鹽酸四環素長期暴露對序批式反應器性能、微生物酶活性及微生物群落的影響*

齊維毅, 王倩芝, 楚光玉, 陳文正, 張雨喬, 劉甲滕, 高 暢, 魯帥領, 高孟春**

(1. 中國海洋大學海洋環境與生態教育部重點實驗室, 山東 青島 266100; 2. 中國海洋大學環境科學與工程學院, 山東 青島 266100)

隨著水體污染和水體富營養化問題的日益突出,污水處理技術逐漸從過去以單一的有機物去除,轉變為碳、氮和磷的同步削減?；瘜W除磷具有良好的去除效果,現已在實際處理工程中普遍應用,而氮的去除仍需通過生物法。因此,生物脫氮工藝仍為當今污水處理領域的研究熱點之一[1]。傳統生物脫氮工藝主要包括硝化和反硝化過程,實際工程中,由于功能不同的微生物生理代謝特征具有差異性,為了彌補傳統生物脫氮工藝的不足,故衍生出序批式活性污泥法(Sequencing batch reactor,SBR)處理技術,SBR技術具有脫氮除磷效果好、抗沖擊能力強等特點,目前已在國內外獲得廣泛應用。SBR具有明顯的工藝優勢和廣闊的應用前景,穩定的生物活性是其優勢發揮的重要前提。溶解氧、溫度、pH值、有機負荷、進水碳氮比和含毒性物質(如抗生素和重金屬)等進水水質特征均會影響SBR活性污泥的微生物活性,進而影響其對污染物的去除性能[2]。

四環素類抗生素是一種廣譜抗菌劑,廣泛應用于醫學和畜牧業等行業。由于生物對其利用率較低,導致大量含四環素的醫療和養殖廢水進入污水處理廠。四環素類抗生素具有低揮發性和高度親水性的特點,在水環境中穩定性好,污水中殘留的四環素可誘導水處理系統中抗生素抗性細菌和基因的產生,對公共健康構成風險[3-4]。四環素類抗生素中,鹽酸四環素(TC)、土霉素和金霉素是最常用的[5]。其中TC是一種廣譜抗生素,能夠在核糖體水平抑制細菌蛋白質合成,進而影響革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的代謝水平和生理活性[6]。長期暴露于含TC的水環境中脫氮微生物會受到不利影響。水體中TC的濃度一般在1 ng/L到129.3 μg/L之間,在制藥廠排放的廢水中TC濃度可達到11.9 mg/L[7-8]。低濃度的TC對生物處理系統的影響較小,隨著TC濃度的不斷增加,生物系統所受的影響隨之增加。Maria Matos等[9]研究發現50 μg/L TC對硝化過程沒有明顯影響,而Chen等[10]研究發現0.2 mg/L的TC對生物脫氮的影響較小,且當TC濃度升高到2 mg/L時,反硝化過程受到明顯抑制,脫氮效果相應下降。Wang等[11]發現30 mg/L TC不同程度地降低了AMO、NOR、NR和NIR等脫氮相關酶的活性,并誘導了細菌TC抗性的外排泵和酶修飾機制。TC破壞微生物細胞膜完整性,誘導活性氧產生,增強了對微生物的毒性效應,從而抑制了脫氮相關的酶和功能基因的合成[12-13]。劉航[14]研究了TC長期作用對脫氮除磷功能菌的影響時,發現雖然痕量TC雖然不會顯著降低生物處理系統的微生物群落豐富度,但會降低微生物群落多樣性。Zhang等[15]研究了TC對活性污泥微生物群落和抗生素抗性基因的影響,發現在TC長期暴露下,Actinobacteria和抗生素抗性基因的豐度隨TC濃度增加而增加。

目前,多數研究集中于環境濃度(ng/L—μg/L)下TC對活性污泥性能的影響,實際工程中的TC濃度可能達mg/L水平,低濃度的TC不會對細菌產生明顯的抗性,但當TC濃度達到mg/L水平時,會導致抗性基因的產生和傳遞,從而影響污水處理系統的性能。因此,本研究考察了0.5 mg/L TC長期暴露對SBR活性污泥系統污染物去除性能、脫氮相關酶活性和微生物群落的影響,評價了0.5 mg/L TC對微生物的毒性,分析了活性污泥微生物抗氧化酶的響應特征,研究結果可為評估四環素類抗生素的環境風險提供理論依據。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗裝置及運行條件

本研究采用實驗室規模的SBR作為反應裝置,其由有機玻璃制成,直徑為14 cm,有效高度為50 cm,有效容積為7.7 L,容積交換比為50%。SBR的運行由時間繼電器控制,每天運行3個周期,每個周期包括5 min進水、300 min好氧曝氣、140 min缺氧攪拌、30 min沉降和5 min出水。進水由蠕動泵從反應器頂部的進水口泵入,空氣通過曝氣泵從反應器底部的曝氣頭通入。好氧階段SBR中溶解氧(DO)濃度在2～3 mg/L之間。在缺氧階段,采用磁力攪拌器對SBR中的污泥和廢水進行攪拌,DO濃度小于0.5 mg/L。

1.2 接種污泥及水質

本研究接種污泥取自青島市海泊河污水處理廠二沉池污泥,接種污泥濃度4 000 mg/L,進水根據生活污水人工配制,其具體組分如下(mg/L):CH3COONa(508.0);NH4Cl(158.0);KH2PO4(2.2);微量元素(1 mL/L)。進水COD和氨氮濃度分別為400 mg/L和40 mg/L。微量元素的組成如下(mg/L):H3BO3(1.0);AlCl3·6H2O(1.8);NiCl2·6H2O(1.8);MnSO4·H2O(1.0);CoCl2·6H2O(1.0);CuSO4·5H2O(1.0);ZnSO4·7H2O(1.0)。在加入TC之前,SBR系統經過11 d達到穩定狀態,從第12天開始,投加TC使進水中TC濃度為0.5 mg/L。

1.3 分析方法

2 結果與討論

2.1 TC長期暴露對SBR性能的影響

圖1 TC長期暴露對SBR性能的影響

2.2 TC長期暴露對微生物酶活性的影響

((a)AMO和NOR;(b)NR和NIR,“*”表示與未投加四環素的第11天相比具有顯著性差異(p<0.05),誤差線表示三次實驗測量值的標準差。(a)AMO and NOR activities,(b)NR and NIR activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial activity under long-term exposure of TC.)

2.3 TC長期暴露對微生物毒性及抗氧化酶的影響

TC長期暴露對微生物酶活性有明顯的抑制作用,因此,評價TC長期暴露條件下活性污泥受到的毒性及對微生物抗氧化酶的影響至關重要。ROS的生成量是評價微生物毒性的重要指標之一[20],當受到TC脅迫時,微生物內ROS增加,產生氧化應激反應,破壞活性污泥中微生物的細胞膜。ROS的相對產生量和LDH的相對釋放量如圖3(a)所示,在添加TC后,ROS的產量在第25天時增加了12%,表明TC使活性污泥細胞產生了輕微的氧化應激反應。與第25天相比,ROS在第42、57和70天時分別增加了32%、45%和62%,說明TC長期作用導致活性污泥產生更多的ROS,微生物的毒性增加。LDH是評價細胞膜完整性的重要指標[21],投加TC后第14天時,LDH釋放量顯著增加了19%,這說明TC破壞了細胞膜的完整性,投加TC后第31、46和59天時,LDH釋放量分別增加了68%、100%和168%,表明TC長期暴露導致細胞膜完整性嚴重受損,促進LDH產生,進而影響微生物對COD和氮的去除能力。SOD、CAT、POD、APX和GPX是重要的抗氧化酶,主要清除細胞內過量的活性氧,在維持活性氧平衡過程中發揮關鍵作用[22-26]。TC長期暴露對SOD、CAT、POD、APX和GPX活性的影響如圖3(b)所示,反應器運行第25天時,與第11天相比,SOD和GPX相對活性略有升高,CAT、POD和GPX相對活性明顯升高。SOD的相對活性在第42、57和70天分別增加了46%、76%和94%,CAT的相對活性分別增加了61%、70%和80%,POD的相對活性分別增加了73%、80%和85%,APX的相對活性分別增加了43%、59%、72%和93%,GPX的相對活性分別增加了73%、122%和230%,這說明TC長期暴露作用下,SOD、CAT、POD、APX和GPX的抗氧化機制均發生明顯變化。在本研究中,TC作用初期,CAT、POD和APX活性變化更大,說明CAT、POD和APX發揮更大的作用,隨著TC暴露時間的延長,SOD和GPX逐漸發揮更大作用,在消除活性氧方面,這些抗氧化酶相互協同補償,表明TC長期暴露影響了活性污泥整體的生理活動。

((a)ROS和LDH;(b)SOD,CAT,POD,APX和GPX,“*”表示與未投加四環素的第11天相比具有顯著性差異(p<0.05),誤差線表示三次實驗測量值的標準差。(a) Relative ROS activity and relative LDH release, (b) relative SOD, CAT, POD, APX and GPX activities. Asterisks indicate the statistical difference (p<0.05) from the microbial biotoxicity and antioxidants under long-term exposure of TC.)

2.4 TC長期暴露對微生物群落的影響

在第0、42和70天取SBR中活性污泥樣品,分別命名為S0、S42和S70。如表1所示,S0、S42和S70的Goods_coverage均為1,說明測序深度完全覆蓋了樣品的所有物種。Chao1指數和OTUs數目常用來表示物第70天時Chao1降低至710.8,OTUs數目從1 683降低至709,這表明TC長期暴露明顯降低了微生物豐富度。Pielou_e指數常用來表示物種的均勻度,在添加TC之后,污泥的Pielou_e指數逐漸降低,表明TC降低了物種的均勻度。Shannon和Simpson指數分別為9.313和0.995,樣品具有較高的多樣性和均勻度,在反應器運行第42天時,Shannon和Simpson指數分別降低至7.379和0.965,隨著TC暴露時間的延長,Shannon指數繼續降低至0.672,表明在TC長期暴露下,微生物群落的多樣性和均勻性均降低。

表1 四環素長期暴露對微生物群落的豐富度和多樣性指數的影響

((a)門水平;(b)屬水平。(a)Phyla level,(b)Genus level.)圖4 TC長期暴露下微生物群落在門和屬水平上的豐度

2.5 LEfSe分析TC長期暴露下微生物群落的差異物種

為了確定TC長期暴露下產生顯著性差異影響的物種類群,本研究進行了LEfSe分析,進一步比較了不同運行時間下起顯著作用的微生物。由內到外的圓圈分別表示從門到屬的分類級別,在圓圈上標記為不同顏色的節點表示發揮重要作用的微生物。如圖5(b)所示,在LDA閾值為4.0處出現41個生物標志物,包括4個門水平微生物、8個綱水平微生物、10個目水平微生物、10個科水平微生物和9個屬水平微生物,差異具有統計學意義(P<0.05)。Proteobacteria、Planctomycetota、Acidobacteriota和Acidobacteriota是污水處理廠污泥中的優勢微生物。在反應器運行第42天時,微生物在門和綱水平上沒有顯著性差異,在目水平上,Chitinophagales是S42中的標志微生物,而在科水平上,Saprospiraceae和Comamonadaceae是S42中的標志微生物。在屬水平上,Ahniella在接種污泥中發揮重要作用,而在0.5 mg/L TC長期影響下,在反應器運行第70天時,Zoogloea、Thauera、Dechloromonas和Candidatus_Competibacter成為了標志微生物,Zoogloea、Thauera和Dechloromonas均是參與反硝化作用的相關屬,說明在0.5 mg/L TC長期暴露下,這些屬具有較好的耐受性。以上結果表明在0.5 mg/L TC長期作用下,微生物群落具有顯著性差異。

((a)進化分枝圖,(b)LDA值分布柱狀圖。(a) A cladogram of the all samples,(b) The LDA score of the abundant biomarkers from all samples.)

2.6 鹽酸四環素長期暴露對微生物群落共現性的影響

本研究以接種污泥為對照,在微生物屬水平上構建網絡圖,確定了關鍵微生物。節點數量和平均節點相鄰數可以反映微生物網絡系統的復雜性和穩定性[41]。如表2所示,在S42中,節點數量和平均節點相鄰數分別為29和23.586,在S70中,節點數量和平均節點相鄰數分別為30和24.667,隨著反應器運行時間的延長,微生物網絡的穩定性逐漸增強。聚類系數和網絡密度可以反映網絡圖的重要性質,S70的聚類系數和網絡密度高于S42,說明在TC長期作用下,微生物之間的作用關系更加復雜。在網絡圖中,微生物之間存在著正相關和負相關,正相關表示微生物之間的合作行為,負相關表示微生物之間的捕食和競爭關系[42]。如圖6所示,TC長期暴露改變了微生物在生態位中的作用,在S42中,正相關的比例為46%,而在S70中,正相關比例為55%,這可能是因為在TC長期脅迫下,微生物間相互合作,以保持微生物系統的穩定性。網絡結構的改變可能導致微生物的變化,根據網絡拓撲結構確定了具有較高中心度的關鍵微生物。微生物網絡與生態系統功能緊密相關,在TC長期暴露下,SBR活性污泥的關鍵微生物存在顯著差異,當反應器運行至第42天時,SBR活性污泥中關鍵微生物包括Acidibacter、Thiothrix、JG30-KF-CM45、OLB14和Conexibacter,而在第70天時,SBR活性污泥中關鍵微生物包括Conexibacter、Sulfuritalea、RBG-13-54-9、Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella。Conexibacter能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽[43],Lei等[44]研究發現Conexibactersp. LD01可以以林可霉素作為唯一的碳源、氮源和能源生長。盡管S42和S70中關鍵微生物不一致,但Conexibacter在投加TC后第31—59天一直是反應器中的關鍵微生物,其在S0、S42和S70中的相對豐度分別為1.13%、0.26%和0.14%,雖然其在TC長期暴露下不是豐度最高的微生物,但Conexibacter仍然發揮著重要作用。Candidatus_Accumulibacter和Dokdonella分別是與生物除磷過程和反硝化過程相關的微生物,在TC長期暴露下,Candidatus_Accumulibacter的相對豐度逐漸升高,Dokdonella的相對豐度逐漸降低,關鍵微生物及其豐度的變化說明在投加TC后第59天時,反應器的脫氮除磷性能發生變化。雖然有些關鍵微生物在活性污泥中的相對豐度并不高,但之前的研究也發現低豐度的微生物可能在生物反應器中發揮重要作用[45]。因此,在今后的研究中,應更加關注關鍵微生物的作用,將關鍵微生物之間的相互關系和反應器性能聯系起來。

表2 TC長期暴露下的網絡拓撲特性

((a)運行時間從第0天至第42天,(b)運行時間從第0天至第70天,選擇了相對豐度前30的屬,藍色實線表示顯著正相關(r>0.85),紅線表示顯著負相關(r<-0.85),節點大小代表每個屬的豐度。(a) Operation time from Day 0 to Day 42, (b) Operation time from Day 0 to Day 70, the top 30 genera with relative abundances were selected. Blue solid lines represent significantly strong positive (r>0.85) linear relationships and red lines represent strong negative (r<-0.85) linear relationships. Node sizes represent the abundances of each genus.)

3 結語