一種極性依賴性雙光子溶酶體熒光探針的合成及性能

王碧玉, 劉成露, 徐奧瓊, 馮可心, 李龍春

(安徽農業大學 理學院,安徽 合肥 230036)

具有雙光子吸收性能的有機熒光探針在光限幅、三維微加工、光學傳感和生物顯微成像等領域有著廣泛的應用。在生物學領域,有機熒光探針具有極高的空間分辨率和較大的組織穿透深度[1-5]。然而,用于熒光顯微成像的雙光子材料需要有較大的有效雙光子吸收截面、較高的生物相容性和優秀的生物體內底物選擇性[6-9]。因此,設計合成具有較大有效雙光子吸收截面、具有良好生物相容性和特定底物選擇性的有機熒光探針是深入拓展有機雙光子吸收材料在生物學領域應用的關鍵[10-13]。

極性是微環境中的一種重要參數,一些特定的無機或有機反應均依賴于極性的參與[14]。在生物系統里,尤其在細胞層面上,極性決定了大多數蛋白質和酶的聯系并影響了各種細胞器膜組分的通透性。極性的穩定是保持細胞正常增殖、分化、代謝和功能活動的重要條件,而極性的異常變化通常會導致一些疾病的產生[15-17]。

近年來,熒光探針成為了一種非常流行的生物傳感和生物成像技術,在生物醫學領域中發揮著十分重要的作用。萘酰亞胺及其衍生物作為一種性能良好的熒光團,具有熒光量子產率高、斯托克斯(Stokes)位移大、光學性質穩定和對溶液pH不敏感等優點[18-19]。特別地是,萘酰亞胺及其衍生物還具有結構上易于修飾的特點[20-22]。

因此,本文以4-溴-1,8-萘二甲酸酐為原料,通過脫水酰胺化反應引入N,N-二甲基基團,4號位上通過Sonogashira偶聯反應引入對甲氧基苯乙炔,從而增加萘酰亞胺熒光團的共軛體系,構建成以甲氧基為電子給體(Donor)、酰胺基為電子受體(Acceptor)且具有D-π-A結構的熒光探針分子Lyso-LCL(圖1),該探針具有分子內電荷轉移(Intermolecular Charge Transfer, ICT)機制[23-24]。同時研究在不同極性溶劑中探針Lyso-LCL的紫外吸收光譜、熒光發射光譜和雙光子熒光光譜,并對它的有效雙光子吸收截面進行了計算。在此基礎上,進一步對探針Lyso-LCL進行了3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(氮藍四唑,MTT)[25]和溶酶體的靶向功能分析。

圖1 Lyso-LCL的合成路線Figure 1 Synthesis route of Lyso-LCL

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Angilent 600 MHz型核磁共振儀[CD3Cl為溶劑,四甲基硅烷(Tetramethysilane, TMS)為內標]; TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計; Hitachi FL-7000型熒光光譜儀;Coherent Mira 900 F型鈦寶石激光器; Waters Q-TOF Premier型質譜儀; OLYMPUS FV 1000型激光共聚焦顯微鏡。

4-溴-1,8-萘二甲酸酐、2-(對二甲基氨基苯基)乙胺、無水乙醇、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、三乙胺、碘化亞銅、三苯基膦二氯化鈀、對甲氧基苯乙炔、無水硫酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸和二氯甲烷均為分析純試劑,阿拉丁試劑有限公司;1,4-二氧六環(1,4-Dioxane)、乙酸乙酯(Ethyl acetate)、四氫呋喃(Tetrahydrofuran, THF)、正己醇(n-Hexanol)、甲基異丙基甲酮(Methylisopropylketon, MIPK)、二甲亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、乙腈(Acetonitrile)和甲醇(Methanol)均為色譜純試劑,北京安耐吉試劑公司。

1.2 化合物1的合成

稱取4-溴-1,8-萘二甲酸酐2.75 g(10.00 mmol)置于100 mL潔凈干燥的圓底燒瓶中。加入50 mL無水乙醇攪拌溶解完全,再加入2-(對二甲基氨基苯基)乙胺1.80 g(11.00 mmol),在80 ℃下回流反應。待有固體析出后,繼續反應一段時間,有大量固體析出時停止反應,冷卻至室溫,旋去乙醇,真空干燥,最終得到無色固體化合物13.58 g(8.50 mmol),產率85%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.66(d,J=7.3 Hz, 1H), 8.57(d,J=8.5 Hz, 1H), 8.42(d,J=7.8 Hz, 1H), 8.04(d,J=7.8 Hz, 1H), 7.85(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.24(d,J=8.3 Hz, 2H), 6.72(d,J=8.3 Hz, 2H), 4.36～4.31(m, 2H), 2.93(s, 2H), 2.91(d,J=7.1 Hz, 6H);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ: 163.44, 149.43, 133.18, 131.94, 131.10, 130.65, 130.15, 129.58, 129.03, 128.04, 126.70, 123.20, 122.33, 113.02, 42.24, 40.81, 33.24; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C22H19BrN2O2{[M+H]+} 423.0708, found 423.0690。

1.3 探針Lyso-LCL的合成

在氮氣保護條件下,向150 mL潔凈干燥的Schlenk瓶中加入化合物11.26 g(3.00 mmol)、對甲氧基苯乙炔0.48 g(3.60 mmol)、三苯基膦二氯化鈀21.00 mg(0.03 mmol)、碘化亞銅17 mg(0.09 mmol)、三乙胺0.36 g(3.60 mmol)和30 mL NMP。 80 ℃條件下磁力攪拌反應10 h。待反應結束后,冷卻至室溫,并轉移至分液漏斗中,用二氯甲烷萃取,旋干溶劑,加入柱層析硅膠制樣,用柱色譜分離(洗脫劑:石油醚 ∶乙酸乙酯=3 ∶1,V∶V)得到淡黃色固體Lyso-LCL0.85 g,產率60%;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.73(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.64(d,J=7.0 Hz, 1H), 8.55(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.92(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.83(t,J=7.8 Hz, 1H), 7.61(d,J=8.7 Hz, 2H), 7.27(s, 2H), 6.95(d,J=8.7 Hz, 2H), 6.75(s, 2H), 4.37～4.32(m, 2H), 3.87(s, 3H), 2.95(s, 2H), 2.93(s, 6H);13C NMR(150 MHz, CDCl3)δ:163.89, 163.62, 160.56, 133.48, 132.42, 131.51, 130.36, 129.65, 128.11, 127.25, 123.01, 121.75, 114.31, 99.53, 85.35, 55.37, 42.17, 33.31, 29.65; HR-MS(ESI)m/z: calcd for C31H26N2O3{[M+H]+}475.2021, found 475.2006。

1.4 性能測試

Lyso-LCL母液用色譜純DMSO配制,濃度為1 mM(1×10-3mol·L-1),測試樣品的濃度為5 μM(5×10-6mol·L-1)。所用樣品池為1.0 cm×1.0 cm石英比色皿。熒光發射光譜的狹縫寬度為2.5 nm×2.5 nm,測試電壓為400 V,測試溫度為室溫。雙光子熒光光譜的測試以760 nm的飛秒激光為激發光源,入射能量為0.5 W,測試濃度為1 mM(1×10-3mol·L-1)。

2 結果與討論

2.1 探針Lyso-LCL在不同溶劑中的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜

首先,本研究測試了Lyso-LCL在不同溶劑(1,4-二氧六環、乙酸乙酯、四氫呋喃、正己醇、甲基異丙基甲酮、二甲亞砜、乙腈、甲醇和水)中的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜,結果如表1和圖2所示。從圖2(a)可知,在不同溶劑中,當溶劑的極性從1,4-二氧六環(極性很小,δ:≈0.0205)依次增大到水(極性很大,δ:≈0.3212)時,Lyso-LCL的最大紫外吸收峰在390～400 nm之間,只發生了微小的變化。然而,從圖2(b)可以看出,Lyso-LCL熒光發射峰隨溶劑極性的增大而發生紅移,其中,在極性較弱的1,4-二氧六環(468 nm)、乙酸乙酯(487 nm)等溶劑中,發射較強的藍色熒光;而在中等強度極性的甲基異丙基甲酮(518 nm)、二甲亞砜(525 nm)等溶劑的中,發射較強的綠色熒光;在強極性溶劑水(550 nm)中,發射較弱的黃綠色熒光。強極性溶劑的熒光發射峰相對于弱極性溶劑發生了約82 nm的紅移。無論是強極性溶劑還是弱極性溶劑中,都有較大的Stokes紅移,最大紅移為149 nm。同時,Lyso-LCL在弱極性的溶劑中具有很強的熒光發射峰,而在強極性的溶劑甲醇和水中,其熒光發射峰相對強度較弱,例如1,4-二氧六環的熒光強度是水的72倍。上述結果表明,探針Lyso-LCL體現出良好的溶劑極性響應能力,主要原因是以甲氧基為電子給體(Donor),酰胺基為電子受體(Acceptor),形成了具有D-π-A的電子結構。當包裹在Lyso-LCL探針分子周圍的溶劑分子的偶極矩發生變化時,由于分子各部分對偶極矩變化的敏感程度不同,分子骨架會發生輕微的扭轉,分子的供吸電子能力發生變化,在分子內電荷轉移ICT機理的作用下,Lyso-LCL分子在極性溶劑中能量大大降低,導致熒光光譜紅移,同時非輻射過程增強,熒光強度也大大下降。這些數據表明探針Lyso-LCL對不同溶劑的極性十分敏感,能夠對不同溶劑極性的變化做出響應,可以作為一種檢測極性的探針。

表1 Lyso-LCL在不同溶劑中的光譜性質*Table 1 Spectral properties of Lyso-LCL in various solvents

λ/nm

2.2 Lyso-LCL在四氫呋喃-水混合溶劑極性體系中的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜

為了進一步證明Lyso-LCL溶劑極性響應能力,本文選取了2種互溶溶劑,一種為相對弱極性溶劑THF,另一種為強極性溶劑水,并測試了Lyso-LCL在不同含水量的THF-H2O混合溶劑的紫外-可見吸收光譜和熒光發射光譜。如圖3和表2所示,隨著水體積分數逐漸增大,紫外吸收峰沒有發生明顯變化,基本穩定在400 nm。極性的變化對Lyso-LCL的紫外吸收光譜基本沒有造成影響。然而,隨著混合溶劑中水含量的增加,混合溶劑的極性隨之增加,Lyso-LCL的最大熒光發射峰逐漸發生了紅移,含水量為10%(δ:≈0.2559)時,熒光發射峰為506 nm,而含水量為80%(δ:≈0.3131)時,熒光發射峰為541 nm,紅移了35 nm。此外,隨著含水量的增加,Lyso-LCL熒光發射強度也逐漸減弱,并在紅移的過程中熒光強度下降了約27倍(圖4)。這些數據表明Lyso-LCL的熒光強度與極性變化的線性關系良好,且能夠規律地對溶劑極性變化作出響應,能夠作為一個良好的極性熒光探針。

表2 Lyso-LCL在四氫呋喃-水混合溶劑中的的光譜性質Table 2 Spectral properties of Lyso-LCL in THF-H2O mixed solvents

λ/nm

ΔF圖4 Lyso-LCL在不同體積分數的四氫呋喃-水混合溶液中的最大熒光強度與溶劑極性參數δ: 的線性關系Figure 4 Linearity of Imax versus the solvent parameter δ: of Lyso-LCL in THF-H2O mixed solvents with different volume percents

2.3 Lyso-LCL的雙光子驗證及有效雙光子吸收截面

Lyso-LCL的有效雙光子吸收截面采用參比法測定[26],采用1.0 mM的熒光素NaOH水溶液進行實驗,其中NaOH濃度以1 nM作為參比。熒光素的熒光量子產率為0.95,其不同波長雙光子吸收截面值可查文獻[27]。根據計算,得到Lyso-LCL在激發光波長740～940 nm之間。入射能量為0.5 W 時,四氫呋喃溶液中的有效雙光子吸收截面值如圖5(a)所示,Lyso-LCL在820 nm飛秒激光的激發下,具有最大的有效雙光子吸收截面126 GM。為了進一步驗證Lyso-LCL在四氫呋喃溶液中產生的熒光來自樣品的雙光子吸收效應,本文將波長設定為800 nm,通過改變入射激光的能量(0.3～0.8 W),測試了四氫呋喃為溶劑的Lyso-LCL在不同入射光強度下的雙光子熒光光譜,結果發現,熒光輸出能量(Iout)和輸入能量(Iin)之間有很好的平方關系,如圖5(b)所示(線性斜率為1.99,R2=0.9967),且符合雙光子性質的規律,說明Lyso-LCL具有雙光子吸收性質,并可以發射雙光子誘導熒光。

λ/nm

2.4 Lyso-LCL的細胞毒性測試分析

細胞毒性是化合物應用于活體細胞或組織時必須研究的基本生物學性能。因此需要對Lyso-LCL細胞毒性進行初步研究。實驗采用MTT測試法,選用的細胞為Hela細胞,結果如圖6所示。由圖6可以看出,Hela細胞在加入Lyso-LCL培養24 h后,隨著化合物濃度的增加,細胞存活率逐漸降低。當濃度為5 μM時,細胞存活率可以達到96%。然而當濃度為20 μM且培養24 h后,細胞存活率仍然可以達到85%。這些數據表明Lyso-LCL具有較低的細胞生物毒性,因此,可以進行包括細胞成像等生物學方面的應用研究。

Concentration/μM圖6 Lyso-LCL的細胞毒性MTT測試Figure 6 MTT assay of cells cytotoxicity of Lyso-LCL

2.5 Lyso-LCL的細胞溶酶體靶向共定位實驗分析

在細胞培養皿中加入5 μM探針Lyso-LCL和0.5 μM的溶酶體染料Lyso Tracker Red,并置于37 ℃恒溫且含有5% CO2和95%空氣的無菌培養箱中培養45 min。接著,用滅菌后pH=7.4的10 mM PBS緩沖溶液清洗3次。最后進行溶酶體靶向共定位雙光子熒光顯微成像實驗。本實驗使用的成像儀器是蔡司710共聚焦熒光顯微鏡,雙光子光源采用的是鎖膜鈦藍寶石激光光源,獲得的Hela細胞溶酶體靶向共定位照片如圖7所示。

圖7(a)為Lyso-LCL的熒光發射通道1(530±20 nm),雙光子激發波長為820 nm。圖7(b)為溶酶體商染(Lyso Tracker Red)的熒光發射通道2(600±10 nm),激發波長為559 nm;圖7(c)為明場,分別為通道1和通道2的疊加圖以及通道1、通道2和明場的疊加圖。從圖7(f)的熒光共聚焦成像可以探針Lyso-LCL與Lyso Tracker Red在Hela細胞里的共定位情況,共定位系數為0.93。這些結果說明探針Lyso-LCL與溶酶體商染Lyso Tracker Red在活細胞中溶酶體上的重疊效果很好,探針Lyso-CL可以很好地靶向于細胞溶酶體。

本文以4-溴-1,8-萘二甲酸酐為原料,構建具有D-π-A結構的熒光探針分子Lyso-LCL,該探針具有分子內電荷轉移機制。探針Lyso-LCL的光譜研究表明:隨著溶劑極性的增大,探針的熒光發射峰發生明顯紅移,且熒光強度下降。Lyso-LCL對不同溶劑的極性十分敏感,能夠對不同溶劑極性的變化做出響應,可以作為一種檢測極性的探針。同時,Lyso-LCL還具有雙光子吸收性質,并可以發射雙光子誘導熒光。在820 nm處,具有最大的有效雙光子吸收截面為126 GM。探針Lyso-LCL具有低毒性,可成功靶向于溶酶體,與溶酶體商品化染料的共定位系數高達0.93。因此,Lyso-LCL可作為新型的極性熒光探針,用于細胞溶酶體靶向成像。