白可促進重組MS在ANA-1內的存活。

圖6 MS-vec、MS-EsxV∕W在ANA-1內的存活率

4 討論

存在MTB 基因組而在卡介苗傳代中丟失的RD區基因被認為是卡介苗毒力與免疫原性減弱的原因，并與MTB 的毒力發揮密切相關；RD 區基因編碼蛋白亦是結核亞單位疫苗及作為卡介苗加強免疫策略的候選優勢抗原；此外，RD 區基因還作為MTB感染的血清學檢查標志物〔12〕。因此對RD 區基因的功能研究既是分析MTB 致病機理，也是篩選結核亞單位疫苗候選抗原的有效途徑。

MTB 作為一種胞內寄生菌，巨噬細胞是其主要的宿主細胞，MTB 感染宿主后分泌的蛋白質可被運輸至宿主細胞內發揮毒力和免疫調節作用，從而影響宿主的抗MTB 免疫應答反應，最終逃避宿主細胞的免疫殺傷并在宿主體內繁殖和擴散，建立感染。對MTB 分泌的效應蛋白與宿主細胞之間相互作用過程的研究有助于理解MTB 的致病過程。研究表明MTB 的RD1 區基因esat-6（esxA）與cfp-10（esxB）參與MTB 的致病過程及MTB 感染中的免疫調節作用〔7-9〕。RD7 區基因esxO（Rv2346c）編碼蛋白可增強卡介苗在感染巨噬細胞內的存活〔13〕；esxV∕W作為RD9 區基因，既往研究表明單獨的EsxV 或EsxW 是重要的T 細胞抗原〔5，14〕，但其與宿主細胞的相互作用過程不清楚，為此本研究構建MTBesxV∕W融合基因在MS 中的異源表達菌株MS-EsxV∕W，分析其在與宿主細胞相互作用中發揮的功能。通過測定重組菌株的菌落形態、生物膜和生長曲線，發現EsxV∕W 不影響MS 的菌落形態、生物膜形成及生長速率。MTB 在入侵巨噬細胞過程中，巨噬細胞會對其施加各種不利于菌體生存繁殖的環境壓力，例如溶菌酶、酸性、表面活性壓力、氧化壓力、活性氮中間體等，來抵御MTB 的感染。本研究體外模擬MTB 在侵染巨噬細胞過程中遇到的溶菌酶、孔雀綠、低pH、SDS（表面活性壓力）、H2O2（氧化壓力）、NaNO2等環境壓力條件，發現EsxV∕W 融合蛋白異源表達于MS 后沒有明顯改變MS 在溶菌酶、孔雀綠及酸性環境下的生存能力，但在SDS 表面活性壓力下的抵抗力降低，對H2O2及NaNO2環境的抵抗力增強。同時檢測重組MS 感染巨噬細胞后其胞內存活情況，發現EsxV∕W 融合蛋白異源表達于MS 后可促進MS 在巨噬細胞內的存活，這可能與表達EsxV∕W融合蛋白增強了MS 對巨噬細胞內氧化壓力以及NaNO2惡劣環境的抵抗力有關，表明esxV∕W融合基因在MTB感染中的毒力方面發揮一定作用。

研究還發現表達EsxV∕W 融合蛋白的重組MS侵染巨噬細胞可促進巨噬細胞NO 的分泌，及誘導巨噬細胞促炎細胞因子TNF-α 與IL-6 分泌，具有誘導Th1 型細胞分化的作用，表明EsxV∕W 參與MTB感染中誘導宿主免疫調節作用。

綜上所述，EsxV∕W 融合蛋白是MTB 中的毒力蛋白及發揮免疫調節作用的蛋白，可改變MS 的表型并調控ANA-1巨噬細胞的免疫應答反應，本研究有助于完善對MTB 的esxV∕W融合基因功能的認識，為進一步探索MTB 的致病機理，尋求MTB 中的免疫優勢抗原和抗結核疫苗靶抗原奠定基礎，推動新的安全有效的抗結核疫苗的研發。