核桃仁原位水解工藝優化及氧化穩定性研究

洪佳偉, 王愛琳, 肖柳柳, 李 闖, 朱西平, 錢森和, 趙世光, 薛正蓮

(安徽工程大學生物與食品工程學院,蕪湖 241000)

核桃(JuglansregiaL.)為胡桃科、胡桃屬多年生喬木[1]。核桃植株環境適應性強,在國內廣泛種植[2]。核桃不僅具有豐富的營養價值,其口味也深受廣大消費者喜愛[3,4]。如今我國核桃的種植面積和產量均居世界首位。隨著堅果炒貨行業的發展,因堅果氧化酸敗造成的損失愈發嚴重[5],為減少這類損失,目前,使用較為普遍的方式有氣調包裝[6]、保鮮劑處理[7]等。然而針對堅果變質采用的大部分抗氧化劑依然是化學合成的,所需成本較高并且不利于消費者選擇,尋求安全、有效的天然抗氧化劑迫在眉睫[8-11]。

核桃仁含有大量優質蛋白,氨基酸種類豐富可作為一種優質的抗氧化肽源[12]?？寡趸木哂袕姶蟮淖杂苫宄芰?對脂質在氧化過程中受到的損傷具有保護作用[13,14]。目前用酶解法[15]水解脫脂核桃粕[16]及核桃分離蛋白[17]獲得抗氧化肽的方法已非常成熟。同時已有研究通過測定儲藏過程中核桃仁過氧化值等指標的變化,進行氧化穩定性研究[18]及貨架期預測。但現有研究中,通過對核桃仁水解實現原位富集抗氧化肽,提高核桃仁儲藏過程中氧化穩定性,延長貨架期并提高儲藏品質的研究相對較少。

本研究直接水解核桃仁,測定水解前后核桃仁脂質氧化誘導時間的變化進行氧化動力學分析,評價水解對其氧化穩定性的影響。對核桃仁加速氧化,以過氧化值為指標評價核桃仁氧化過程中品質的變化,結合油脂貨架壽命與溫度關系預測貨架期,評價表面富集抗氧化肽對核桃仁貨架期的影響,為延長核桃仁貨架期提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料和試劑

去皮核桃仁;復配蛋白酶(胰酶)(4×103U/g)、菠蘿蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(6×105U/g);鄰二氮菲、鄰苯三酚、鐵氰化鉀等;其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器和設備

ST-600脂肪測定儀,真空冷凍干燥機,TGL-16G低溫高速離心機,HO1-1A恒溫磁力攪拌器,TU-1800紫外可見分光光度計,Rancimat 743型脂肪穩定測試儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 核桃仁水解液的制備

將一定量核桃仁加入錐形瓶后加入去離子水,最后加入適量酶液使錐形瓶內液體體積為40 mL。滴加稀酸、稀堿溶液調節pH至酶的最適pH。在搖床以220 r/min振蕩酶解,酶解完成后滅酶(95 ℃水浴15 min),離心(4 ℃、15 000 r/min、30 min)收集上清液備用。

1.2.2 蛋白酶的篩選

為避免酸堿環境對核桃仁產生影響,選取最適pH在7附近的酶進行實驗包括:復配蛋白酶(胰酶)、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶。設置底物質量分數為10%、酶質量分數為0.5%其余條件均為酶的最適水解條件。通過水解度及抗氧化能力的測定確定最佳水解蛋白酶,4種酶的最適水解條件見表1。

表1 不同蛋白酶制劑及其最適反應條件

1.2.3 單因素實驗

在4種蛋白酶中篩選出水解效果最好的酶即復配蛋白酶(胰酶),酶解核桃仁。

選擇底物質量分數(10%、20%、30%、40%、50%)、酶質量分數(1%、3%、5%、7%、9%、11%、13%)、酶解時間(0.25、0.5、1、2、3、4、5 h)和酶解溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)4個因素,以酶解產物抗氧化能力為指標優化核桃仁水解條件。

1.2.4 正交實驗

根據單因素實驗結果,對各因素分別挑取三水平,設計四因素三水平L9(34)正交實驗。研究復配蛋白酶(胰酶)的酶質量分數(A)、底物質量分數(B)、水解溫度(C)和水解時間(D)對抗氧化能力的影響,挑選出最優水解條件。L9(34)正交實驗因素與水平設計見表2。

表2 L9(34)正交實驗因素與水平設計

1.2.5 水解度測定

采用甲醛滴定法[19]測定水解度,測定時以標準稀堿滴定溶液的滴定量來計算水解度。取5 mL水解液上清液,加入25 mL去離子水混勻后滴加0.01 mol/L氫氧化鈉標準滴定液調節pH至8.2并記錄其消耗量記為V1。然后向其中加入10 mL中性甲醛溶液,混勻后使用氫氧化鈉滴定液將混合液pH滴定至9.2,記錄氫氧化鈉溶液的消耗量記為V2。取30 mL去離子水重復上述實驗作為空白對照,記錄氫氧化鈉的消耗量記為V0。水解度計算公式如下。

式中:c為氫氧化鈉的濃度/mol/L;0.014為1 mL濃度為1.00 mol/L NaOH標準溶液相當于氮的質量/g;n為底物樣品總氮質量/g。

1.2.6 羥自由基清除率的測定

羥自由基清除率的測定方法參考鄰二氮菲-Fe2+氧化法[20]:將1 mL 1.5 mmol/L鄰二氮菲溶液(熱溶法)、2 mL 0.2 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)、1 mL去離子水和1 mL 0.75 mmol/L 硫酸亞鐵溶液混勻后加入1 mL體積分數為0.01% H2O2混勻。將試管置于37 ℃水浴鍋內,恒溫水浴45 min,于536 nm測吸光度記為A損傷 。以1 mL去離子水代替H2O2所得吸光度記為A未損傷 。以1 mL樣液代替去離子水測得的吸光度記為A樣。

羥自由基清除率的計算公式為:

式中:A樣、A損傷、A未損傷分別為樣品管、損傷管、未損傷管在536 nm下的吸光度。

1.2.7 超氧陰離子自由基清除率的測定

超氧陰離子自由基清除率測定參考鄰苯三酚自氧化法[21]:取50 μL樣液于1 cm比色皿中后加入Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)加入50 μL鄰苯三酚溶液使得體系體積為3 mL,置于紫外-可見分光光度計測量,每30 s記錄吸光度反應時長4 min。以第一次記錄的吸光度記為A0樣,最后一次記錄的吸光度記為A末樣。用Tris-HCl緩沖液代替樣品液做空白記錄反應始末的吸光度記為A0空和A末空。

式中:D1為超氧陰離子自由基清除率。

1.2.8 還原力的測定

還原力的測定[22],將1 mL水解液和2 mL 0.2 mol/L PBS(pH 6.6)、2 mL質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液混勻水浴保溫20 min。然后加入2 mL質量分數為10%的三氯乙酸溶液以2 000 r/min離心10 min。離心完成后取上清液2 mL加入2 mL去離子水、0.5 mL質量分數為0.1%的三氯化鐵溶液混勻靜置10 min后于700 nm測吸光度。以樣品吸光度和陽性對照吸光度的比值來判斷還原力的強弱。

上述抗氧化測定實驗均以1 mg/mL還原型谷胱甘肽作為陽性對照。

1.2.9 加速氧化實驗

以上述實驗所得最優水解條件對去皮核桃仁進行處理,水解完成后將核桃仁置于篩網輕微振蕩瀝干表面水分,置于45 ℃熱風循環干燥箱烘干水分,待水含量分數處于3%左右時,以60 g每袋封裝。采用Schaal烘箱法于60 ℃對去皮核桃仁進行加速儲藏實驗[23],分別于0、1、2、3、4、5、7、9 d取樣?？瞻讓φ战M除水解過程中不加酶液,剩余過程同樣品組。

1.2.10 油脂的提取

由實驗室前期所得以石油醚為有機溶劑,料液比為1∶5(m/v)進行油脂的萃取,將核桃仁從鋁袋中取出后粉碎并過40目篩,混合后慢速振搖1 min后避光低溫靜置12 h,混合液在(60±2)℃水浴鍋中水浴1.5 h除盡石油醚,所得油脂存于50 mL離心管避光低溫備用。

1.2.11 過氧化值的測定

參考 GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》第一法。

1.2.12 氧化誘導時間測定

通過Rancimat 743油脂氧化測定儀測定油脂氧化誘導時間(OSI)。設置參數:溫度110、120、130 ℃,氧氣通量10 L/h,單次測試取3 g核桃油樣品,于測量池中加入100 mL超純水,通過水電導率的變化來測定氧化誘導時間。根據氧化誘導時間計算核桃油的氧化動力學參數。

1.2.13 貨架期預測

以過氧化值為指標進行貨架期預測,油脂氧化規律符合一級動力學模型。對加速氧化實驗所得過氧化值數據進行擬合,預測其在(60±2)℃下達到GB 19300—2014《食品安全與國家標準堅果與籽類食品》中過氧化值的限定值對應的加速氧化時間。結合溫度與油脂貨架壽命的關系預測常溫儲藏時核桃仁貨架期[24]。

1.2.14 數據處理

每個實驗均設置3組平行,通過SPSS軟件分析顯著性,用origin 2018軟件進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶制劑的篩選

由圖1可知,在水解初期,復配蛋白酶(胰酶)酶解產物水解度顯著上升,表明該蛋白酶對核桃仁敏感,水解能力較強。以3種抗氧化能力為指標時,復配蛋白酶(胰酶)水解液的抗氧化能力均遠高于其他酶制劑水解液的抗氧化能力。結合4種指標將復配蛋白酶(胰酶)作為最優水解用酶進行后續實驗。

圖1 不同蛋白酶酶解對酶解產物水解度、還原力、超氧陰離子自由基清除率、羥基自由基清除率的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 底物質量分數對胰酶水解液的抗氧化活性影響

底物質量分數對水解液抗氧化活性的影響如圖2所示。在底物質量分數處于0%～40%內,底物增加的同時各項抗氧化指標均相應增長且呈正相關性。在底物質量分數處于40%時,各項抗氧化指標均處于較高水平。當底物質量分數超過40%時,可能由于底物添加過多使得酶解液的流動性減弱,不利于酶的作用[25]。以底物質量分數為40%為最適底物濃度。以1 mg/mL還原型谷胱甘肽溶液為陽性對照,經測定其羥自由基清除率為56.52%、超氧陰離子自由基清除率為23. 14%,當只有底物存在時溶液幾乎不存在抗氧化活性。

注:同一指標下不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著,下同。圖2 底物質量分數對水解液抗氧化能力的影響

2.2.2 酶質量分數對胰酶水解液抗氧化活性的影響

由圖3觀察到外源添加胰酶使得水解液抗氧化能力上升顯著,說明水解有利于產生可溶性抗氧化活性物質提升水解液的抗氧化能力。當酶質量分數處于5%～11%范圍內,酶的加入使得水解液的抗氧化能力快速上升,說明在此范圍內產生了大量的活性抗氧化物質。酶質量分數超過11%,水解液的抗氧化能力增長趨勢減弱。結合抗氧化指標及成本,選擇酶最優質量分數為11%。

圖3 酶質量分數對水解液抗氧化能力的影響

2.2.3 酶解時間對胰酶水解液抗氧化活性的影響

酶解時間對水解液抗氧化活性的影響如圖4所示。在水解0.0～0.5 h水解液的抗氧化能力快速上升。隨著水解進程的延續,水解液抗氧化能力的增長趨勢減緩。水解時間超過2 h后,水解液的3種抗氧化能力均下降且羥自由基清除力損失巨大,可能是由于水解時間過長導致初步水解產生的抗氧化活性物質進一步水解,生成了其他活性物質使得抗氧化活性下降。結合抗氧化指標及為減少水解時間過長對核桃仁品質產生不利影響,選取水解時間0.5 h為最佳水解時長。

圖4 酶解時間對水解液抗氧化能力的影響

2.2.4 酶解溫度對胰酶水解液抗氧化活性的影響

酶解溫度對水解液抗氧化活性的影響如圖5所示。當水解溫度處于40～45 ℃范圍,隨著水解溫度的提高水解液的抗氧化能力也在提高,一方面可能是因為在40～45 ℃內酶的活力隨著溫度的升高逐漸得到了提升;另一方面可能是由于溫度升高,核桃蛋白中部分疏水性氨基酸暴露使酶解反應更加充分。當溫度超過45 ℃后,水解液抗氧化能力隨著溫度的升高而減弱,可能是由于溫度過高導致部分抗氧化活性物質失活。故選取45 ℃作為最適水解溫度。

圖5 酶解溫度對水解液抗氧化能力的影響

2.3 正交實驗結果與分析

由表3與表4可知,針對不同的抗氧化指標,各因素對其會產生不同程度的影響。根據抗氧化指標的極差值比較可知,對不同抗氧化指標在選定的酶解溫度、酶質量分數、水解時間、底物質量分數中存在顯著差異。對超氧陰離子自由基清除率,各因素影響程度的主次順序為D>B>C>A,即酶解溫度>酶質量分數>水解時間>底物質量分數;對于羥自由基清除率來說為D>A>C>B即酶解溫度>底物質量分數>水解時間>酶質量分數、對還原力來說為B>D>A>C即酶質量分數>水解溫度>底物質量分數>水解時間及對加權綜合評分指標來說各因素的主次順序為D>B>A>C,即水解溫度>酶質量分數>底物質量分數>水解時間。綜合評分的加權系數通過熵值法得出,熵值是一種物理計量單位,熵值法[26]通過熵值提供的信息效用值確定各指標所占權重,其中羥自由基清除率所占系數為0.394、超氧陰離子自由基清除率所占系數為0.286 9、還原力的系數為0.319。通過對綜合評分的分析確定最優組合同時結合成本及水解液抗氧化能力的因素綜合考慮以A2B2C2D2為實驗最優組合。經3次平行實驗驗證,測得最優組合水解液的超氧陰離子自由基清除率為63.21%、羥自由基清除率為97.66%同時還原力為188.68%(1 mg/mL GSH吸光度作對比),相比于正交實驗組均處于較高水平。

表3 L9(34)正交實驗結果

表4 超氧陰離子自由基清除率極差分析表

2.4 氧化誘導時間的分析

對照組和樣品組的OSI值,由Rancimat 743油脂氧化穩定性測定儀測得。當氧化溫度從110 ℃加熱到130 ℃,對照組和樣品組核桃油的OSI值分別從2.18 h縮短到0.86 h、從2.4 h縮短到0.71 h。從所得數值上看,溫度每升高10 ℃對應核桃油的氧化誘導時間縮短了一半左右。通過對lg OSI和(1/T)的關系作圖,log OSI和1/T線性相關其中樣品的方程式為Log OSI=4 057.087 38(1/T)-10.209 58,R2=0.996 6;對照的方程式為Log OSI=3 156.566 38(1/T)-7.931 58,R2=0.890 49。從Arrhenius方程出發,可得lnk=lnZ-Ea/RT其中k為OSI的倒數,R代表理想氣體常數(8.314 kJ/mol),由此得回歸方程的斜率和油樣的氧化自由能(Ea)有關,截距和油樣的頻率因子(Z)有關。結合氧化誘導時間的數值得樣品組方程為lnK=23.638 71-9 394.115 89/TR2=0.996 88,對照組為lnK=18.095 25-7 204.325 26/T,R2=0.886 81并由此得油樣的Ea、Z及Q10。

經計算樣品組Ea為78.103 kJ/mol ,Q10指數為1.832 3,而對照組Ea為59.896 kJ/mol ,Q10指數為1.598 8。Q10數值代表溫度升高10 ℃導致的氧化速率的增加[27]。 Q10數值越高意味著反應速率發生一定變化所需的溫度變化越小,說明溫度對樣品氧化反應速率的影響較大。通過Q10指數的計算解釋了樣品組從110 ℃升溫到130 ℃ OSI值的變化比空白對照組大的原因。

Ea值的變化表明核桃仁經過直接酶解使得核桃油氧化穩定性得到提升。一般來說,Ea值越大,氧化速率發生一定改變所需的溫度變化就越小,即Ea越大對溫度的上升就越敏感。針對于油脂氧化反應,Ea越大說明油脂氧化所需的能量就越大,油脂氧化就越難進行。由表5可知,樣品組Ea>對照組Ea。Ea值的變化說明了,用胰酶直接水解核桃仁產生的抗氧化活性物質增強了油脂在氧化過程中的穩定性,對延緩油脂氧化具有積極作用。

2.5 過氧化值的變化

由圖6可知,在加速氧化過程中,對照組的過氧化值較樣品組偏高。隨著氧化時間的增加,兩者間的差值也不斷增加。表明相同氧化條件下,樣品組在加速氧化過程中受到的氧化損傷顯著低于對照組;樣品組在儲藏始末的過氧化值變化幅度相較于對照組來說小,表明樣品組較對照組擁有更好的氧化穩定性,有助于核桃仁在加速氧化過程中保持較好的品質。對照組和樣品組在儲藏期內過氧化值均未超過GB 19300—2014 《食品安全與國家標準堅果與籽類食品》限定值0.08 g/100 g。

圖6 不同處理加速氧化過程中過氧化值的變化情況

2.6 貨架期預測

對加速儲藏過程中測得的過氧化值進行擬合,得對照組:Y=0.010 09e0.198 57X,R2=0.915 89;樣品組:Y=0.004 61e0.192 91X,R2=0.948 41。R2均大于0.9,表明擬合相關性及擬合精度較好。將國標規定的過氧化值的限定值分別代入方程得60 ℃下對照組和樣品組儲藏時間分別為10.5 d和14.8 d。由溫度和油脂貨架壽命系數關系[28]知油脂在60 ℃烘箱中儲存1 d相當于在20 ℃儲藏16 d,由此推算對照組和樣品組在20 ℃的貨架期分別為168 d和236.8 d。通過水解核桃仁原位富集抗氧化肽使得核桃仁的貨架期延長了68.8 d。

3 結論

為了延長核桃貨架期,本研究對核桃仁整體酶解原位富集抗氧化肽,測定核桃油氧化誘導時間,結合氧化動力學研究該工藝對核桃仁油脂氧化穩定性的影響。測定加速氧化過程中氧化指標的變化,說明該工藝對核桃仁氧化品質的影響。結果表明:酶解后核桃油具備了較高的Q10,其氧化自由能從59.896 kJ/mol上升到78.103 kJ/mol,獲得了較高的氧化穩定性;在加速氧化過程中對照組的過氧化值始終高于樣品組,兩組分間的差值也在逐漸增加。結合溫度和油脂貨架壽命系數關系,得出直接水解原位富集抗氧化肽使得核桃仁貨架期延長了68.8 d。本研究通過對核桃仁進行整體酶解,提升了核桃仁的氧化穩定性,有效延長了核桃仁貨架期,為尋找綠色、安全、有效的核桃儲藏方式提供技術參考。