肉桂醛納米乳的制備及體內藥動學評價

常格，牛霞，李桂玲

目的 構建肉桂醛納米乳（Cin-NE），以提高肉桂醛（Cin）穩定性、溶解度以及口服生物利用度。

方法 將 Cin 同時作為藥物和油相，以蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35）為乳化劑，構建 Cin 乳劑（Cin-E），稀釋后得到具有抗稀釋性的納米遞送系統—— Cin-NE，通過激光粒度儀對其粒徑和 PDI 進行檢測，采用 UPLC 對納米乳中肉桂醛含量進行檢測，以外觀性狀、粒徑和含量為指標，考察長期放置的 Cin-NE 的穩定性。此外，通過對 SD 大鼠進行口服灌胃給藥，研究該納米乳的口服吸收情況以及體內藥動學特征。

結果 將 Cin 載入納米乳中，顯著提高了藥物在水中的溶解度；Cin-E 中 Cin 含量為 90.9 mg/ml，其制備的 Cin-NE粒徑較小且分布均勻，在水、模擬胃液和模擬腸液中具有抗稀釋性；4 ℃ 下放置穩定性良好。SD 大鼠口服灌胃給藥的體內藥動學結果表明，Cin-NE 生物利用度是 Cin 原料藥的3 倍，可見納米乳顯著改善了 Cin 的口服吸收。

結論 成功構建了無需額外加入其他油相、無需助乳化劑、處方精簡、工藝簡單的 Cin 納米藥物遞送系統 Cin-NE，其穩定性、溶解度以及口服生物利用度顯著優于 Cin，為 Cin的臨床應用提供了有益的探索和啟示。

肉桂屬于樟科植物，原產于中國，是傳統的藥食同源植物。肉桂中化學組分繁多，存在大量揮發油類物質，通常被稱為肉桂油；此外還含有黃酮類、萜類、香豆素類、多糖等成分。肉桂油的主要成分為肉桂醛（cinnamaldehyde，Cin），含量最高可達90% 以上，是肉桂最重要的活性成分[1-2]。肉桂醛也被稱為桂皮醛，天然存在的肉桂醛均為反式結構，屬于天然苯并烯醛結構化合物，室溫為淡黃色油狀液體，并具有芳香氣味。

肉桂醛來源于天然植物，易于獲取，毒性極低，且已被證實具有多種顯著的藥理活性，包括抗炎、抗菌、抗癌以及抗糖尿病等特性[3-5]。但由于肉桂醛本身為油狀液體，水中溶解度極低，導致口服生物利用度差。此外，肉桂醛長期放置易被氧化。因此，肉桂醛作為藥物應用于臨床仍任重而道遠。通過構建肉桂醛的納米遞送系統，提高其穩定性、溶解度以及口服生物利用度，是增加肉桂醛成藥性的一種可行辦法。納米乳制備簡單，無需大量載體材料，載藥量高，毒性低且性狀穩定，可口服給藥。由于其結構中同時具有親水和親油區域，納米乳可顯著提高藥物溶解度，進而提高生物利用度[6]。由于肉桂醛室溫下為油狀液體，在作為藥物的同時，還可作為納米乳組分中的油相，能夠進一步精簡處方；且其制備方法簡單，易于工業化生產。因此，本文構建肉桂醛的納米乳遞送系統，并對其抗稀釋性、放置穩定性和體內藥動學進行了考察。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器 RTCbasic 磁力攪拌器為德國IKA 公司產品；ME303E 分析天平和 XS105 分析天平均為瑞士梅特勒-托利多儀器公司產品；Nano-ZS90 激光粒度及 Zeta 電位分析儀為英國馬爾文儀器有限公司產品；LC-2040C 3D MT 超高效液相色譜為日本島津公司產品；UPLC/MS/MS 系統，包括Xevo TQ-S 三重四極桿質譜儀、Acquity UPLC 均為美國 Waters 公司產品；SCI-VSv 渦旋振蕩器和 D3024R 高速冷凍離心機均為美國賽洛捷克公司產品。

1.1.2 實驗材料 肉桂醛、蓖麻油聚氧乙烯醚、吐溫80、胃蛋白酶均購自上海麥克林生化科技股份有限公司；聚氧乙烯氫化蓖麻油購自北京華威銳科化工有限公司；胰蛋白酶購自阿拉丁生化科技股份有限公司；肉桂酸、肉桂酸甲酯、氯霉素均購自南京源植生物科技有限公司；甲醇購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司。

1.1.3 實驗動物 SPF 級 SD 大鼠18 只，8 周齡，雄性，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008，在晝夜交替照明、恒溫恒濕環境中飼養 3 d，自由飲水進食。所有動物實驗均通過中國醫學科學院醫藥生物技術研究所動物實驗中心倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 Cin-E 處方篩選及 Cin-NE 的制備 首先，對肉桂醛乳劑的乳化劑種類及含量進行篩選。室溫條件下，稱取 600 mg 肉桂醛，分別以吐溫80、聚氧乙烯氫化蓖麻油（ethoxylated hydrogenated castor oil，RH）以及蓖麻油聚氧乙烯醚（EL-35）為乳化劑，乳化劑用量如表 1 所示，于 600 r/min轉速下混合均勻，獲得油相體系，然后將 5 ml 純凈水逐滴加入油相體系中，滴加過程保持轉速為600 r/min，持續攪拌 3 min，使之形成分散體系，觀察所得分散體系外觀。對外觀良好的處方進行進一步考察，取 20 μl 新制備的處方于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 純凈水進行稀釋，輕輕振蕩混勻，后立即采用激光粒度儀進行粒徑及 PDI 的測定。將制劑置于 4 ℃ 保存，于 7 d 后觀察外觀并再次進行粒徑測定，初步篩選出可制得均勻分布的Cin-NE 的 Cin-E 最佳處方。

表1 肉桂醛乳劑處方篩選Table 1 Prescription screening of Cin-E

1.2.2 Cin-NE 抗稀釋性研究 分別采用水、模擬胃液（SGF）以及模擬腸液（SIF）對 Cin-E 最佳處方進行抗稀釋性考察，探索 Cin-E 口服給藥后進入消化道形成納米乳的可行性。

1.2.2.1 SGF 和 SIF 配制

SGF：取鹽酸 384 μl 與 50 ml 水混合后，加入胃蛋白酶 1 g，混合均勻，加水稀釋至 100 ml，搖勻。

SIF：稱取磷酸二氫鈉 0.6 g，溶解在 50 ml 水中，用氫氧化鈉溶液調節 pH 至 6.8，加入胰蛋白酶 1 g，混合均勻，加水稀釋至 100 ml，搖勻。

1.2.2.2 Cin-NE 對水、SGF 及 SIF 的抗稀釋性研究 取 Cin-E 于 1.5 ml EP 管中，分別采用水、SGF、SIF 以 1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 的比例進行稀釋，輕輕振蕩混勻，后采用激光粒度儀進行粒徑測定。

1.2.3 Cin-E 及 Cin-NE 放置穩定性考察 室溫條件下，取 600 mg 肉桂醛于 5.8 ml 純凈水中，混合均勻，即得理論上總體系中 Cin 濃度與 Cin-E相同的非均相肉桂醛乳濁液（Cin-Water）。

取 20 μl 新制備的最佳處方 Cin-E 于 1.5 ml EP 管中，加入 1 ml 純凈水進行稀釋，輕輕振蕩混勻，即得 Cin-NE，后立即采用激光粒度及 Zeta 電位分析儀進行粒徑、PDI 及 Zeta 電位的測定。

取 Cin-E 和 Cin-Water 各 10 μl，前者加水制得 Cin-NE，然后將 Cin-NE 與 Cin-Water（吸取其中水相層）分別以甲醇稀釋至適宜濃度后，采用UPLC 法測定肉桂醛含量（流動相：60% 甲醇 -水，柱溫：30 ℃，流速：0.2 ml/min）。

將 Cin-E 和 Cin-Water 分別避光儲存于 25 ℃和 4 ℃ 條件下，考察兩者在不同環境下的放置穩定性，包括粒徑分布穩定性與藥物含量穩定性。

1.2.4 Cin-NE 在大鼠體內藥動學研究

1.2.4.1 藥品配制 室溫條件下，稱取 600 mg肉桂醛、600 mg 蓖麻油聚氧乙烯醚，于 600 r/min轉速下混合均勻，獲得油相體系，然后將 5 ml 純凈水逐滴加入油相體系中，滴加過程保持轉速為600 r/min，持續攪拌 3 min，使之自發形成均一分散體系，即 Cin-E。

室溫條件下，稱取 600 mg 肉桂醛，加入 5.8 ml橄欖油，在 600 r/min 轉速下攪拌 3 min，混合均勻，制得理論上肉桂醛濃度與 Cin-E 相同的油狀液體，作為肉桂醛原料藥的給藥形式。

1.2.4.2 分組、給藥與血樣采集 將雄性 SD 大鼠隨機分為 3 組，每組 6 只，分別為空白組、原料藥（Cin）組以及制劑（Cin-NE）組，于給藥前禁食不禁水 12 h?？瞻捉M大鼠不給藥，直接進行眼眶取血，置于 1.5 ml 肝素鈉 EP 管中；原料藥組和制劑組大鼠均以 250 mg/kg 劑量分別灌胃給予Cin 與 Cin-E（Cin-E 在消化道中被稀釋產生Cin-NE），并于給藥后 10、30 min、1、2、3、4、6、8、12、24 h 進行眼眶取血 200 μl，置于 1.5 ml肝素鈉 EP 管中。待血樣 4 ℃ 靜置分層后，于3000 r/min、4 ℃ 條件下離心 15 min，取上清液，即為血漿樣品，保存于 -80 ℃ 冰箱中備用，使用時于 4 ℃ 靜置融化。

表2 肉桂醛及其主要代謝產物質譜條件Table 2 Mass spectrometry conditions for cinnamaldehyde and its main metabolites

1.2.4.3 液質條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），Shim-pack GIST-HP(G) C18 預柱（2 μm）；流動相：[0.02 mol/L 醋酸銨-甲醇（95:5）]（A）-[0.02 mol/L醋酸銨-甲醇（5:95）]（B），梯度洗脫（0 ～ 2.5 min為 100% A，2.5 ～ 5 min 線性轉變為 100% B，5 ～8 min 維持 100% B，8 ～ 12 min 線性恢復為 100%A）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 ml/min。采用電噴霧離子源（ESI 源）；毛細管電壓：3 K；脫溶劑氣：500 ℃；其余質譜參數如表 2 所示。

1.2.4.4 標準曲線繪制

內標溶液：精密稱取 10 mg 氯霉素于 50 ml容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，得到內標貯備液。臨用時采用甲醇將貯備液稀釋 10 000 倍，得到濃度約為 20 ng/ml 的內標溶液。

對照品貯備液：精密稱取 10 mg 肉桂醛、10 mg肉桂酸、50 mg 肉桂酸甲酯于同一 50 ml 容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度。采用甲醇將上述溶液稀釋 5 倍作為 S1，然后倍比稀釋得到 S2 ～S11，即為對照品貯備液。

系列標準溶液：分別取上述不同濃度對照品貯備液（S1 ～ S11）10 μl，向其中加入 90 μl 空白血漿，渦旋混勻。然后，分別量取上述溶液 30 μl，向其中加入 90 μl 內標溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min，取上清液，作為系列標準溶液。

空白溶液：取 30 μl 空白血漿，加入 90 μl 內標溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min。取上清液，作為空白溶液。

分別精密量取空白溶液及系列標準溶液各70 μl，進行 UPLC/MS/MS 檢測，分別以肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的響應值對其濃度進行線性回歸，得到各自的標準曲線。

1.2.4.5 樣品處理及檢測 分別量取 1.2.4.2 項下的血漿樣品各 30 μl，向其中加入 90 μl 內標溶液，渦旋 5 s，14 000 r/min、4 ℃ 下離心 10 min。取上清液 70 μl，進行 UPLC/MS/MS 檢測，記錄各樣品中肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的響應值，用標準曲線方程計算其含量。

2 結果

2.1 Cin-E 的處方篩選

肉眼觀察不同乳化劑種類和用量的處方所得制劑外觀，處方 1 和處方 7 可見大量白色不溶顆粒，其余處方外觀良好，為均一乳白色液體。4 ℃ 放置 7 d 后，處方 4、8、9 外觀無明顯變化，其余處方均發生分層現象。對各處方樣品進行粒徑測定，結果如表 3 所示。處方 4 放置 7 d 后 PDI 過大，因此優選處方 8、9。處方 8 中 EL-35 含量更低，考慮載藥量與安全性，故選擇處方 8 作為Cin-E 的最佳處方，用于后續研究。

表3 肉桂醛乳劑不同處方粒徑分布Table 3 Particle size distribution of various CIN-E prescription

2.2 Cin-NE 抗稀釋性研究

Cin-E 在水、模擬胃液和模擬腸液中，以 1:20、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600 的比例稀釋后，均可形成粒徑分布均一的 Cin-NE（圖 1），表明 Cin-E 形成 CIN-NE 的抗稀釋范圍大，口服后可在消化道中被稀釋形成納米乳。

圖1 Cin-E 以不同比例水、模擬胃液和模擬腸液稀釋后所得 Cin-NE 粒徑Figure 1 The particle size of Cin-NE after dilution of Cin-E with different proportions of water, SGF and SIF

2.3 穩定性考察

新制備的 Cin-E 外觀為均一的乳白色液體，加水稀釋后為半透明液體，呈淡藍色乳光，即 Cin-NE（圖 2），粒徑為 188.1 nm，PDI 為 0.247，說明其粒徑在納米級，且粒徑分布均勻，Zeta 電位為-5.71 mV，帶負電（圖 3）；Cin 水中飽和溶解度＜ 1 mg/ml，Cin-E 中 Cin 含量為 90.9 mg/ml，極大提高了 Cin 水中溶解度。Cin-Water 為非均相油水混合物，總體系中 Cin 的濃度理論上與 Cin-E相同，由穩定性考察結果可知：Cin-Water 靜置后出現水油分離，水相中藥物含量急劇下降；Cin-E 放置后外觀良好，未見明顯分層，加水稀釋后制得的Cin-NE 藥物含量穩定性較 Cin-Water 明顯提升，且粒徑分布均一?？梢?，與 Cin-Water 相比，Cin-NE穩定性顯著提高。長期放置（365 d）后，4 ℃ 放置的 Cin-E 所得 Cin-NE 的粒徑、含量均較 25 ℃更加穩定，表現出良好的放置穩定性（圖 4、圖 5）。需要指出的是，Cin-E 在 25 ℃ 放置 170 ～ 210 d期間，其外觀性狀已發生明顯變化，肉眼可觀察到肉桂醛析出的現象，且 PDI 也顯著增大，此時的粒徑結果（粒徑下降）已不能準確反映體系的穩定情況。

圖3 Cin-NE 粒徑（A）和 Zeta 電位（B）分布圖Figure 3 Size (A) and Zeta potential (B) distribution of Cin-NE

圖4 25 ℃ 和 4 ℃ 貯存下 Cin-E 稀釋后所得 Cin-NE的粒徑變化Figure 4 Changes of particle size of Cin-NE obtained by diluting Cin-E storaged in 25 ℃ and 4 ℃ after long-term

圖5 25 ℃ 和 4 ℃ 貯存下 Cin-Water 和 Cin-E 中 Cin 含量變化Figure 5 Changes of Cin content of Cin-Water and Cin-NE storaged in 25 ℃ and 4 ℃ after long-term

2.4 Cin-NE 在大鼠體內藥動學考察

分別以 Cin 組和 Cin-NE 組血漿樣品中肉桂醛、肉桂酸、肉桂酸甲酯的濃度對時間作圖，得到這幾種成分的血漿濃度-時間曲線（圖 6、圖 7、圖 8）。由結果可見，肉桂醛口服吸收入血后迅速轉化為肉桂酸和肉桂酸甲酯，肉桂醛含量極低（圖 6），故通過血漿中肉桂酸和肉桂酸甲酯的含量變化對體內藥動學結果進行評估。

圖6 大鼠血漿肉桂醛含量變化Figure 6 Changes of plasma cinnamaldehyde content in rats

圖7 大鼠血漿肉桂酸含量變化（右圖為左圖虛線框內的放大）Figure 7 Changes of plasma cinnamic acid content in rats (The right image is an enlargement of the left dashed box)

圖8 大鼠血漿肉桂酸甲酯含量變化（右圖為左圖虛線框內的放大）Figure 8 Changes of plasma methyl cinnamic acid content in rats (The right image is an enlargement of the left dashed box)

Cin 原料藥在大鼠體內口服吸收極差，而Cin-NE 顯著增加了肉桂醛的口服吸收。Cin-NE 組SD 大鼠體內肉桂酸AUC是原料藥的 3 倍，Cmax較原料藥提高 3 倍，CLz/F 僅為原料藥的 1/3（表 4）；Cin-NE 組肉桂酸甲酯AUC是原料藥的2 倍，Cmax接近原料藥的 3 倍，CLz/F 顯著下降（表 5）。

表4 大鼠體內肉桂酸藥動學參數Table 4 Pharmacokinetic parameters of cinnamic acid in rats

表5 大鼠體內肉桂酸甲酯藥動學參數Table 5 Pharmacokinetic parameters of methyl cinnamic acid in rats

3 討論

Cin 作為食品中常用的天然香料成分，毒性極低且具有抗炎抗菌等多種藥理活性，具有很高的藥用價值。Cin 室溫下為淡黃色油狀液體，在水中溶解度低，口服生物利用度差，且易被氧化，長期放置穩定性差。因此，有必要通過構建 Cin 的納米藥物遞送系統提高其穩定性以及口服生物利用度。

本文利用 Cin 室溫為油狀液體的物理性質，以 Cin 原料藥自身作為油相，以 EL-35 為乳化劑，無需助乳化劑，成功制備外觀呈均一乳白色的Cin 乳劑——Cin-E，該乳劑稀釋后即得具有淡藍色乳光和抗稀釋性的 Cin 納米乳遞送系統——Cin-NE，經粒徑測定可知其粒徑在納米級，且粒徑分布良好。長期放置的 Cin-E 稀釋所得的 Cin-NE外觀性狀無明顯變化，粒徑仍然保持穩定，藥物含量穩定性較原料藥大幅提升，且在 4 ℃ 下的放置穩定性顯著優于室溫，表明 Cin-NE 的構建成功提高了肉桂醛的水中溶解度與放置穩定性。此外，通過對 SD 大鼠進行口服灌胃給藥，探究肉桂醛原料藥及其納米乳的體內藥動學特征，可知該納米乳顯著提高了肉桂醛的口服生物利用度，具有更高的AUC，Cmax以及更小的 CLz/F。

綜上可知，Cin-NE 的構建成功解決了肉桂醛原料藥穩定性差、水中溶解度低以及口服生物利用度差等問題，大大增加了肉桂醛的成藥性，對肉桂醛的臨床應用產生一定的推進作用。