外源氨基酸對廢棄煙草水熱液相香味產物的影響

岳先領，劉克強，關體青，聶紅資，朱鑫超，梁 淼，張峻松，姜 濤

（1.黑龍江煙草工業有限責任公司，黑龍江哈爾濱 150028；2.鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南鄭州 450001）

0 引言

煙草作為特殊的經濟作物在我國種植廣泛，其主要是被卷煙企業收購用于煙草制品生產，但在煙草的生產及加工過程中會不可避免地產生較多的廢次或不適用煙葉[1-3]。這些不適用煙葉的產生不僅耗用企業庫存，影響企業煙葉庫存循環和經濟效益，同時也是一種生物質資源的浪費[4-7]。圍繞不適用煙葉的資源化、價值化利用問題，國內外學者開展了廣泛研究，目前對低、廢次煙葉應用問題已有諸多研究，如用于制備再造煙葉、分離提取有效活性物質等[8-10]，為緩解資源浪費提供了方法。

近年來，利用水熱反應技術處理廢棄生物質是一種將其轉化為水熱焦及功能化學品的有效途徑，具有反應可控性好、樣品無需復雜預處理等優點[11-13]。Cai J 等人[14]利用水熱手段將煙草秸稈轉化為熱值較高的生物炭燃料；朱克明，劉燦等人[15-16]針對云南煙葉和秸稈原料，采用水熱法以乙醇為反應溶劑，經水熱液相產物萃取分離后獲取致香物質，這些研究為以廢棄煙草為底物的水熱反應香料制備提供了思路。

水熱反應條件下煙草溶出物間的美拉德反應是致香物質生成的主要因素之一，而通過外加氨基酸增加反應底物濃度，有望提升煙草水熱反應香料產率和香韻豐富性?；诖?，以廢次煙葉為原料，在外加脯氨酸和丙氨酸的條件下，考查外加氨基酸對煙草水熱反應液相產物的影響，為廢棄煙葉經水熱反應技術制備香料提供參考與借鑒。

1 試驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑：低次煙葉樣品（牡丹江，CSMA，2018），黑龍江煙草工業有限責任公司提供；脯氨酸、丙氨酸（分析純），上海麥克林生化科技有限公司提供；乙酸苯酯（純度＞99%），北京百靈威科技有限公司提供；二氯甲烷（色譜純），北京迪科馬科技有限公司提供；超純水，實驗室自制。

儀器：水熱合成反應釜，規格50 mL，北京星德儀器設備有限公司產品；DHG-9145A 型電熱鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；SHZ-D 型循環水式多用真空泵，鄭州利研儀器設備有限公司產品；8890/5977B 型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent 公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草基水熱液相產物的制備

將煙葉樣品粉碎，準確稱取2.00 g 樣品于盛水的反應釜中，料液比為1∶10，分別添加0.20 g 脯氨酸或丙氨酸，以不添加氨基酸組為對照樣品，反應釜加蓋密封，放入分別設定好溫度的電熱鼓風干燥箱中（溫度分別為低溫140 ℃，高溫220 ℃），水熱反應時間設定為2 h。

共設置6 個試驗組，分別編號為140-O（反應溫度140 ℃，無氨基酸引入）、140-P（反應溫度140 ℃，脯氨酸引入）、140-A（反應溫度140 ℃，丙氨酸引入）、220-O（反應溫度220 ℃，無氨基酸引入）、220-P（反應溫度220 ℃，脯氨酸引入）、220-A（反應溫度220 ℃，丙氨酸引入）制備煙草水熱液相產物，考查不同水熱溫度下，氨基酸引入對煙葉水熱液相香味產物的影響。

1.2.2 液相產物的檢測分析

采用半定量法定量，利用氣相色譜-質譜聯用儀對濃縮后煙葉水熱反應的液相香味產物進行檢測分析，明確液相產物組成及含量。

（1）內標溶液的配置。準確稱取0.25 g（精確至0.000 1）乙酸苯乙酯于1 000 mL 容量瓶中，以二氯甲烷為溶劑，定容至刻度，搖勻，配置成質量濃度為0.25 mg/mL 的乙酸苯乙酯內標溶液。

（2）產物的分離濃縮。待反應釜冷卻至室溫，將反應產物用三角抽濾漏斗抽濾（必要時可離心后抽濾），得液相產物。將液相產物轉移至250 mL 分液漏斗中，加入20 mL 二氯甲烷進行萃取，重復3 次，合并萃取液。

向萃取液中加入1 mL 內標溶液，于60 ℃條件下加熱濃縮至1 mL，過0.45 μm 有機過濾膜，待上樣分析。

1.2.3 GC-MS 分析條件

色譜柱：HP-5MS 毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度280 ℃，載氣為He，載氣流速1 mL/min，分流比為15∶1，升溫程序50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 的速率升至280 ℃保持15 min，傳輸線溫度280 ℃，電離方式為EI，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，掃描范圍為50～550 amu。

2 結果與分析

2.1 煙草水熱液相產物揮發性成分分析

煙草水熱反應液相產物總離子流圖見圖1，煙草水熱反應液相產物種類個數變化見圖2。

圖1 煙草水熱反應液相產物總離子流圖

圖2 煙草水熱反應液相產物種類個數變化

由圖1 和圖2 可知，不同反應條件下共檢測出包括酮類、醛類、醇類、雜環類等在內的81 種揮發性成分。試驗組140-O，140-P，140-A，220-O，220-P，220-A 中分別檢測出12，9，15，38，47，48 種。

煙草水熱液相產物主要揮發性成分分析結果見表1。

表1 煙草水熱液相產物主要揮發性成分分析結果

由表1 可知，反應溫度為140 ℃時，3 個試驗組（即140-O，140-P，140-A）所得產物揮發性成分種類相對較少，共有18 種，其中無氨基酸引入時有12 種，脯氨酸引入時有10 種，丙氨酸引入時為14 種。3-甲基環戊烷-1,2-二酮、糠醛、糠醇、9-羥基-4,7 -巨豆二烯-3 -酮等為其共有成分，前三者均為美拉德反應產物，后者更可能源于煙草自身香味物質的溶出。有研究表明[17]，3 -甲基環戊烷-1,2 -二酮可能由美拉德反應高級階段發生的2,3 -烯醇化反應產生，而糠醛、糠醇則通過1,2 -烯醇化反應產生。3 -甲基環戊烷-1,2 -二酮具有楓槭香、焦糖樣的甜香及堅果類香氣，含量分別為13.09，43.52，10.45 μg/g；糠醇及糠醛類物質則具有似焦糖、烘烤和甜香、面包香氣，其含量分別為35.01，135.38，32.77 μg/g。

水熱反應溫度為220 ℃時，3 個試驗組中共檢測出76 種有效物質，試驗組220-O，220-P，220-A中分別檢測出38，46，48 種揮發性成分，較140 ℃分別增加了26，36，34 種。其中共有物質19 種，相對于140 ℃，該反應溫度下新產生物質11 種，包括甲基環戊烯醇酮（MCP）、乙基環戊烯醇酮（ECP）、麥芽醇、3 -甲基吡啶等麥拉德反應產物[18]，以及苯酚、愈創木酚和異煙堿等。其中，酚類物質可能源于原料中木質素的降解[19]，異煙堿則是煙堿的降解產物。液相產物中的MCP 和ECP 具有類似堅果和楓槭樣的焦甜香味，220-O，220-P，220-A 反應條件下的含量分別為78.29，160.17，581.59 μg/g 和151.30，195.57，227.81 μg/g；麥芽醇則具有特征性的甜香氣息，各試驗組中含量分別為151.30，195.57，227.81 μg/g；愈創木酚具有明顯的煙熏與辛香，其含量為77.68，89.79，93.42 μg/g。

除上述較為典型的香味物質外，液相產物中香味物質中間體2,3 -二氫-3,5 二羥基-6 -甲基-4（H）-吡喃-4 -酮（DDMP）僅在140 ℃時可檢測到，可能是溫度較高時使其發生了降解。煙草特有物質煙堿在各試驗組產物中均被檢出，且其含量隨著溫度升高而增大，可能與較高溫度促進了煙堿的溶出有關。

2.2 不同種類及代表性香味成分變化分析

2.2.1 不同種類香味物質變化

將表1 中液相香味成分進行分類，對比分析反應溫度和外加氨基酸對各類香味成分變化的影響。

各試驗組煙草水熱液相各種類產物含量見圖3。

圖3 各試驗組煙草水熱液相各種類產物含量

液相產物中酮類香味物質在140 ℃時含量較低，其中外加脯氨酸和丙氨酸能夠增加酮類物質生成，由表1 可知，酮類物質多為環酮，外加脯氨酸和丙氨酸后酮類物質含量分別為377.72，241.84 μg/g。水熱反應溫度為220 ℃時，酮類物質含量顯著增加，平均含量為1 722.71 μg/g，平均增幅為632.82%，表明溫度是影響酮類物質生成的主要因素，且氨基酸種類對酮類物質含量有一定促進作用，各溫度下均以脯氨基酸引入時的酮類物質含量最高，其原因可能與木糖和脯氨酸共裂解機制類似[20]，脯氨酸的催化作用使得多糖類物質裂解反應所需活化能降低，促進了隨后的美拉德反應和酮類物質的產生。

反應溫度為140 ℃時，液相產物中幾乎無酚類物質產生，至220 ℃時始有酚類物質產生。外加脯氨酸和丙氨酸后酚類物質含量分別為322.01，308.36 μg/g，與空白組相比，其含量分別增加了36.44%和30.66%。表明溫度對酚類物質的產生有較大影響，氨基酸引入一定程度上也促進了酚類物質的產生。這可能與酚類物質產生的來源有關[21]，水熱反應中酚類物質主要由木質素在亞臨界水中逐漸降解產生，隨溫度升高和反應時間延長，木質素降解越完全，使酚類物質含量增加。

雜環類香味物質在140 ℃時幾乎不產生，外加脯氨酸和丙氨酸后分別產生了少量2 -甲基吡嗪和2,5 -二甲基吡嗪。當反應溫度提高至220 ℃，雜環類產物含量均明顯增加，空白試驗組220-O 從無至有增加了444.60 μg/g，外加脯氨酸和丙氨酸后分別增加了526.83 和1354.21 μg/g。這表明溫度的升高對雜環類產物的產生有較大影響，而氨基酸種類也會影響雜環類物質含量。其中，引入丙氨酸后雜環物質含量大大高于引入脯氨酸，主要為吡嗪類物質的大量增加，Amrani Hemaimi M 等人[22]的研究證實丙氨酸是吡嗪類物質的前體。Rizz G P[23]也認為α -氨基酸（丙氨酸為α -氨基丙酸），與酮類物質通過Strecker 降解，可產生吡嗪類物質。

綜合來看，反應溫度的提高與氨基酸的引入均能提高煙草水熱液相產物的含量，升高反應溫度可明顯增加各類產物含量，尤其是酮類、酚類與雜環類物質。脯氨酸引入主要增加產物中環酮類物質含量，同時胺類物質如N,N -二乙基苯胺含量明顯增加。丙氨酸引入主要提升了產物中雜環尤其是吡嗪類物質的含量，產生了2,5 -二甲基吡嗪、2,3 -二甲基吡嗪、2,3,5 -三甲基吡嗪等一系列吡嗪環物質。

2.2.2 代表性香味成分變化

以液相產物中香味物質的含量和香韻特征為依據，篩選12 種代表性香味成分，進一步分析了水熱反應溫度和外加氨基酸對其含量變化的影響。

代表性水熱液相產物含量變化見圖4。

圖4 代表性水熱液相產物含量變化

酮類物質中，MCP 僅在高溫反應條件下產生，3 -甲基環戊烷-1,2 -二酮在140 ℃時含量最低僅為43.52 μg/g，至220 ℃含量最高為629.43 μg/g，隨溫度升高，吡啶吡咯酮平均含量從15.40 μg/g 增加至86.66 μg/g，表明溫度提升有利于此3 種香味物質含量的增加。同時，外加脯氨酸能夠顯著增加此3 種物質的含量，可能是脯氨酸催化所致。而外加丙氨酸時生成的3 -甲基環戊烷-1,2 -二酮含量較低，可能是丙氨酸對該物質的生成有抑制作用。

醛類產物中，糠醛、5 -甲基呋喃醛和5 -羥甲基糠醛含量均隨反應溫度升高而增加，該類物質多由糖類物質降解反應產生，反應溫度升高促進了糖類物質的降解。外加氨基酸會降低這幾種物質的生成，如140 ℃反應條件下，引入脯氨酸和丙氨酸后糠醛的含量由62.38 μg/g 分別減少為15.41 和47.07 μg/g，可能與糠醛與氨基酸間的美拉德反應消耗底物有關[24]。

同時，氨基酸引入對苯酚、愈創木酚生成的含量影響較小。對于吡啶和2 -甲基吡嗪等雜環類香味成分而言，由于該類物質的形成主要發生在美拉德反應的最后階段[25]，由氨基化合物與羰基、醛的中間體反應產生，因此氨基酸引入可明顯提高二者含量。此外，液相產物中的煙堿含量隨溫度升高而增加，也因氨基酸的引入而增加。將所得液相香味產物進行卷煙加香感官評價，結果顯示試驗組220-P所得水熱液相產物加香效果最優，表現為降低卷煙刺激性，增加勁頭和香氣飽滿度。140-A 樣品可明顯增加焦糖香韻，醇和煙氣；220-O 樣品主要表現為增加卷煙焦糖烘烤香氣特征。

3 結論

通過引入外源氨基酸，研究了氨基酸引入對煙草水熱液化產物的影響，采用GC-MS 對產物進行分析，得出以下結論，140 ℃和220 ℃反應溫度下，煙草水熱液相產物中共檢測出包括酮類、醛類、醇類、雜環等在內的81 種揮發性成分，其中主要為美拉德反應產物及煙草自身溶出物，如糠醛、糠醇、5 -甲基呋喃醛和2 -甲基吡嗪等小分子雜環產物。液相產物中揮發性成分及含量隨反應溫度升高而增加，與高溫促進了降解反應及物質溶出有關；脯氨酸與丙氨酸通過參與美拉德反應提高液相產物含量，其中脯氨酸明顯提高酮類物質含量，丙氨酸則明顯提高雜環類尤其是吡嗪物質的含量。試驗組220-P，140-A 和220-O 所得液相產物卷煙加香效果較好，可明顯提升卷煙烘烤焦糖香，豐富煙香，進而提升卷煙感官品質。