黃芩苷通過PDGF/P38 MAPK 信號通路對肺動脈高壓大鼠的保護作用

張晶晶， 王洪新*

錦州醫科大學心血管藥物重點實驗室，遼寧 錦州 121001

肺動脈高壓（pulmonary hypertension，PH）被定義為靜息狀態平均肺動脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）≥25 mmHg[1]。肺部炎癥、氧化應激和凋亡等發生，使得肺動脈壓力異常增高，進而出現細胞增殖和病理性肺血管重構。P38 MAPK 作為重要的炎癥分子，其磷酸化后可加速細胞凋亡發生，在PH發展中發揮重要作用[2]。研究表明，與健康成年人相比，PH 患者肺組織中血小板源生長因子（plateletderived growth factor，PDGF）水平顯著升高；PDGF 可促進平滑肌細胞增殖、遷移，進而加速PH 進程[3]；PDGF 通過激活P38 MAPK 途徑誘導上皮-間質轉化發生[4]。黃芩苷（Baicalin）作為黃芩的主要活性成分之一，具有抗動脈粥樣硬化、保護心肌細胞和內皮細胞、抑制心肌重塑等藥理作用[5]。黃芩苷可逆轉野百合堿（monocrotaline，MCT）誘導的肺動脈高壓大鼠的肺動脈重構，并抑制肺動脈中膜平滑肌細胞增殖[6]，黃芩苷還可通過增強A2AR 活性下調PI3K/AKT 信號對臨床PH 具有保護作用[7]。但黃芩苷對肺動脈高壓的保護作用機制尚不明確。本研究以PDGF/P38 MAPK 信號通路為作用靶點探討黃芩苷對PH 的保護作用和具體機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 黃芩苷購自南京景竹生物科技有限公司（貨號：21967-41-9），抗體bax，bcl-2 購自愛博克生物科技公司（貨號：A19684，A11025），二氫乙錠染色液購自碧云天生物科技公司（貨號：S0063），總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒購自南京建成生物技術有限公司（貨號分別為：A001-3-2、A003-1-2），β-actin 抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司（貨號：66009）。

1.1.2 實驗動物 健康雄性SD 大鼠40 只，體質量（200±10）g，由錦州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（遼）2014-0004。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 將40 只健康雄性SD 大鼠隨機分為4 組：空白對照組（Control group）、模型組（Model group）、黃芩苷50 mg/kg 組（baicalin low-dose group）和黃芩苷100 mg/kg 組（baicalin high-dose group）。通過單次腹腔注射MCT（60 mg/kg）建立肺動脈高壓模型。黃芩苷用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）助溶，連續灌胃28 d，對照組0.5% CMC-Na 灌胃28 d。

1.2.2 右心導管法 通過對大鼠右頸靜脈插管，采用多導生理記錄儀進行數據采集，測定右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）和肺動脈平均壓（mean pulmonary arterial pressure，mPAP）。將左心室壁（left ventricle，LV）、室間隔（spetum，S）和右心室壁（right ventricle，RV）稱重，RV/（LV+S）即為右心肥厚指數（RVIH）。取左肺上葉用濾紙吸干水稱重，為濕重（wet weight，W），放入烘箱80 °C 烘干72 h 稱重，為干重（dry weight，D），W/D 即為肺干濕重比。

1.2.3 ELISA 法 按照ELISA 試劑盒說明書，測定大鼠血清中總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、GSH-px、細胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、IL-8 和IL-1β 含量。

1.2.4 DHE 染色法 根據DHE 試劑盒說明，檢測大鼠肺組織肺組織活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成情況。

1.2.5 免疫熒光法 4%多聚甲醛固定肺組織，經石蠟包埋和切片后，進行高壓抗原修復，0.5% Triton 浸泡20 min，5% BSA 封閉30 min。予以bax（1：500）和bcl-2（1：100）4 ℃孵育過夜，過夜后滴加相應熒光二抗，在熒光倒置顯微鏡下觀察（避光），通過Image-Pro Plus 軟件計算，平均熒光強度（mean density）=光密度總和（integrated optical density，IOD）/面積總和（area of interest，AOI）。

1.2.6 免疫蛋白印跡法 用裂解緩沖液（RIPA+1%PMSF）提取大鼠肺組織的蛋白。蛋白濃度用BCA蛋白檢測試劑盒進行測定。將樣品用10%～12%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）分離，轉移至PVDF 膜上，用1% BSA 封閉1.5 h，然后與抗體P38 MAPK，PDGF 和β-肌動蛋白在4 ℃過夜孵育。用TBST 洗滌膜3 次，室溫下二抗孵育2 h，結果用Image-J 軟件進行分析。

1.3 統計分析

2 結果

2.1 黃芩苷對PH 大鼠血流動力學改善情況

與空白對照組比較，模型組大鼠mPAP、RVSP、RVHI 和W/D 顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠mPAP、RVSP、RVHI和W/D 顯著降低（P＜0.01）（表1）。表明黃芩苷能夠改善PH 大鼠血流動力學情況以及降低干濕重比值。

表1 黃芩苷對PH 大鼠血流動力學影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on hemodynamics in rats with PH (Mean±SD, n=6)

表1 黃芩苷對PH 大鼠血流動力學影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of baicalin on hemodynamics in rats with PH (Mean±SD, n=6)

注：##P＜0.01，與空白對照組比較** P＜0.01，與模型組比較Note: Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group，**P＜0.01）.

W/D分組Group mPAP（mmHg）RVSP（mmHg）RVHI 3.32±0.23 5.72±0.41##4.37±0.32**4.15±0.17**空白對照組Control group模型組Model group黃芩苷（50 mg/kg）Baicalin low-dose group黃芩苷（100 mg/kg）Baicalin high-dose group 20.33±0.43 40.23±2.48##33.30±2.91**30.27±1.51**21.31±0.31 42.51±3.22##32.31±2.60**29.21±1.43**0.16±0.21 0.58±0.01##0.43±0.03**0.37±0.13**

2.2 黃芩苷減輕PH 大鼠炎癥反應

與空白對照組比較，模型組大鼠血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1 炎癥因子表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1炎癥因子表達水平降低（P＜0.01）（表2）。表明黃芩苷能夠減輕PH 大鼠炎癥反應。

表2 黃芩苷對PH 大鼠血情中炎癥因子影響（±s，n=8）Tab.2 Effects of baicalin on serum inflammatory factors in rats with PH (Mean±SD, n=8)

表2 黃芩苷對PH 大鼠血情中炎癥因子影響（±s，n=8）Tab.2 Effects of baicalin on serum inflammatory factors in rats with PH (Mean±SD, n=8)

注：##P＜0.01，與空白對照組比較**P＜0.01，與模型組比較Note: Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

VCAM-1(ng/mL)200.12±0.17 300.21±0.21##260.21±1.29**251.03±0.31**分組Group空白對照組Control group模型組Model group黃芩苷（50 mg/kg）Baicalin low-dose group黃芩苷（100 mg/kg）Baicalin high-dose group IL-18(pg/mL)10.21±0.21 17.25±0.35##13.21±0.28**12.01±0.21**IL-1β(pg/mL)20.21±0.18 37.11±0.19##32.29±0.29**31.09±0.27**ICAM-1(pg/mL)22.89±0.21 30.91±0.12##24.03±0.39**23.93±0.18**

2.3 黃芩苷抑制PH 大鼠氧化應激

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中ROS水平顯著升高（P＜0.01），血清中SOD 和GSH-px 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大 鼠ROS 水 平 顯 著 降 低（P＜0.01），血清中SOD 和GSH-px 表達水平顯著升高（P＜0.01）（圖1）。說明黃芩苷能夠抑制PH 大鼠氧化應激。

圖1 黃芩苷對PH 大鼠氧化應激影響（±s，n=6）A：各組大鼠肺組織ROS 形成情況B：各組大鼠肺組織ROS 統計學情況C：各組大鼠血清中SOD 含量D：各組大鼠血清中GSH-px 含量##P＜0.01，與空白對照組比較**P＜0.01，與模型組比較Fig.1 Effect of baicalin on oxidative stress in rats with PH (Mean±SD, n=6). A: ROS levels in lung tissues of rats in each group; B:ROS statistical results in lung tissues of rats in each group; C: SOD content in serum of rats in each group; D:GSH-px content in serum of rats in each group. Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

2.4 黃芩苷對PH 大鼠內皮細胞凋亡影響

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中bax 陽性細胞顯著增多，bcl-2 陽性細胞顯著減少，且bax/bcl-2 顯著增大；與模型組比較，黃芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠肺組織中bax 陽性細胞顯著減少，bcl-2 陽性細胞顯著增多，且bax/bcl-2 顯著降低（圖2）。說明黃芩苷能夠抑制PH 大鼠肺組織內皮細胞凋亡。

圖2 黃芩苷對PH 大鼠內皮細胞凋亡影響（±s，n=6）A：各組大鼠肺組織bax 免疫熒光染色B：各組大鼠肺組織bcl-2 免疫熒光染色C：bax 統計學情況D：bcl-2 統計學情況E：bax/bcl-2 統計學情況##P＜0.01，與空白對照組比較** P＜0.01，與模型組比較Fig.2 Effect of baicalin on apoptosis of endothelial cells in rats with PH (Mean±SD, n=6). A: Immunofluorescence staining of bax in lung tissues of rats in each group; B: Immunofluorescence staining of bcl-2 in lung tissues of rats in each group; C: Statistical result of bax; D: Statistical result of bcl-2; E: Statistical result of bax/bcl-2; Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

2.5 黃芩苷通過PDGF/P38 MAPK信號通路發揮作用

與空白對照組比較，模型組大鼠肺組織中PDGF和P38 MAPK 蛋白含量顯著降低，與模型組比較，黃芩苷（50 mg/kg 和100 mg/kg）大鼠肺組織中PDGF 和P38 MAPK 蛋白含量顯著升高（圖3）。表明黃芩苷可能通過PDGF/P38 MAPK 信號通路為靶點發揮作用。

圖3 黃芩苷對PDGF/P38 MAPK 信號通路影響（±s , n=3）A：免疫蛋白印跡檢測PDGF 和P38 MAPK 蛋白表達代表圖 B：各組大鼠肺組織P38 MAPK 相對表達量 C：各組大鼠肺組織PDGF 相對表達量 ##P＜0.01，與空白對照組比較** P＜0.01，與模型組比較Fig.3 Effects of baicalin on PDGF/P38 MAPK signaling pathway（Mean±SD, n=3）. A: Western blot detection of PDGF/P38 MAPK protein expression; B: The relative expression of P38 MAPK in lung tissue of rats in each group; C: The relative expression of PDGF in lung tissue of rats in each group; Compared with Control group, ##P＜0.01; Compared with Model group, **P＜0.01.

3 討論

肺動脈高壓（PH）是一種影響肺動脈和靜脈循環以及右心室功能的疾病[8]。本實驗通過單次腹腔注射MCT 建立大鼠肺動脈高壓模型，表明MCT 可選擇性地損傷內皮細胞誘導肺動脈高壓形成。PH 發生時，出現肺部炎癥、氧化應激和凋亡等，使得肺動脈壓力異常增高，進而出現細胞增殖和病理性肺血管重構。某些細胞因子和趨化因子，包括白介素IL-1β，IL-6，IL-8 和單核細胞趨化蛋白，其循環水平在PH 患者中異常升高[9]。另有研究表明，血清中細胞間粘附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）水平升高可能是系統性硬化癥合并肺動脈高壓的標志[10]。大量實驗表明，在肺動脈高壓發展過程中，機體氧化系統（ROS）與抗氧化系統（SOD 和GSH-px）的失衡，使得內皮細胞激活，致氧化應激發生，并加重內皮功能障礙、凋亡和平滑肌細胞增殖，進而使肺血管持續收縮，加重肺動脈壓力升高[11]。本實驗表明：黃芩苷給藥組大鼠中，mPAP、RVSP、RVHI 和W/D 顯著降低，說明黃芩苷能夠改善PH 大鼠血流動力學情況且降低肺干濕重比值；血清中IL-18、IL-1β、ICAM-1 和VCAM-1 炎癥因子水平顯著降低，說明黃芩苷能夠減輕PH 大鼠炎癥反應；肺組織中ROS 水平顯著降低，血清中SOD 和GSH-px 表達水平顯著升高，說明黃芩苷能夠改善PH 大鼠氧化應激；肺組織中bax 陽性細胞顯著減少，bcl-2 陽性細胞顯著增多，且bax/bcl-2 顯著降低，說明黃芩苷能夠抑制PH 大鼠內皮細胞凋亡。因此黃芩苷對野百合堿誘導的肺動脈高壓具有保護作用。

P38 MAPK 信號通路是MAPK 通路的重要分支，其作為重要的炎癥分子，磷酸化后可加速細胞增值、凋亡的發生，在PH 發展中發揮重要作用[12]。在PH 患者重塑的肺小動脈中表現出βPDGF 受體（βPDGFR）表達增強和磷酸化，PDGF 能夠誘導PH 中肺血管重構[13]。PDGF 還可促進平滑肌細胞增殖、遷移，進而加速PH 進程[14]。研究表明：辣椒素預處理能夠減輕P38 MAPK 途徑介導的PH 大鼠炎癥反應，逆轉PH 發展[15]。PDGF 通過激活P38 MAPK 途徑誘導上皮-間質轉化發生[4]。因此推測黃芩苷可能通過PDGF/P38 MAPK 信號通路為保護PH 的作用靶點。結果表明，黃芩苷治療后，野百合堿誘導的PH 大鼠肺組織中PDGF 和P38 MAPK 的蛋白含量顯著減少。進一步說明，黃芩苷可通過PDGF/P38 MAPK 信號通路對肺動脈高壓大鼠起保護作用。