二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th 缺失對典型TIL類蛋白酶抑制劑抑制活性和特異性的影響

魏 夢,王 圓,張照鋒,陳長清,李游山,4*

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院,陜西 漢中 723001;2.陜西理工大學 秦巴生物資源與生態環境省部共建國家重點實驗室(培育),陜西 漢中 723001;3.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室,陜西 漢中 7230012;4.陜西理工大學 陜南秦巴山區生物資源綜合開發協同創新中心,陜西 漢中 723001)

蛋白酶抑制劑通過結合蛋白酶或介導蛋白酶受體清除信號,從而抑制蛋白酶的活性[1].蛋白酶的主要作用是催化蛋白質和多肽的水解,其活性受到嚴格的調控.蛋白酶抑制劑在許多生理過程中起重要的調控作用,例如消化、凝血、細胞遷移、免疫調節、細胞凋亡、細胞分化、酚氧化酶級聯反應[2-7].蛋白酶抑制劑可分為絲氨酸蛋白酶抑制劑、半胱氨酸蛋白酶抑制劑、天冬氨酸蛋白酶抑制劑和金屬蛋白酶抑制劑[8-9].其中,絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類最多,對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和組織蛋白酶有抑制作用[10-12].絲氨酸蛋白酶抑制劑分為Serpin,TIL,Kunitz,Kazal等幾個家族[13],典型的TIL家族蛋白酶抑制劑代表有AmCI,AsATI,AsC/E-1,RmSI-7等,具有1個含10個半胱氨酸殘基的TIL結構域,組成5個二硫鍵橋,二硫鍵橋位置為1-7,2-6,3-5,4-10和8-9[12].少數TIL家族蛋白酶抑制劑的TIL結構域僅含有8個半胱氨酸殘基,組成4個二硫鍵橋,例如BmSPI38,BmSPI39,Cv T-TIL,MdbEgf0.4b,MdbEgf1.0,BmFPI-F等[14-17].TIL類蛋白酶抑制劑屬于經典類絲氨酸蛋白酶抑制劑,經典類抑制劑由14～200個氨基酸殘基組成,分子量為3～21 kDa.該類抑制劑均具有典型的結合環構象作用機制,抑制蛋白酶的作用片段稱為蛋白酶結合環,它與酶的活性部位以非共價鍵方式形成類似酶-底物的米氏復合物[18-19].

Bania等[12,20]從蜜蜂幼蟲血液中純化出一種TIL類蛋白酶抑制劑AmCI,該抑制劑分子量為5 972 Da,核磁共振結果顯示,AmCI的三級結構由2個近似垂直的β折疊片和無規則卷曲組成,其高級結構由5個二硫鍵來維持.AmCI不僅能強烈抑制胰凝乳蛋白酶,還能較強地抑制組織蛋白酶G,對彈性蛋白酶僅有微弱抑制活性[21].蛔蟲產生的蛋白酶抑制劑,可以使胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和羧肽酶失活,這些蛋白酶抑制劑的生理作用是保護蛔蟲不被宿主的消化酶降解[17,20-22].蛋白酶抑制劑可以在蛔蟲和卵表面與宿主蛋白酶形成復合物,進而保護幼蟲從腸道遷移到肝臟時可以免疫逃避[21-22].Goodman等[23]利用親和層析法從蛔蟲中分離純化出一種胰蛋白酶抑制劑,將其命名為AsATI.Peanasky等[24]從蛔蟲中純化到一種新的蛋白酶抑制劑AsC/E-1,該抑制劑能夠強烈抑制胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的活性,對枯草桿菌蛋白酶也有極微弱的抑制活性.進一步研究發現,AsATI和AsC/E-1皆含有1個TIL結構域,其高級結構由2個反向平行的β折疊片和無規則卷曲組成,其5個二硫鍵橋在維持抑制劑的三級結構中發揮著重要作用[25-26].

筆者研究發現,進化過程中家蠶蛋白酶抑制劑BmSPI38和BmSPI39中Cys2nd-Cys6th的缺失對其微生物蛋白酶抑制活性的獲得至關重要[27].迄今為止,已有天然純化的AmCI,AsATI和AsC/E-1對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶具抑制活性的報道,受限于蛋白表達、純化和活性檢測手段,人們對上述抑制劑的活性和生理功能的認識還十分有限.Cys2nd-Cys6th對典型TIL蛋白酶抑制劑AmCI,AsATI和AsC/E-1的抑制活性和抑制特異性的影響尚不清楚.筆者擬通過原核表達、定點突變和蛋白酶抑制劑膠內活性染色技術分析AmCI,AsATI和AsC/E-1對不同蛋白酶的抑制活性,探討Cys2nd-Cys6th對其抑制活性和抑制特異性的影響,以期為AmCI,AsATI和AsC/E-1的生理功能研究奠定基礎,并為TIL類蛋白酶抑制劑活性和特異性的定向改造提供依據.

1 材料與方法

1.1 材 料

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α購自上海昂羽生物技術有限公司;Origami 2(DE3)菌株、p28表達載體(pET28a改造而成)由陜西理工大學維生素D 生理與應用研究所保存;限制性核酸內切酶NdeI、NotI購自Takara公司;TransStartFastPfu,TransStartFastPfuFly DNA 聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司.胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、N-乙?；?D,L-苯丙氨酸-β-萘酯(N-acetyl-D,L-phenylalanine-β-naphthylester,APNE)、N,N'-二甲基甲酰胺、Fast Blue B Salt等購自Sigma公司;彈性蛋白酶購自生工生物工程(上海)股份有限公司.

1.2 方 法

1.2.1AmCI,AsATI,AsC/E-1基因合成和表達載體構建

下載AmCI(GenBank ID:XM_006563359),AsATI(GenBank ID:BU585713),AsC/E-1(GenBank ID:U94499)的CDS.通過在線網站(www.genscript.com)對AmCI,AsATI,AsC/E-1的編碼框進行密碼子優化,在生工生物工程(上海)股份有限公司進行基因合成.基于AmCI,AsATI,AsC/E-1的編碼區序列設計引物(表1),以AmCI-AsATI-AsC/E-1序列為模板,分別進行PCR擴增,擴增條件為:95℃預變性5 min;95℃變性30 s,61℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環;72℃再延伸10 min.PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離、割膠、酶切回收后,將目的片段連接到p28表達載體中,轉入大腸桿菌DH5α菌株,菌液PCR篩選獲得陽性克隆后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序.

表1 AmCI,AsATI,AsC/E-1表達載體構建所需引物

1.2.2 突變體表達載體構建

為了將AmCI,AsATI,AsC/E-1的TIL 結構域中的Cys2nd,Cys6th分別替換為Asp,Leu,針對Cys2nd,Cys6th位點設計定點突變引物(表2).提取AmCI-p28,AsATI-p28,AsC/E-1-p28重組表達質粒,并以其為模板,利用對應的定點突變引物、TransStartFastPfuDNA聚合酶或TransStartFastPfuFly DNA聚合酶進行PCR擴增,誘導目的基因突變.擴增條件為:95℃預變性2 min;95℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸3 min,18個循環;72℃再延伸10 min.PCR產物經純化和DpnI酶處理后,轉化大腸桿菌DH5α菌株,利用菌液PCR技術篩選陽性克隆,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序.將突變體表達載體分別命名為AmCI(C12D)-p28,AmCI(C32L)-p28,AsATI(C15D)-p28,AsATI(C33L)-p28,AsC/E-1(C14D)-p28,AsC/E-1(C33L)-p28.

表2 突變體表達載體構建所需引物

1.2.3 原核表達

將構建的重組表達載體轉化至Origami 2(DE3)表達菌株,在37℃,220 r·min-1條件下培養至菌體OD600為0.6～1.0時,加入IPTG至終濃度0.2 mmol·L-1,在16℃誘導表達20 h.6 000 r·min-1離心30 min收集誘導表達后的菌體,用結合緩沖液(20 mmol·L-1Tris-HCl,500 mmol·L-1NaCl,p H 8.0)重懸.菌體經過超聲破碎、離心,分離上清和沉淀,用16.5%SDS-PAGE進行分離,考馬斯亮藍染色.

1.2.4 蛋白酶抑制劑的膠內活性染色

將誘導表達的蛋白樣品與4×Native PAGE上樣緩沖液(40 mmol·L-1Tris-HCl,p H 8.0,40%甘油,0.032%溴酚藍)混合后,利用10%Native PAGE進行分離,然后進行膠內活性染色.蛋白酶抑制劑的膠內活性染色可參照[28-29]報道的方法.將電泳后的凝膠置于蛋白酶溶液中,37℃,45 r·min-1避光振蕩孵育30 min.回收蛋白酶溶液,用dd H2O清洗膠,然后37℃避光靜置30 min.按照1∶10的體積比加入基質液(200 mg APNE溶于100 m L N,N'-二甲基甲酰胺)和染色液(100 mg Fast Blue B Salt溶于100 mL 含20 mmol·L-1CaCl2,p H 8.0的100 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液)的混合液,37℃,45 r·min-1避光孵育15 min.棄掉染色液,加入dd H2O清洗膠面以終止反應.

1.2.5 三維結構模擬

在PDB中搜索AmCI(1ccv.1.A),AsATI(1atd.1.A)和AsC/E-1(1eai.1.C)序列作為模板,在SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模在線軟件構建AmCI,AsATI和AsC/E-1突變體的三維結構模型,使用QMEANDisCo對模型進行評估[30-32],QMEANDisCo值在0～1之間,數字越高表示可靠性越高.利用分子視圖軟件Py MOL顯示三維結構[33-34].

2 結果與分析

2.1 AmCI,AsATI,AsC/E-1的密碼子優化與基因合成

將AmCI,AsATI和AsC/E-1成熟體蛋白對應的編碼序列進行密碼子優化后,合成在1條DNA序列AmCI-AsATI-AsC/E-1上(圖1).AmCI成熟體蛋白含有56個氨基酸,理論分子量為5 972.81 Da,等電點為4.77;AsATI成熟體蛋白含有62個氨基酸,理論分子量為6 797.82 Da,等電點為7.7;AsC/E-1成熟體蛋白含有63個氨基酸,分子量為6 861.74 Da,等電點為5.22.

圖1 AmCI,AsATI,AsC/E-1的密碼子優化與基因合成

2.2 AmCI,AsATI,AsC/E-1表達載體構建

為了獲得AmCI,AsATI和AsC/E-1重組蛋白用于后續的研究,對這3個基因進行了載體構建.以合成序列AmCI-AsATI-AsC/E-1為模板,擴增出含限制性核酸內切酶識別位點的目的片段.利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測,結果顯示分別擴增出192,210,213 bp的目的條帶(圖2(a)).將擴增出的目的片段連接至p28表達載體中,得到重組表達質粒AmCI-p28,AsATI-p28,AsC/E-1-p28.菌液PCR檢測結果顯示,均出現1條單一的目的條帶,與預期大小一致(圖2(b)).經測序,重組表達載體構建成功.

圖2 AmCI,AsATI,AsC/E-1的原核表達載體構建

2.3 AmCI,AsATI,AsC/E-1的突變體表達載體構建

將AmCI(GenBank ID:XP_006563422),AsATI(GenBank ID:P19398),AsC/E-1(GenBank ID:P07851)蛋白與家蠶BmSPI38(GenBank ID:KP987266)和BmSPI39(GenBank ID:KP987267)的TIL結構域進行多序列比對.多序列比對結果表明,AmCI,AsATI,AsC/E-1的TIL結構域中都具有10個保守的Cys殘基,形成5個二硫鍵橋(圖3(a)).家蠶BmSPI38和BmSPI39的TIL結構域只有8個Cys殘基,缺失的Cys2nd,Cys6th殘基分別被Asp,Leu替代.為了探究Cys2nd-Cys6th對典型TIL類蛋白酶抑制劑AmCI,AsATI,AsC/E-1的抑制活性及特異性的影響,利用點突變技術,分別將AmCI中Cys2nd(Cys12)、AsATI中Cys2nd(Cys15)、AsC/E-1中Cys2nd(Cys14)突變為Asp;AmCI中Cys6th(Cys32)、AsATI中Cys6th(Cys33)、AsC/E-1中Cys6th(Cys33)突變為Leu(圖3(b)).提取AmCI-p28,AsATIp28和AsC/E-1-p28重組表達質粒,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果顯示質粒狀態良好,可作為模板用于后續定點突變PCR(圖3(c)).對AmCI(C12D),AmCI(C32L),AsATI(C15D)、AsATI(C33L),AsC/E-1(C14D)和AsC/E-1(C33L)的點突變PCR產物進行電泳分析,在表觀分子量約5 400 bp處檢測到單一的目的條帶,與預期大小基本一致(圖3(d)).經測序驗證,AmCI,AsATI,AsC/E-1的突變體表達載體構建成功.

圖3 AMCI,ASATI,ASC/E-1突變體的表達載體構建

2.4 AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體的原核表達

為了獲得AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體蛋白,將構建的重組表達載體轉入大腸桿菌細胞中進行誘導表達.重組表達的AmCI,AsATI,AsC/E-1蛋白理論分子質量分別為7 115.10,7 940.10,8 004.02 Da.SDS-PAGE結果表明,AmCI及其突變體蛋白在上清中低量表達,表觀分子量約7 k Da,與單體大小一致(圖4(a)).AsATI及其突變體蛋白以單體形式在上清中高量表達,包涵體中低量表達,表觀分子量約為8 kDa(圖4(b)).AsC/E-1及其突變體蛋白在上清中高量表達,在包涵體中低量表達,表觀分子量約為16 kDa,與其二聚體大小基本一致(圖4(c)).上述結果表明,AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體蛋白在Origami 2(DE3)菌株中成功表達.

2.5 AmCI,AsATI,AsC/E-1對不同蛋白酶的抑制活性

除了已報道的活性之外,為了探究AmCI,AsATI,AsC/E-1是否還具備對其他蛋白酶的抑制活性,選取胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶進行抑制活性分析.蛋白酶抑制劑膠內活性染色結果表明(圖5),AmCI不僅能夠抑制胰凝乳蛋白酶活性,還能強烈抑制彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶活性,但對胰蛋白酶沒有抑制活性;AsATI僅能抑制胰蛋白酶活性,對胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶沒有抑制活性;AsC/E-1不僅能夠抑制強烈胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性,還能強烈抑制枯草桿菌蛋白酶活性,而對胰蛋白酶無抑制活性.

圖5 AmCI,AsATI,AsC/E-1的膠內活性染色分析

2.6 AmCI,AsATI,AsC/E-1突變體的膠內活性染色分析

為了探究Cys2nd-Cys6th對典型TIL 類蛋白酶抑制劑抑制活性和抑制特異性的影響,對AmCI,AsATI,AsC/E-1中Cys2nd和Cys6th進行替換,分析突變前后的蛋白酶抑制劑的抑制活性和特異性的變化.膠內活性染色結果表明,與AmCI相比,AmCI(C12D),AmCI(C32L)對胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的抑制活性完全喪失(圖6(a));與AsATI相比,AsATI(C15D)對胰蛋白酶的抑制活性完全喪失,AsATI(C33L)對胰蛋白酶的抑制活性大大降低,AsATI(C15D)和AsATI(C33L)均獲得了微弱的枯草桿菌蛋白酶抑制活性(圖6(b));與AsC/E-1相比,AsC/E-1(C14D),AsC/E-1(C33L)對胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶的抑制活性完成喪失(圖6(c)).上述結果表明,二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th對典型TIL類蛋白酶抑制劑AmCI,AsATI,AsC/E-1的固有活性的維持極為重要,對其抑制特異性的改變也有一定的影響.

圖6 AmCI(a),AsATI(b),AsC/E-1(c)及其突變體對不同蛋白酶的抑制活性

2.7 AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體的三維結構分析

為探究二硫鍵橋(Cys2nd-Cys6th)對蛋白三維結構的影響,利用SWISS-MODEL同源建模軟件對AmCI,AsATI,AsC/E-1突變體蛋白進行了三維結構預測,QMEANDisCo＞0.6說明結果是可靠的,QMEANDisCo值越高,結構預測越可靠.預測結果:AmCI(C12D)和AmCI(C32L)三維結構的QMEANDisCo值分別為0.85,0.86;AsATI(C15D)和AsATI(C33L)三維結構的QMEANDisCo值分別為0.79,0.82;AsC/E-1(C14D)和AsC/E-1(C33L)三維結構的QMEANDisCo值分別為0.89,0.88.AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體的三維結構中皆有2個反平行的β折疊片和無規則卷曲結構.AmCI三維結構中,第1個β折疊片由β1(E7～N10)和β2(I34～C38)組成,第2個由β3(L43～N45)和β4(G48～V51)組成,α螺旋由P53～N55組成(圖7(a));AmCI(C12D)和AmCI(C32L)的三維結構中,第1個β折疊片由β1(E7～N10)和β2(G35～C38)組成,第2個由β3(L43～N45)和β4(G48～V51)組成(圖7(a)).AsATI,AsATI(C15D)和AsATI(C33L)三維結構中,第1個β折疊片由β1(Q11～T13)和β2(R37～E39)組成,第2個由β3(F46～D49)和β4(G52～K56)組成,α螺旋由A42～A44組成(圖7(b)).AsC/E-1,AsC/E-1(C14D)和AsC/E-1(C33L)三維結構中,第1個β折疊片由β1(V10～T12)和β2(S37～E39)組成,第2個由β3(M46～T49)和β4(G52～P56)組成(圖7(c)).AmCI,AsATI,AsC/E-1突變前整個結構包含5個二硫鍵橋,保持了蛋白質的剛性結構和穩定性,突變后僅有4個二硫鍵橋.AmCI突變后,β2有區別,AmCI中β2由5個氨基酸殘基組成,AmCI(C12D)和AmCI(C32L)中β2由4個氨基酸殘基組成,而且沒有α螺旋.AsATI和AsC/E-1突變前后,都具有2個反向平行的β折疊片,碳鏈主鏈骨架基本一致.需要指出的是,AmCI,AsATI,AsC/E-1突變前后突變氨基酸殘基的R側鏈長度不同,突變后二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th無法形成.突變后功能喪失,推測是二硫鍵橋缺失導致其高級結構的柔性增加,P1殘基位于中間,這可能會增加反應中心的靈活性,并影響其抑制特異性和活性.

圖7 AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體蛋白疊加后的三維結構比較

3 討論

前人從蜜蜂、蛔蟲中分離純化到TIL類蛋白酶抑制劑AmCI,AsATI和AsC/E-1,并對其抑制活性進行了初步分析,受限于純化工藝和活性檢測手段,人們對上述抑制劑的活性和生理功能的認識還十分有限,限制了該類抑制劑的功能研究與開發利用.筆者通過基因工程手段,成功獲得了有活性的AmCI,AsATI和AsC/E-1及其突變體蛋白,并結合蛋白酶抑制劑膠內活性染色技術,探討了其結構中二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th對典型TIL 類蛋白酶抑制劑的抑制活性和抑制特異性的影響.研究發現AmCI和AsC/E-1除了已報道活性之外,還具有對其他蛋白酶的強抑制活性,并證實了二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th對典型TIL類蛋白酶抑制劑AmCI,AsATI,AsC/E-1的固有活性的維持和抑制特異性改變極為重要.

之前的研究皆是利用層析技術從生物體中直接純化AmCI,AsATI,AsC/E-1蛋白[10,12,23],不僅純化工藝復雜,而且還會受到內源蛋白酶和抑制劑等諸多因素干擾,很大程度上影響了上述抑制劑的活性測定和生理功能探究.筆者首次利用原核表達系統獲得有生物活性的AmCI,AsATI和AsC/E-1及其突變體蛋白,并結合蛋白酶抑制劑膠內活性染色技術分析了AmCI,AsATI和AsC/E-1的抑制活性,這不僅為典型TIL類抑制劑的高效獲得開辟了新途徑,還可以避免內源蛋白污染、純化過程中引入的不利因素對測定結果的影響.值得注意的是,AsC/E-1及其突變體蛋白的單體分子量約為8 kD,而SDSPAGE檢測結果顯示其表觀分子量約為16 kD,與二聚體大小一致(圖4(c)),推測AsC/E-1及其突變體蛋白發生多聚化現象,活性染色結果也證實了這一點(圖5(a)和圖5(d)).TIL蛋白酶抑制劑富含半胱氨酸殘基,在還原劑和SDS 存在條件下傾向形成多聚體,這在其他TIL 類家族中存在類似現象[27,35].

Bania等[12]利用天然純化的技術,發現AmCI不僅能強烈抑制胰凝乳蛋白酶,還能較強地抑制組織蛋白酶G的活性,對彈性蛋白酶僅有微弱抑制活性.筆者采用膠內活性染色技術,證實AmCI也能夠強烈抑制胰凝乳蛋白酶活性,這與前人研究結果一致.需要指出的是,AmCI還能強烈抑制彈性蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶活性(圖5),與Bania的研究存在差異,這可能與Bania的AmCI獲取方式和檢測手段不同有關.膠內活性染色證實,AsATI能抑制強烈胰蛋白酶活性(圖5(b)),這與Goodman等[23]的研究結果一致.筆者的研究發現,AsC/E-1能夠強烈抑制胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶活性(圖5(a)和圖5(c)),與Peanasky等[24]的研究結果一致;而AsC/E-1對枯草桿菌蛋白酶有強烈抑制活性的研究結果(圖5(d))卻與Peanasky等的研究結果有差異.

多數TIL家族蛋白酶抑制劑的TIL結構域中含有10個保守的Cys殘基,形成5對二硫鍵橋[10,18],并對組織蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶等有抑制活性.已有的研究結果表明,TIL類蛋白酶抑制劑的抑制活性和特異性可能由Cys2nd和Cys6th及反應中心的P1和P1'氨基酸殘基的理化性質共同決定[16,27,36].家蠶TIL類蛋白酶抑制劑BmSPI37,BmSPI38和BmSPI39的TIL結構域中缺少第2位和第6位Cys殘基,上述蛋白酶抑制劑對微生物蛋白酶有強烈抑制作用,但對胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶無抑制作用[27,37].破壞AmCI,AsATI和AsC/E-1的二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th后,它們原有的抑制活性都極大降低,提示Cys2nd-Cys6th對AmCI,AsATI和AsC/E-1的固有活性維持至關重要.值得注意的是,AsATI突變后產生了微弱的枯草桿菌蛋白酶抑制活性.家蠶蛋白酶抑制劑BmSPI38和BmSPI39的TIL結構域僅有4個二硫鍵橋,缺少二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th,該抑制劑能夠強烈抑制枯草桿菌蛋白酶活性,但不能抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性,提示Cys2nd-Cys6th二硫鍵橋對TIL類蛋白酶抑制劑的抑制特異性也有重要影響[28].筆者課題組前期研究發現,家蠶蛋白酶抑制劑BmSPI38和BmSPI39的TIL結構域Cys2nd和Cys6th缺失,它們抑制了微生物蛋白酶和白僵菌孢子的萌發.引入Cys2nd和Cys6th后,BmSPI38和BmSPI39顯著降低了對微生物蛋白酶的抑制活性,Cys2nd-Cys6th的缺失對BmSPI38和BmSPI39微生物蛋白酶抑制活性的獲得至關重要[27].用Arg或Lys取代P1殘基不僅降低了BmSPI38和BmSPI39的內在活性,而且還獲得更強的胰蛋白酶抑制活性和較弱的胰凝乳蛋白酶抑制活性,提示蛋白酶抑制劑抑制活性和抑制特異性受到P1殘基和Cys2nd-Cys6th二硫鍵橋的影響[38].

4 結束語

筆者成功實現了AmCI,AsATI,AsC/E-1及其突變體蛋白在大腸桿菌中的表達,證實了二硫鍵橋Cys2nd-Cys6th的缺失能改變TIL類蛋白酶抑制劑的活性和抑制特異性,對TIL類蛋白酶抑制劑至關重要.該研究不僅為AmCI,AsATI和AsC/E-1的生理功能研究奠定基礎,還可為TIL類蛋白酶抑制劑活性和特異性的定向改造提供依據.