鎘誘導雛雞肝臟的損傷作用

顧成霞, 王 艷, 張 宇, 唐中齊, 葉瑞旗, 汪夢杰, 劉 暢,2,3, 曹迷霞,2, 李 磊,2,3*

(1.安徽科技學院 動物科學學院,安徽 鳳陽 233100;2.動物營養調控與健康安徽省重點實驗室,安徽 鳳陽 233100;3.農業農村部豬肉質量安全控制重點實驗室,安徽 鳳陽 233100)

鎘是毒性很強的環境污染物之一[1],為人和動物非必需元素。自然界中,鎘元素主要以化合態形式存在,常與鉛、汞等元素伴生。鎘是動物性食品中主要污染物之一,動物常因采食受污染飼料而富集在組織內,隨著食物鏈最終進入人體。中國環境中鎘污染日趨嚴重[2],被鎘污染的空氣、土壤和食品對人體危害嚴重,會導致人產生骨痛、自發性骨折、骨缺損等危害[3]。鎘對人和其他哺乳動物所有的組織器官都具有嚴重毒性,如肝、腎、睪丸等[4]。鎘的毒性作用常表現為抑制DNA修復酶的活性、氧化應激、細胞死亡等[5],雖然鎘不能直接造成氧化應激損傷,但鎘可以消耗大量谷胱甘肽(Glutathione,GSH),抑制抗氧化酶活性,導致活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的大量生成,并伴隨丙二醛(Malondialdehyde,MDA)等脂質過氧化產物顯著增加[6],其毒性與接觸的時間、物質的劑量、接觸途徑等有關。

肝臟具有排泄和分泌膽汁、造血等功能。作為動物機體內最重要的解毒器官,血液流經肝臟時,部分有害的物質可被肝臟中產生的酶分解排出體外。鎘進入機體,在體內形成鎘-硫蛋白[7],經過血液循環選擇性地在腎臟和肝臟中蓄積。肝臟是鎘的主要的靶器官之一,鎘可造成嚴重的肝臟損傷[8]。因鎘暴露時間與劑量的差異,導致不同組織器官中鎘的蓄積含量有所不同,繼而產生的毒性效應存在差異。以往的研究更多關注鎘對嚙齒動物肝臟及腎臟功能的毒性作用,對鎘暴露引起家禽毒性的研究相對較少。本試驗以雛雞為研究對象,觀察鎘暴露對雛雞肝組織病理變化的影響,以期為預防和治療鎘致雛雞肝損傷提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥品與試劑 氯化鎘(CdCl2,純度>98%)購于美國sigma公司;天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate Transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine Transaminase,ALT)、還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(Tumour Necrosis Factor-α,TNF-α)試劑盒購自武漢華美生物公司,其他試劑均為分析純。

1.1.2 試驗動物 200只1日齡愛撥益加雛雞由江蘇廣大畜禽有限公司提供,適應性飼養3 d,期間自由采食與飲水。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組與處理 將200只1日齡愛撥益加雛雞適應性飼養3 d后,隨機分成4組,每組5個重復,每個重復為10只?？瞻讓φ战M灌胃生理鹽水,染毒組按表1一次性灌胃不同劑量的CdCl2溶液。

表1 試驗分組與處理Table 1 Groups and treatments

1.2.2 樣品采集與處理 雛雞染毒24 h后,心臟采血處死動物,血液室溫靜置1～2 h,待血液充分凝固后,在2 000 r/min條件下離心10 min,吸取上層血清,分裝到無菌的1.5 mL離心管中,置于-20 ℃保存備用;迅速剖解動物,分離肝臟,在每只動物肝臟相同部位取大小適當的一份組織置于4%中性多聚甲醛溶液進行固定處理,用于組織病理學檢測,另取數份組織經液氮迅速冷凍后轉入-80 ℃冰箱保存備用。

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 血清轉氨酶活性測定 按照試劑盒說明操作測定血清中ALT與AST活性,將測定結果帶入標準曲線計算各樣本中ALT、AST活性。

1.3.2 肝臟組織病理學觀察 摘取雛雞肝臟部分葉片,置4%中性多聚甲醛進行固定,不同濃度梯度乙醇進行脫水處理24 h,肝組織快速脫水后,用二甲苯透明10 min,石蠟包埋,制成5 μm厚的切片,將制好的切片采用蘇木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosin Staining,H&E),光學顯微鏡下觀察肝細胞的病理學變化。

1.3.3 抗氧化指標的測定取 100 mg肝組織加入0.9 mL生理鹽水,冰浴條件下制備組織勻漿,2 500 r/min離心10 min,吸取上清液后按照試劑盒說明書測定SOD活性和GSH、MDA含量,并以樣品的蛋白濃度對結果進行校正。

1.3.4 血清中細胞因子含量的檢測 血清在室溫下融化,2 500 r/min離心10 min,吸取上層樣品,嚴格按照ELIAS試劑盒說明書步驟操作。將測定結果帶入標準曲線計算各樣本中TNF-α、IL-1β與IL-6質量濃度。

1.3.5 數據處理和統計學分析 結果以“平均數±標準差”表示,采用SPSS 22.0軟件對試驗數據進行單因素ANOVA分析,多重比較采用LSD檢驗,P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 臨床癥狀觀察

雛雞經適應性飼養后,給予不同劑量CdCl2,隨后觀察染毒雛雞的一般狀況發現,高劑量組(140 mg/kg)雛雞染鎘后,精神沉郁,反應遲鈍,8 h后該組試驗動物陸續死亡,中、低劑量組(35、70 mg/kg)試驗動物精神略顯沉郁,無其他明顯中毒癥狀。鑒于高劑量組鎘毒性過大,造成多數動物直接死亡,故本研究主要測定了中、低劑量染鎘組的相關指標。

2.2 鎘對肝臟組織結構的影響

正常肝組織中,肝細胞以中央靜脈為中心,向周圍呈現放射狀的排列方式,形成細胞厚度的細胞板,稱為肝板,肝板之間以肝血竇相連。如圖1所示,利用H&E染色觀察肝組織的病理變化(圖1),空白對照組雛雞肝臟組織細胞排列整齊,染色均一,未發現明顯病理變化。35 mg/kg CdCl2組處理24 h中出現細胞核成塊聚集,染色不清晰,肝小梁擁擠。70 mg/kg CdCl2組處理24 h中空泡增多肝竇受壓變窄,伴有出血的現象,中央靜脈周圍有少量炎性細胞浸潤。肝細胞疏松,出現不同程度的腫脹。140 mg/kg CdCl2組處理24 h中細胞局部病灶壞死明顯,肝小梁排列受到破壞,細胞核皺縮加劇,有少量出血現象。肝組織進行染鎘處理后均出現明顯的病理變化,如細胞邊界模糊,肝細胞中出現空泡,炎癥和凋亡增多。說明鎘染毒處理對肝細胞結構出現破壞作用。

圖1 CdCl2對雛雞肝臟組織結構的影響Fig.1 Effects of CdCl2 on the histological structure of chicken liver注:A為空白對照組;B為35 mg/kg CdCl2處理24 h;C為70 mg/kg CdCl2處理24 h;D為140 mg/kg CdCl2處理24 h?！啊敝甘境鲅?“→”指示細胞壞死;“→”指示細胞核破碎。

2.3 鎘對雛雞血清中ALT/AST活性的影響

ALT和AST是存在于肝細胞內的2種轉氨酶,正常情況下血液中濃度很低。當肝細胞發生損傷時,細胞通透性發生改變,ALT和AST釋放到血液中[9]。本試驗中,雛雞染鎘24 h后,采用賴氏比色法檢測鎘損傷雛雞肝臟血清中ALT與AST的活性,結果如圖2所示。與空白對照組對比,35 mg/kg與70 mg/kg CdCl2處理組雛雞血清ALT與AST的活性均顯著上升(P<0.01),表明CdCl2可造成雛雞肝臟損傷。

圖2 CdCl2對雛雞血清轉氨酶活性的影響Fig.2 Effects of CdCl2 on serum transaminase activity in chicken serum注:**表示與空白對照比較差異極顯著,P<0.01。下同。

2.4 鎘對雛雞肝臟氧化應激的影響

SOD是肝臟內重要的抗氧化酶,MDA是膜脂質過氧化中重要的產物。當機體出現鎘中毒時,組織器官內的抗氧化系統遭到破壞,其中脂質過氧化物的代謝減慢,過氧化作用增強,造成肝臟的氧化損傷[10]。采用比色法,檢測鎘致雛雞肝臟氧化應激損傷情況,結果如圖3所示,同空白對照組相比,35、70 mg/kg CdCl2處理組GSH含量和SOD活性均顯著下降(P<0.01),MDA含量顯著提高(P<0.01),說明CdCl2造成雛雞肝臟氧化應激損傷。

圖3 CdCl2對雛雞肝臟氧化應激損傷作用Fig.3 Effects of CdCl2 on oxidative stress injury in chicken liver

2.5 鎘對雛雞炎癥反應的影響

IL-1β、IL-6和TNF-α能夠誘導局部發生炎癥反應,并調節免疫功能[11],促炎遞質會刺激巨噬細胞釋放大量的IL-1β、IL-6和TNF-α等細胞因子[12]。同時,肝臟是產生和清除細胞因子的主要場所,肝臟產生炎癥可影響細胞因子代謝,對細胞因子清除作用顯著降低,造成局部聚集。通過ELISA測定血清IL-1β、IL-6與TNF-α的含量,結果如圖4所示。同空白對照組相比,35 mg/kg與70 mg/kg CdCl2處理組血清的IL-1β、IL-6與TNF-α均極顯著上升(P<0.01),表明鎘染毒處理可以造成肝組織發生炎癥反應,導致肝臟出現損傷。

圖4 CdCl2對雛雞血清中IL-1β、IL-6與TNF-α質量濃度的影響Fig.4 Effects of CdCl2 on the contents of IL-1β, IL-6 and TNF-α in chicken serum

3 結論與討論

鎘的主要毒性靶器官之一為肝臟,可以引起肝臟產生嚴重的損傷甚至導致肝細胞壞死。AST和ALT是檢測肝功能損傷的重要指標[13]。ALT參與機體蛋白質代謝,可加速氨基酸的轉移。AST可促進蛋白質轉氨基作用[14]。由于鎘造成的肝臟損傷,導致肝細胞膜結構發生改變[15],產生一系列的損傷表現,肝細胞膜通透性增加,ALT和AST被釋放入血液,引起血清中轉氨酶的含量升高。本試驗中,將雛雞肝臟染鎘24 h后進行采樣處理檢測,因高劑量CdCl2組毒性劑量過大,造成多數動物死亡,故此試驗主要檢測空白對照組、35 mg/kg CdCl2組、70 mg/kg CdCl2組相關數據。觀察可得35 mg/kg CdCl2組、70 mg/kg CdCl2組相較于空白對照組中血清AST/ALT的活性顯著升高(P<0.01),說明肝損傷模型建造成功[16]。對肝組織進行H&E染色鏡下觀察到35 mg/kg CdCl2組、70 mg/kg CdCl2組、140 mg/kg CdCl2組開始出現明顯的病理變化,細胞邊界模糊,肝細胞中出現空泡,炎性細胞和凋亡細胞增多。說明急性鎘中毒引起雛雞肝細胞組織結構受到損傷。

研究表明,急性鎘中毒時,機體組織器官內抗氧化系統遭到破壞[17],對體內脂質過氧化物的清除能力降低,導致細胞膜脂質的過氧化作用增強,進而造成肝臟的氧化損傷[18]。SOD作為體內重要的抗氧化酶,能夠特異地清除體內有毒自由基等物質,緩解自由基對機體的嚴重損害[19],本試驗中35 mg/kg CdCl2組、70 mg/kg CdCl2組中SOD活性同空白對照組相比顯著降低(P<0.01),活力明顯受到抑制,說明染鎘使肝細胞的抗氧化能力受到一定的抑制作用。GSH作為重要的抗氧化劑,能夠維持機體正常的免疫作用,并具有解毒、抗氧化的功能。GSH在體內可以通過拮抗氧自由基的毒性作用,清除體內超氧陰離子及其他自由基,防止肝細胞受損。鎘可導致肝細胞內GSH消耗增加[20],在本試驗中,與空白對照組相比,35 mg/kg和70 mg/kg CdCl2處理組GSH水平顯著降低(P<0.01),說明鎘導致了肝細胞的氧化損傷。膜脂質過氧化最重要的產物是MDA[21],通過MDA含量的變化可了解膜脂質過氧化的程度,其含量的高低間接表達出細胞損傷的程度。本試驗中,35 mg/kg 和70 mg/kg CdCl2處理組中雛雞肝臟MDA含量顯著高于空白對照組(P<0.01),表明急性鎘染毒促進肝臟脂質的過氧化,這與何亞蘭等[20]、Andjelkovic等[22]的研究結果一致。

炎癥細胞因子參與并介導炎癥反應,是通過一系列化學因子的作用來實現的,主要直接損傷血管內皮,導致血管通透性增加,使肝臟內的單核細胞釋放出大量IL-6、IL-1β、TNF-α等其他有關炎癥因子[23],引起體溫升高、疼痛、白細胞滲出、血管擴張、通透性增加、過敏反應等主要炎癥反應,嚴重的可導致多組織器官急性衰竭或死亡等。肝臟作為清除和產生細胞因子的主要場所,炎癥反應會影響相關炎癥因子的代謝作用,對細胞因子的清除作用減弱,而使血清中的細胞因子增多。本試驗結果表明,35 mg/kg CdCl2組和70 mg/kg CdCl2組雛雞血清中IL-1β、TNF-α和IL-6均呈現顯著增加(P<0.01),說明鎘進入體內到達肝臟造成機體產生損傷,引起組織中的單核巨噬細胞產生大量的細胞因子,細胞因子在肝臟內進行細胞免疫調節反應,誘導急性期反應蛋白產生,從而引起肝臟組織發生炎性反應[24],同時伴隨臨床癥狀的出現。

綜上,肝臟作為急性鎘中毒重要的靶器官之一,進入機體內可以使肝臟的抗氧化系統遭到破壞,體內脂質代謝增加,進而造成肝臟的氧化損傷。本試驗對于重金屬鎘暴露的機制研究提供試驗數據支持,為更好地預防家禽肝臟鎘中毒提供了參考。