電離輻射對不同發育階段肺泡類器官的損傷及機制

韓 蕊,張 雯,王 潤,趙國平,吳李君,韓 偉,陳少鵬

(1.安徽大學 物質科學與信息技術研究院,安徽 合肥 230601;2.中國科學技術大學 環境科學與光電技術學院,安徽 合肥 230026;3.中國科學院合肥物質科學研究院 強磁場中心,安徽 合肥 230031;4.中國科學院合肥物質科學研究院 健康與醫學技術研究所,安徽 合肥 230031;5.皖南醫學院 基礎醫學院,安徽 蕪湖 241002)

核反應堆事故或蓄意恐怖主義行動造成的急性放射泄漏威脅是一個重大的公共安全和健康問題.例如,切爾諾貝利和福島核電站事故引起人們的廣泛焦慮[1].暴露于輻射環境時,放射性粒子經呼吸進入肺部導致肺損傷[2].此外,放射治療(放療)是胸部腫瘤的重要臨床治療手段,但治療中,常見副作用為放射性肺損傷,影響患者生存質量甚至生命[3].

肺泡是氣體交換的主要場所,主要由兩種類型的上皮細胞組成,立方形Ⅱ型肺泡上皮(alveolar typeⅡepithelial,簡稱AT2)細胞和鱗狀Ⅰ型肺泡上皮(alveolar typeⅠepithelial,簡稱AT1)細胞.AT2細胞的主要功能是分泌表面活性劑以防止肺泡塌陷,并在肺泡受損時,作為干細胞再生AT1細胞[4].AT1細胞介導氣體交換,是肺主要的功能性細胞[5].動物和細胞學實驗的相關研究顯示,輻射對AT1細胞的損傷是放射性肺損傷的觸發因素[6],AT2細胞是肺纖維化發生的驅動因素[7].輻射引起AT2細胞發生DNA損傷、內質網應激、線粒體功能障礙等,導致AT2細胞死亡;也可以引起端粒損耗、活性氧類(ROS)產生等,導致AT2細胞發生細胞衰老[8].但由于動物和細胞學實驗受限于倫理、種屬差異、無法實時觀察生理病理變化等,諸多問題目前仍不清楚.近年來類器官技術的發展,為深入開展此項研究帶來了新的機遇.

干細胞或器官祖細胞發育分化成不同類型的細胞,這些細胞在一定受限空間內自組織形成類器官,類器官可以更好地模擬人體器官在模型動物上無法重現的特性和多細胞之間的相互作用[9].從2011年至今,已經相繼有多種類型類器官的報道,目前已建成的3D類器官模型主要有腎、肺、腸、腦、視網膜,胃[10],心臟[11],肝臟和胰腺[12]以及皮膚[13]等.2019年,肺類器官的長期培養方法被建立[14].組織來源的腫瘤類器官主要用于預測病人對放射治療的敏感性[15]和藥物作用篩選[16];干細胞來源的肺類器官主要用于探索病毒感染機制[17]以及肺纖維化和肺癌等肺部疾病的潛在研究[16];此外,近年肺類器官已開始應用于毒理學研究[18-19].但類器官在輻射損傷的研究中鮮有應用,尤其輻射對肺發育的影響.筆者以人源肺類器官為模型,探究輻射誘導不同發育階段的肺類器官的損傷機制,以期為肺再生的機制研究提供依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人源胚胎干細胞(hESC-H9),購自Wicell公司;m TeSR1胚胎干細胞培養基(貨號:85850)、胚胎干細胞消化液ReLeSRTM1(貨號:5872)、CHIR99021(貨號:72052)購自StemCell Technologies公司;Matrigel人胚胎干細胞培養基質膠(貨號:354277)、細胞回收液(貨號:354253)、Matrigel生長因子基質膠(貨號:356231)購自Corning公司;RPMI1640培養基(貨號:C11875500BT)、DMEM F/12(貨號:C11330500BT)、Advanced DMEM F/12(貨號:12634010)、GlutaMAX(貨號:35050061)、B27(貨號:17504-044)、地塞米松(Dexamethasone,貨號:D4902)、ITS(貨號:41400-045)、Tryp LE(貨號:12604-013)均購自Gibco公司;Activin A(貨號:C687)、Noggin(貨號:CB89)、FGF4(貨號:CR08)、FGF10(貨號:CR11)、KGF(貨號:CH73)均購自近岸蛋白公司;SB431542(貨號:HY-10431)、DAPT(貨號:HY-13027)、8-Br-c AMP(貨號:HY-12306)、IBMX(貨號:HY-12318)均購自MCE公司;BMP4(貨號:120-05ET)購自Peprotech公司;ATRA(貨號:04-0021)購自Stemgent公司;BSA(貨號:A8020)、Triton-X100(貨號:T8200)、RIPA緩沖液(貨號:r0020)購自Solarbio公司;Trizol試劑(貨號:15596018)購自Ambion公司;Hifair? Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix(貨號:11141ES60)購自Yeasen Biotechnology公司;Hochest33342(貨號:H3570)購自Invitrogen公司;抗淬滅劑(貨號:P0128S-2)購自碧云天公司;Tween20(貨號:1247ML500)購自Biofroxx公司.

1.2 胚胎干細胞的培養

按批號查詢人胚胎干細胞培養基質膠Matrigel的濃度,根據使用濃度和包被面積計算后包被6孔板,置于室溫1 h后用于hESCs細胞的培養.每天用預熱的DPBS清洗并更換新鮮m TeSR1培養基,置于37℃培養箱中繼續培養.細胞約3～5 d生長至80%匯合度時,可按照1∶5至1∶10的比例進行傳代.

1.3 不同發育階段肺泡類器官的誘導分化

用預熱的DPBS 輕柔洗1 次對數生長期的hESCs,加入含有Activin A(100 ng·m L-1)和CHIR99021(2μmol·L-1)的定型內胚層(DE)階段誘導培養基,每天更換培養基.第4天,細胞用預熱的Advanced DMEM F/12培養基輕柔洗1次,加入含有Noggin(200 ng·m L-1),FGF4(500 ng·mL-1),CHIR99021(2μmol·L-1)和SB431542(10μmol·L-1)的前腸內胚層(AFE)誘導階段培養基,每天換液.第8天時,向細胞中加入適量Tryp LE消化液消化10 min,收集細胞,加入一定比例預冷Matrigel,吹打混勻后種板,37 ℃培養箱放置約15 min,加入含有BMP4(20 ng·m L-1),ATRA(0.5μmol·L-1),CHIR99021(3.5μmol·L-1),GlutaMAX,2%B27的腹側前腸內胚層(VAFE)階段的誘導培養基,每3～4 d換液1次;第15天,加入含有GlutaMAX,2%B27,CHIR99021(3μmol·L-1),FGF10(10 ng·m L-1),KGF(10 ng·m L-1),DAPT(20μmol·L-1)的肺祖類器官階段的誘導培養基,每3～4 d傳代1次;第22天,加入含有地塞米松(50 nmol·L-1),8-Br-c AMP(100μmol·L-1),IBMX(100μmol·L-1),KGF(10 ng·m L-1),2%B27,0.25%BSA,0.1%ITS,CHIR99021(3 μmol·L-1),SB431542(10μmol·L-1)的肺泡類器官階段的誘導培養基,每3～4 d傳代1次.

1.4 實時熒光定量PCR

按試劑盒的操作說明,采用Trizol試劑提取總RNA,將1μg總RNA 使用Hifair? Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis Super Mix試劑盒反轉錄為cDNA.相應引物和SYBR Green Master Mix配制qPCR反應體系,反應在Roche LightCycler 480 PCR系統上進行,每個實驗至少重復3次.

1.5 細胞免疫熒光染色

取種于爬片上的細胞,預冷的PBS清洗后用4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min;加入PBS清洗3次,0.3%Triton-X100室溫通透30 min;PBS清洗3次后用含5%BSA的封閉液室溫封閉細胞1 h;棄去封閉液,加入封閉液稀釋的一抗于室溫下孵育1 h;吸棄一抗并用PBS清洗3次,用封閉液稀釋的二抗于室溫下避光孵育1 h;吸棄二抗,加入PBS清洗3次,Hochest33342覆蓋細胞10 min后,滴加抗淬滅劑,封片,在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察.

1.6 類器官免疫熒光染色

取處理后的類器官,加入預冷的PBS 清洗類器官,棄去PBS 后加入細胞回收液于冰上溶解Matrigel 45 min,收集類器官于離心管中,離心棄上清;加入4%的多聚甲醛于4℃固定45 min,補加0.1%Tween20,離心棄上清;加入0.5%Tween20于4 ℃通透30 min;加入含0.1%Tween20和3%BSA的PBS室溫封閉類器官1 h;用含0.1%Tween20和0.1%BSA的PBS配制的TBPBS稀釋一抗,置于4℃搖床過夜孵育;TBPBS清洗類器官3次,用TBPBS稀釋二抗,室溫避光孵育1.5 h;TBPBS清洗類器官3次,Hochest33342復染10 min后,將類器官置于載玻片上;滴加抗淬滅劑后加蓋玻片封片,在熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察.

1.7 PI染色

取處理后的細胞,Tryp LE消化后收集至離心管中,離心棄上清;加入PBS離心清洗1次,加入100μg·mL-1的PI染料,避光于冰上孵育15 min;離心棄去PI染液,加入PBS重懸細胞,流式細胞儀檢測.

1.8 蛋白免疫印跡

使用含有蛋白酶抑制劑和釩酸鈉的RIPA裂解液裂解細胞,超聲后離心取蛋白質上清,用BCA 試劑盒對蛋白質定量,取等量的蛋白質進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);將蛋白質從丙烯酰胺凝膠轉移到硝化纖維素膜上,用5%脫脂奶對膜封閉;加入一抗,置于4℃孵育過夜;加入二抗在室溫下孵育1 h,成像觀察.

1.9 流式細胞分析

將細胞回收液加入處理后的類器官培養板中,冰上溶解Matrigel 45 min;收集類器官于離心管中,離心棄上清;加入Tryp LE于37℃消化15 min,補加PBS,離心棄上清;加入1 m L 4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min,補加PBS至6 mL,離心棄上清;加入1 mL 0.2%Triton-X100室溫通透細胞20 min,補加PBS至6 mL,離心棄上清;加入1 mL 1%FBS室溫封閉1 h,離心棄上清;加入封閉液稀釋的一抗200μL,室溫孵育細胞1 h,補加PBS至6 mL,離心棄上清;加入封閉液稀釋的二抗200μL,室溫避光孵育細胞1 h,補加PBS至6 m L,離心棄上清;加入1 m L 100μg·mL-1的PI染料,避光于冰上孵育15 min,補加PBS至6 m L,離心棄上清;加入100μL PBS將細胞混勻,流式細胞儀避光檢測.

2 結果與分析

2.1 人源肺泡類器官的模型構建

為了在體外研究輻射對不同發育階段人肺泡的損傷,首先需要構建人肺泡類器官模型.由于該研究中使用的肺泡類器官是由多能誘導干細胞而來,故首先用流式細胞術對hESCs的干性進行鑒定,結果顯示98.9%的細胞均為OCT4和Nanog雙陽性細胞(圖1(a)),表明該研究使用的hESCs保持著良好的干性特征.

圖1 人源胚胎干細胞誘導培養肺泡類器官

參考Pei等[20]誘導肺泡類器官的方案,用人胚胎干細胞(embryonic stem cells,簡稱hESCs)進行人源肺祖類器官(lung progenitors,簡稱LPs)和肺泡類器官(alveolar organoids,簡稱ALOs)的構建.誘導流程和不同誘導階段添加的細胞因子如圖1(b)所示:前7天為2D細胞培養,其中第0～3天為定型內胚層階段(definitive endoderm,簡稱DE),使用定型內胚層誘導培養基;第4～7天為前腸內胚層階段(anterior foregut endoderm,簡稱AFE),使用前腸內胚層誘導培養基.第7天時將消化得到的細胞與Matrigel混合培養,且使其逐漸形成3D類器官.第8～14天為腹部前腸內胚層階段(ventralized anterior foregut endoderm,簡稱VAFE),使用腹部前腸內胚層誘導培養基;第15～21天為LPs階段,使用LPs誘導培養基;第22～35天為ALOs階段,使用ALOs誘導培養基.各階段細胞的示意圖如圖1(c)所示,在培養的第4天細胞密度逐漸增大,第5天逐漸有大量緊密的細胞團飄浮培養基中,第21天形成100～200μm 的人源肺祖類器官,第35天形成200～500μm 的肺泡類器官.

接著,筆者對各個誘導階段的類器官進行鑒定.首先,使用實時熒光定量PCR對各時期標志基因的轉錄水平進行檢測,結果如圖2(a)所示,DE階段干性基因OCT4轉錄水平明顯下調,DE階段標志基因FOXA2/SOX17分別上升幾十甚至上百倍,表明誘導開始進入DE階段;LPs階段TTF1的表達量上調了300倍左右,SOX2和SOX9也明顯上調;在誘導了35 d的ALOs階段,HOPX/SFTPB/SFTP都有成百上千倍的上調.用免疫熒光實驗進一步在蛋白水平驗證不同時期的類器官誘導情況,如圖2(b)所示,在不同階段OCT4、FOXA2、SOX17、TTF1、EpCAM、平足蛋白(podoplanin)、肺表面活性物質相關蛋白C(prosurfactant protein C,簡稱pro-SPC)都有一定程度表達,這些蛋白的表達進一步證明各階段肺泡類器官模型成功建立.

圖2 肺泡類器官培養各階段的鑒定結果

2.2 輻射誘導hESCs和DE細胞的損傷

人源肺泡類器官模型構建成功之后,探究γ射線對hESCs和DE階段細胞的影響.首先分別使用1,5,10 Gy的γ射線分別對hESCs和DE階段的細胞進行照射處理,24 h后進行PI染色,流式細胞術分析細胞的存活狀況,結果如圖3所示.發現1 Gy的γ射線處理24 h,hESCs的死亡增加了13倍(圖3(a)左),在10 Gy處理組,約98%的細胞發生了死亡;而DE階段細胞死亡比例雖然呈上升趨勢,但在輻射前后沒有顯著差異(圖3(a)右).之后,對2種細胞在不同劑量輻射處理后,Western Blot檢測各自標志性蛋白的表達量變化,結果顯示(圖3(b)左),hESC的干性相關蛋白在24 h沒有明顯變化,可能是細胞死亡太多,且時間較短,細胞還沒有發生分化.但DE階段細胞中,與其分化相關的蛋白SOX17的表達量在5 Gy和10 Gy時顯著下調,故推測輻射會影響DE階段細胞向肺泡類器官的分化能力.為了驗證這一猜想,對第3天的DE階段細胞輻射后,立即將培養基更換為AFE階段的誘導培養基,并繼續誘導14 d,觀察類器官形成情況,結果如圖3(d)所示,對照組在第2天開始出現明顯的球體樣的細胞團聚集,第4天致密的細胞團大量增加,第14天便形成典型的肺祖類器官的形態;而1 Gy處理組中雖然在第4天有少量聚集的細胞團出現,但第14天時并未形成明顯的類器官形態;5 Gy和10 Gy處理組在輻射處理之后的第2天,就出現明顯的細胞密度不足,且第4天還出現異常的分化細胞的狀態,在第14天無法自組裝形成類器官.最后,對第14天形成的類器官的尺寸進行統計,結果如圖3(c)所示,即使是1 Gy低劑量的輻射處理,也會使DE階段細胞的分化功能受到明顯損傷,幾乎無法形成類器官.

圖3 1,5,10 Gy的γ射線對hESCs和DE階段細胞的影響

2.3 輻射誘導肺祖類器官的損傷

隨后,對誘導21 d形成的LPs進行了γ射線照射處理,結果顯示輻射1 d之后,不同劑量處理下的LPs與對照組相比,在形態學上沒有明顯變化(如圖4(a)所示);但輻射3 d之后,5 Gy和10 Gy處理下的LPs周圍及腔內開始出現明顯的死亡細胞,類器官開始出現明顯的損傷[21](如圖4(b)所示);輻射后的第7天,對照組和1 Gy處理下的類器官明顯變大,且生長狀態良好,但5 Gy和10 Gy處理下的LPs依然保持在受損狀態(如圖4(c)所示).故對類器官的受損情況進行了統計,圖4(d)為不同劑量不同時間時,受損類器官所占比例;圖4(e)為不同輻射劑量不同時間時,受損類器官產生的散細胞的遷移距離.統計結果顯示,肺祖類器官在輻射后第3天開始出現明顯損傷,且損傷一直保持到第7天甚至更長時間,沒有出現較明顯的修復現象;1 Gy的低劑量對LPs沒有明顯損傷,但中劑量的5 Gy和高劑量的10 Gy對LPS的損傷幾乎沒有差異.

圖4 輻射對肺祖類器官的影響

2.4 輻射對肺祖類器官分化的影響

前面的結果表明中高劑量輻射導致肺祖類器官的明顯損傷,接著通過檢測LPs分化相關轉錄因子TTF1,研究輻射對LPs向ALOs分化的影響.檢測結果顯示,γ射線處理3,7 d之后,5 Gy和10 Gy處理組TTF1基本不表達(圖5(a)),表明高于5 Gy的γ射線輻射可導致類器官嚴重受損,并可影響其進一步分化.為了尋找輻射對分化影響的直接證據,輻射之后,立即將LPs培養基更換為ALOs誘導培養基,并在第35天時進行觀察與檢測.圖5(b)的明場圖顯示,1 Gy輻射處理之后的LPs再繼續形成ALOs時與對照組沒有明顯差異,但5 Gy和10 Gy處理之后的LPs繼續形成ALOs時,ALOs的狀態和形成率都受到較大影響,甚至失去類器官明亮飽滿、邊緣清晰的典型特征,成為黑色不透亮的團狀聚集體.同時,對形成的ALOs進行的免疫熒光鑒定結果顯示(圖5(c)),輻射導致AT2細胞分泌的表面活性物質C表達量降低甚至不表達,表明輻射后的LPs并未形成ALOs.以上結果表明,中高劑量的輻射會抑制LPs向ALOs的分化.

圖5 輻射對肺祖類器官分化的影響

2.5 輻射誘導肺泡類器官的損傷

肺泡是肺的主要功能單元.為了研究輻射對肺泡細胞的影響,對35 d形成的ALOs進行輻射處理,并在處理1 d和7 d之后分別檢測,結果如圖6所示.

圖6 輻射對肺泡類器官的影響

明場圖結果顯示,不同輻射劑量處理的類器官在形態學上并無明顯差異(圖6(a)).流式細胞術檢測結果顯示輻射1 d后AT1和AT2細胞數的比例沒有發生明顯變化,但輻射7 d后兩種細胞的比例均呈現下降趨勢,尤其是10 Gy處理組的AT1細胞和AT2細胞數比例均顯著性下降,分別下降了68.3%和76%(圖6(b)).最后,通過文獻報道和生信分析,筆者篩選了一些與肺分化相關并在肺泡中表達的基因[22],包括NFIB,KLF2,YAP1,HOXA5和NUMB.輻射后,對這些基因的轉錄水平進行檢測.結果顯示,輻射后第1天,NUMB的轉錄水平明顯上調(圖6(c)左).NUMB的表達與祖細胞的分化相關,推測輻射的第1天,類器官可能通過激活祖細胞分化,來補充受損的功能性細胞.輻射后第3天,NUMB的轉錄水平回落,NFIB,KLF2,YAP1和HOXA5的轉錄水平都大幅上調(圖6(c)中).4個基因NFIB,KLF2,YAP1和HOXA5與非小細胞肺癌等惡性腫瘤的發生密切相關,該結果表明類器官中有惡性轉化的發生.雖然7 d后,NFIB和YAP1轉錄水平有所回落,但KLF2和HOXA5仍保持較高水平(圖6(c)右).以上結果表明,輻射7 d內,肺泡類器官形態上雖然沒有較大影響,但其基因的表達已受到很大影響,這可能對肺泡功能產生長期影響.

3 討論

類器官因可以維持其天然組織的遺傳和表型特征[23],已廣泛應用于高通量藥物篩選、精準醫療、器官組織發育以及組織再生領域[24].同時,類器官是一種體外培養的多細胞體系,便于研究細胞間的協作,因此,近年來類器官開始應用于毒理學研究[19].

筆者建立并運用人源肺泡類器官模型開展輻射誘導不同發育階段肺損傷的研究,采用了Pei等[20]的方法,構建了多種肺類器官.同已報道的其他人肺類器官培養方案(如氣液交界面系統[25]、以基質膠為介質的克隆球[26]、支氣管肺泡樣結構[27]和來自成體干細胞和多能干細胞的肺類器官[28-29]等)相比,筆者采用的類器官模型培養周期相對較短,可以較好地反映人體肺泡的細胞構成,并且可以在體外擴大培養的同時還能保持類器官長時間的結構完整性和遺傳特征的穩定性.但在類器官構建的過程中,需要嚴格注意誘導分化時細胞的密度和誘導時長,這對各階段的分化效率來說非常重要;為了保證類器官良好的3D結構,要保證基質膠的濃度在80%以上并及時更新基質膠.

筆者的研究表明不同發育階段的肺泡類器官對輻射的敏感性不同.隨著肺泡類器官的誘導進展,發現DE期的細胞較干細胞更耐輻射.輻射雖然引起DE期細胞的分化,但導致的細胞死亡要低于受輻射的干細胞.LPs類器官輻射后形態學發生明顯的變化,出現向外遷移的細胞,并隨著劑量的增加逐漸喪失誘導成ALOs類器官的能力.ALOs類器官輻射后仍保持著原有的形態學特征,但其AT1和AT2細胞數的比例發生了變化,關鍵標志性基因的表達也出現顯著性變化.已有報道顯示AT2細胞的缺失和功能障礙在放射性肺損傷中起著核心作用[7],在AT2細胞出現的結果與小鼠模型上觀察到的有一定的相似性.總之,筆者所建立的人源肺泡類器官輻射損傷模型,較系統地觀察了不同發育階段的人源肺泡類器官對輻射的損傷響應,有助于進一步揭示放射性肺損傷的機制.

目前類器官的應用依然存在許多限制.首先,類器官建模的技術方案還不夠客觀、規范,這可能影響類器官的可重復性,導致研究結果出現偏差.目前對于肺泡類器官來說,只能夠比較好地模擬上皮細胞的發生發展,但肺部的發育分化是上皮細胞和間充質細胞互相作用的結果,甚至還包括血管的發生以及和免疫細胞之間的相互作用,所以單獨的上皮細胞之間的關系尚未完全闡明肺器官的真實結構,需要建立更接近人體水平的類器官.肺類器官未來可以用以探索污染物與靶組織和器官之間的相互作用,以評估暴露于各種環境毒素對肺部的急性和慢性不利影響;或者用于研究肺部疾病的病理過程和藥物靶點,例如肺炎、慢性肺纖維化、慢阻肺等.