飼料酵母水溶物具有促進草魚原代肝細胞生長及修復過氧化氫損傷的作用

馬 杰, 王卓君, 石瑤瑤, 葉元土, 蔡春芳, 吳 萍, 陳 鵬

(蘇州大學基礎醫學與生物科學學院1,蘇州 215123) (江蘇省水產動物營養重點實驗室2,蘇州 215123) (北京英惠爾生物技術有限公司3,北京 100081)

在水產養殖過程中,多種因素如水環境條件、飼料中有害物質等均可引起養殖魚類發生嚴重的氧化應激,并導致魚體健康損傷、病害的發生和發展,給養殖業帶來不可忽視的損失。氧化應激是指體內的氧化和抗氧化的失衡,會導致細胞損傷、甚至死亡。氧化損傷是細胞損傷的主要類型之一,如何通過飼料途徑修復魚體氧化損傷的細胞、維護魚體主要器官組織的結構及功能完整性是現代營養與飼料研究的重要領域之一。酵母類飼料在水產飼料中被廣泛用于增強魚體免疫防御功能和抗氧化損傷的功能,已經成為一類常規的飼料添加劑[1]。在建立草魚原代肝細胞H2O2損傷模型、并研究飼料酵母對氧化損傷修復的基礎上[2],本實驗選擇3種酵母飼料產品制備成水溶物凍干粉,并用于對草魚原代肝細胞生長的影響和對H2O2損傷細胞的修復實驗。旨在通過離體細胞實驗,探究飼料酵母水溶物對草魚原代肝細胞生長影響、對氧化損傷細胞的修復效果和作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗魚

用于原代肝細胞分離的材料魚為平均體重(27.92±5.47)g的一冬齡草魚幼魚,飼養于蘇州大學魚類循環養殖系統中,每天使用實驗室自制的草魚飼料(粗蛋白質質量分數28%、粗脂肪質量分數6%)飽食投喂1次,每2 d更換1/2體積的水。定期監測水環境變化,維持水體中溶氧量為4.5～4.8 mg/L、pH為7.5～8.0、水溫20～28 ℃。

1.2 飼料酵母水溶物的制備

取3種飼料酵母產品(菌種均為釀酒酵母Saccharomycescerevisiae),其營養組成見表1。樣品粉碎后全部過60目標準篩,定量稱取實驗樣品、加入雙蒸水、攪拌均勻,置于4 ℃浸泡24 h。使用孔徑為3 μm的低速濾膜抽濾,將得到的濾液冷凍干燥,所得凍干粉置于-80 ℃低溫冰箱保存備用。

分別稱取一定量的酵母水溶物凍干粉,完全溶解于無菌PBS溶液中,使樣品水溶物的質量濃度為25 mg/mL,使用0.22 μm微孔濾膜過濾后,4 ℃保存,現配現用。

表1 3種飼料酵母產品成分質量分數/%

1.3 草魚原代肝細胞分離與培養

參照秦潔等[3]的原代肝細胞分離方法,原代肝細胞置于體積分數5% CO2、27 ℃的細胞培養箱中培養,24 h后更換一半的培養液。

1.4 水溶物濃度對原代肝細胞生長影響實驗

3種酵母水溶物分別設置6個質量濃度梯度,用完全培養基(在M199培養液中加入15 mg/100 mL胎牛血清、1 mg/100 mL三抗和1 mg/100 mL牛胰島素)按梯度稀釋,分別使3種飼料酵母水溶物的質量濃度為0(對照組)、25、50、100、200、400 mg/L。原代肝細胞培養16 h(細胞融合率約為50%)后更換培養液,繼續培養24 h。隨后,使用MTT法測定3種水溶物對原代肝細胞生長的影響,并依據對照組計算各組細胞相對活力。

1.5 H2O2損傷模型及水溶物對損傷模型修復作用的實驗設計

參照石瑤瑤等[2]的方法建立草魚原代肝細胞的H2O2損傷模型(H2O2組),以不添加H2O2和水溶物的實驗組為對照組。按照H2O2模型組實驗條件,細胞培養1 h后,分別用含有3種水溶物(為1.4篩選的最佳促生長濃度)的完全培養基更換培養液,分別為YC-A、YC-B和YCP實驗組,見表2。

表2 酵母水溶物對草魚原代肝細胞H2O2損傷的修復作用實驗設計

1.6 實驗方法

1.6.1 細胞活力檢測

使用MTT法檢測并計算相對細胞活力,計算公式為:

1.6.2 培養液中LDH活性檢測

收集各處理組細胞的培養液,根據LDH試劑盒方法檢測并計算培養液中LDH活性。

1.6.3 透射電鏡觀察細胞超微結構變化

分別收集各組細胞,加入體積分數為2.5%戊二醛溶液,避光固定。用預冷PBS漂洗,1%鋨酸溶液后固定30 min后,使用梯度濃度的丙酮(體積分數分別為50%、70%、90%、100%)在室溫下脫水、包埋劑(V100%丙酮∶V樹脂=1∶1)浸透2 h、包埋固化、修塊、超薄切片、檸檬酸鉛和醋酸鈾染色,在透射電鏡下(TEM)觀察超微結構變化。

1.6.4 AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡

建立原代肝細胞氧化應激模型后,在培養液中分別加入3種飼料酵母水溶物繼續培養24 h,收集所有細胞,每組3個重復,每個樣本細胞量在10 000個左右。加入5 μL Annexin V-FITC、10 Μl PI (碘化丙啶)染色液。避光孵育15 min后置于冰浴,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.6.5 線粒體膜電位(MMP)檢測

線粒體膜電位檢測使用JC-1試劑盒,在收集好的細胞中加入500 μL JC-1工作液,重懸細胞,置于37 ℃培養箱中避光孵育30 min。孵育完成后收集細胞,使用緩沖液清洗3次,重懸細胞,使用流式細胞儀檢測。

1.6.6 細胞內活性氧(ROS)檢測

細胞內ROS水平通過DCFH-DA氧化引起的熒光變化來檢測。細胞經處理后,將DCFH-DA加入培養基中,置于27 ℃培養箱中孵育30 min,收集細胞,PBS洗滌2次,隨后使用流式細胞儀檢測。

1.6.7 轉錄組學分析

收集各組細胞,每組3個重復,加入適量Trizol裂解細胞。將充分裂解的細胞轉移至凍存管,在液氮中速凍,用于后續測序。RNA提取與RNA-seq測序技術服務由北京百邁客生物科技有限公司提供,采用Illumina高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序,生成高質量的原始數據(Raw Data)。對Raw Data進行過濾,去除N的比例大于10%的Reads、質量值Q≤10的堿基數占整條Read的50%以上的Reads,獲得高質量的Clean Data。利用生物學信息手段對轉錄組測序數據進行分析,將Clean Data與指定的參考基因組序列對比(參考基因組下載地址見:http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/),進行文庫質量評估、序列結構分析、差異基因分析。使用DEseq2軟件進行差異表達分析,篩選條件為基因差異表達量的對數值Fold Change≥1.5且P<0.01。

1.7 數據分析

所有結果均以至少3次獨立實驗的平均值±標準差表示。使用SPSS 22.0軟件對實驗數據進行單因素方差分析,并使用Duncan氏多重比較分析檢驗組間差異顯著性,P<0.05為差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。使用GraphPad Prism 9進行統計分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 細胞生長觀察

如圖1所示,剛分離的草魚原代肝細胞呈規則的球形或橢球形,離散分布于細胞板上。培養16 h后,觀察到細胞貼壁生長且其融合率(細胞融合匯片的面積與細胞板的孔底面積的百分比)在50%左右;培養24 h細胞融合率能夠達到80%,生長狀態良好。

圖1 顯微鏡下肝細胞的形態

2.2 水溶物濃度對原代肝細胞生長的影響

圖2為各組草魚原代肝細胞活力的測定結果,細胞活力隨著3種水溶物的質量濃度增加而增加。與對照組0 mg/L比較,YC-A質量濃度為25 mg/L時無顯著差異(P>0.05),質量濃度在50～400 mg/L時,細胞活力極顯著增加(P<0.01);YC-B質量濃度為25 mg/L和400 mg/L時差異顯著(P<0.05),50～200 mg/L差異極顯著(P<0.01);YCP質量濃度為25、400 mg/L時無顯著差異(P>0.05),質量濃度在50～200 mg/L時差異極顯著(P<0.01)。

結果表明,3種水溶物對原代肝細胞表現出良好的促生長作用,并表現出促進細胞生長的二次方程曲線劑量效應。為便于進一步研究水溶物對氧化應激狀態下細胞的保護作用,分別在3種水溶物的促生長質量濃度范圍內選取1個最佳促生長質量濃度進行后續試驗,即YC-A、YCP為100 mg/L,YC-B為200 mg/L,細胞活力分別為(119.48±6.93)%、(124.98±8.48)%、(117.52±6.73)%。

圖2 不同質量濃度水溶物對細胞活力的影響

2.3 對H2O2誘導的草魚原代肝細胞氧化應激的修復效果

2.3.1 細胞活力變化

利用H2O2誘導的草魚原代肝細胞氧化損傷模型,比較3種水溶物對原代肝細胞生長的影響結果,見圖3。H2O2組與對照組比較,細胞活力極顯著下降(P<0.001);與H2O2組相比,YC-A組、YC-B組和YCP組細胞活力極顯著提高(P<0.001),表明3種飼料酵母水溶物具有修復肝細胞H2O2氧化損傷的作用,使受到損傷的肝細胞活力得到顯著的恢復。

圖3 水溶物對損傷細胞的活力影響

2.3.2 培養液中LDH活性

培養液中LDH活性可以顯示培養細胞膜的通透性。各組細胞培養液中LDH活性測定結果見圖4。H2O2組與對照組相比,培養液中LDH活性極顯著提高(P<0.001),表明H2O2對肝細胞膜造成損傷導致細胞膜通透性顯著增加。3種水溶物處理組與H2O2組相比,培養液中LDH活性極顯著降低(P<0.001),顯示3種水溶物可以修復受損肝細胞的細胞膜通透性。

圖4 培養液中LDH活性

2.3.3 肝細胞超微結構

如圖5所示,對照組細胞形狀呈橢圓形,細胞膜完整,胞質分布均勻,細胞核核仁清晰且核膜完整,染色質分布均勻,線粒體豐富、且嵴清晰。H2O2組的細胞顯示出了典型的線粒體損傷,線粒體腫脹、嵴扭曲或消失,細胞核固縮、染色質凝集,細胞核位置偏移,細胞內出現空泡。3種水溶物處理組對H2O2誘導的細胞損傷表現出了明顯的修復效果,主要體現在線粒體腫脹情況得以改善,但與對照組相比細胞仍有損傷的形態學特征,如染色質凝集、胞內空泡、部分線粒體輕微腫脹及嵴模糊等。

圖5 肝細胞超微結構變化

2.3.4 細胞凋亡特征指標

由細胞的凋亡圖(圖6a)及凋亡率(圖6b)可知,H2O2組與對照組相比,凋亡率從(20.00±3.88)%上升到(71.37±2.44)%,差異極顯著(P<0.001);與H2O2組比,3種水溶物處理組凋亡率極顯著降低(P<0.01),YC-A組、YC-B組和YCP組的凋亡率分別為(58.87±4.37)%、(58.63±3.73)%、(46.88±4.35)%。與對照組相比,H2O2處理極顯著增加了細胞內ROS含量(P<0.001),細胞內ROS水平達到正常細胞的3倍以上。與H2O2組比較,3個水溶物處理組極顯著抑制H2O2誘導的細胞內ROS的產生量(P<0.01)。H2O2組與對照組相比,MMP極顯著降低(P<0.001);3個水溶物處理MMP均極顯著高于H2O2組 (P<0.001)。

圖6 飼料酵母緩解H2O2誘導的細胞凋亡

2.4 差異表達基因(DEGs)分析

依據轉錄組結果,使用DESeq2進行分析,設置參數錯誤發現率(FDR)≤0.01且差異倍數(FC)≥1.5篩選差異表達基因。結果如表3所示,對照組與H2O2組比較,差異表達的基因共計505個,其中,283個基因表達上調、222個基因表達下調;YC-A組與H2O2組相比,差異表達的基因共計34個,其中,29個基因表達上調、5個基因表達下調;YC-B組與H2O2組相比,差異表達的基因共計1 400個,其中,754個基因表達上調、646個基因表達下調;YCP組與H2O2組相比,差異表達的基因共計186個,其中,139個基因表達上調、47個基因表達下調。

表3 差異表達基因數目統計表

從差異表達基因集H2O2/對照組、H2O2/YC-A、H2O2/YC-B、H2O2/YCP中篩選出與氧化損傷相關的關鍵基因,見表4。

3 討論

3.1 飼料酵母水溶物能夠促進原代肝細胞生長活性

酵母培養物為以釀酒酵母為菌種,經固體發酵后濃縮、干燥獲得的產品,其中包含有酵母菌體、酵母次級代謝產物和殘余的培養基。酵母細胞壁為釀酒酵母經液體發酵后得到的菌體,再經酶解后分離、干燥獲得的細胞壁產品,其主要成分包括β-葡聚糖和甘露聚糖[1]。本實驗中制備的酵母水溶物去除了飼料酵母中的非水溶性物質,包括無活性的酵母菌體、非水溶性蛋白質和不溶性糖等。在本實驗的條件下,3種酵母產品的水溶物對草魚原代肝細胞的生長都表現出一定的促進效果,即除YC-A 25 mg/L組、YCP的25 mg/L和400 mg/L組外,其他各實驗組的結果均顯著或極顯著地高于對照組。這一方面可能由于酵母水溶物能夠為細胞提供其生長所需的營養物質,另一方面可能是水溶物中的某些生物活性物質和未知促生長因子發揮了促生長作用。同時,3種水溶物對細胞的促生長效果表現出二次方程的曲線劑量效應,即低質量濃度時效果不明顯,如YC-A組和YCP組水溶物質量濃度為25 mg/L時,對細胞促生長作用不顯著(P>0.05);在達到最適宜質量濃度下具有最佳促進生長的效果,如YC-A、YCP、YC-B添加量在 100、100、200 mg/L時表現出最佳的促生長效果。然而還難以解釋高質量濃度的酵母水溶物反而導致培養細胞生長下降的原因,影響因素可能是多方面的。實際生產中,在配合飼料中添加酵母類產品有適宜的添加量,過低、過高的添加量其沒有顯示出更好的飼料效果[1,15]。

表4 關鍵差異表達基因

飼料酵母水溶物含有促進細胞生長的成分,且具有最適宜的添加劑量效應關系,質量濃度過高、過低均不顯著。

3.2 飼料酵母水溶物能夠緩解原代肝細胞線粒體途徑的凋亡與損傷

線粒體作為細胞的主要細胞器,在調節細胞凋亡方面發揮著關鍵作用。H2O2是一種強氧化劑,能夠穿透細胞膜,極易轉化為高活性的羥基自由基、過氧自由基等,攻擊線粒體呼吸鏈的生物氧化途徑,導致抗氧化酶活性降低、生成大量的ROS,導致細胞氧化應激,進而激活線粒體凋亡途徑[13]。

飼料酵母能夠通過調控細胞和組織中的多種生理或病理事件,提高水產動物機體抗應激能力[14,15]。本實驗發現,飼料酵母水溶物能夠緩解H2O2誘導的細胞凋亡,主要表現為顯著降低細胞凋亡率、顯著降低細胞內ROS水平。相較于模型組,YCP、YC-A和YC-B分別使細胞內ROS水平降低了16.51%、9.37%、21.16%,凋亡率降低34.32%、17.51%、17.85% (圖6)。在線粒體凋亡途徑中,線粒體外膜的可滲性是凋亡觸發的關鍵,該過程涉及粒體膜通透性轉換孔道的打開,從而改變線粒體外膜通透性,在細胞質中高水平的Ca2+影響下,導致MMP的降低[16]。飼料酵母水溶物能夠提高氧化應激下的肝細胞的線粒體膜電位,本實驗中,H2O2作用下肝細胞MMP下降了54.52%;而在3種水溶物處理后均不同程度提高了MMP(圖6),相較于模型組細胞MMP水平,YCP組、YC-A組、YC-B組分別提高了65.18%、11.51%、16.69%。

線粒體是細胞能量代謝中心,線粒體膜電位的異常往往表明線粒體功能障礙,提示著細胞內供能及代謝受阻,從而影響細胞活力。本實驗結果表明,飼料酵母水溶物能夠提高氧化應激狀態下原代肝細胞的細胞活力。此外,飼料酵母水溶物能夠維持細胞膜完整性、修復H2O2誘導的原代肝細胞超微結構損傷。乳酸脫氫酶(LDH)位于正常細胞的細胞質中,當細胞受到損傷時,會釋放到細胞外,是細胞損傷的敏感標記物[17]。通過檢測培養液中LDH活性,發現3種水溶物均能降低培養液中LDH活性,結合透射電鏡結果(圖5)可知,3種水溶物作用下,氧化損傷的肝細胞超微結構得以修復和改善,細胞膜完整性得以維持。

3種酵母產品水溶物通過對細胞膜完整性修復、線粒體膜損傷的修復、降低細胞內ROS水平等途徑,對H2O2誘導的草魚原代肝細胞損傷進行有效的修復,主要表現為顯著降低受損肝細胞凋亡率、有效促進原代肝細胞生長能力。

3.3 飼料酵母水溶物對原代肝細胞的保護機制

為進一步闡明飼料酵母水溶物對細胞的保護機制,通過轉錄組學分析飼料酵母水溶物處理組與模型組之間的關鍵DEGs,見表4。其中,基因g6pd是4個差異基因表達集中共同涉及的DEG。H2O2作用下基因g6pd表達受到抑制,而3種水溶物處理后表達上調,提示飼料酵母水溶物能夠提高細胞抗氧化能力。H2O2組基因nqo1、spartin表達下調,但YCP水溶物處理后nqo1上調,YC-B處理后spartin表達上調,提示飼料酵母水溶物能夠維持線粒體形態和功能正常。線粒體功能異常會阻礙ATP合成,使細胞內能量供給受限,影響細胞活力。TCA循環與磷酸戊糖途徑(PP途徑)同屬于細胞的中心碳代謝通路,對細胞能量供給至關重要。轉錄組結果顯示,在H2O2作用下TCA循環通路(suclg2、cs、idh1)和PP途徑中(g6pd、tkt、6pgd)的關鍵DEGs表達受抑制,在3種飼料酵母水溶物處理后表達上調,提示飼料酵母水溶物可能能夠緩解細胞內能量供應障礙,從而提高細胞活力。DIABLO是線粒體內的促凋亡蛋白,能夠通過結合凋亡抑制蛋白(IAPs)誘導細胞凋亡[11],本研究中,YC-B組和YCP組基因diablo相比模型組下調。這些結果驗證了飼料酵母對H2O2誘導的氧化損傷具有保護作用,提示3種水溶物具有促進原代肝細胞生長增殖、緩解H2O2誘導的線粒體途徑凋亡的作用。

與其他脊椎動物一樣,魚類肝臟富含Ⅰ相、Ⅱ相代謝酶用于清除外源藥物或毒物。細胞色素P450(CYP450)和谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)分別是肝臟的Ⅰ相代謝酶和Ⅱ相代謝酶,在外源性物質的代謝中起著關鍵作用[9,10]。YCP可能通過提高肝細胞內解毒酶基因表達水平,即提高細胞藥物代謝能力,從而保護細胞免受氧化損傷。YCP組與H2O2組相比,CYP450相關基因(cyp3a27、cyp2g1、cyp3c1、cyp27a1)表達上調;谷胱甘肽代謝通路中基因(gsta、gst3、gsto1)上調。

YC可能通過調節細胞內GSH水平,抑制細胞鐵死亡發生。發生鐵死亡時,細胞內的谷胱甘肽(GSH)被消耗,導致谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)失活,最終導致脂質過氧化和大量活性氧的產生[18]。胱氨酸/谷氨酸逆轉運體(system-Xc)和GPX4是鐵死亡的關鍵調節因子[19]。本研究中細胞經YC-B處理后,slc7a11表達上調。SLC7A11是system-Xc的重要組成部分,system-Xc可以通過胱氨酸轉運來維持GPX4的活性[20]。slc7a11上調可能使運輸到細胞中的胱氨酸量增多,從而提高細胞內GSH水平,促進GPX4對鐵死亡的抑制功能。GCLC是谷氨酸-半胱氨酸連接酶(GCL)的亞基,通過調節GSH的表達,發揮抗氧化作用[8]。YC-A和YC-B處理細胞后,gclc表達上調。此外,YC-A可能通過上調鐵蛋白含量,維持細胞內鐵穩態。FTH1是鐵死亡的負調節因子,FTH1下調使得鐵儲存減低,鐵超載促進鐵死亡。本研究中YC-A處理細胞后,基因fth1上調。

4 結論

飼料酵母水溶物不僅能夠促進草魚原代肝細胞生長活性,還可以降低細胞內ROS水平、提高細胞抗氧化能力,從而保護細胞免氧化損傷。轉錄組結果提示,YCP可能通過增加細胞內Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶保護細胞免受氧化損傷,而YC對細胞的保護可能是通過調控細胞內鐵穩態實現的。