改良型生物轉盤污水處理系統中有氧反硝化菌菌群研究

方紀云

（大同市供排水集團公司，山西 大同 037000）

隨著城市的快速發展，我國生活污水排放量持續增加，城市生活污水處理成為目前急需解決的重要問題。我國城市生活污水中所包含的主要成分是纖維素、蛋白質、淀粉和礦物油等有機物，水質中所含的生物需氧量（BOD）、化學需氧量（COD）、總氮（TN）和總磷（TP）都比較高，屬于典型的C/N 低比型生活污水，其最高的BOD5/TN 為3.03，而最低僅為1.42。雖然大多數生活污水都經過了一級處理和二級處理，但其中的TN、TP 等富營養化指標還是嚴重超標，排放后會導致水體富營養化等環境問題，更嚴重的是對人體產生危害[1]?；诖?，本文利用改良型生物轉盤工藝，進行有氧反硝化菌的富集篩選與多樣性分析，對污水處理系統中的有氧反硝化微生物進行研究，對篩選高效生物脫氮微生物提供了技術支持[2]。

1 改良型生物轉盤工藝概述

1.1 傳統生物轉盤工藝

生物轉盤是原聯邦德國開創的一種污水生物處理技術[3]。傳統生物轉盤主要由盤片、接觸反應槽、轉軸和驅動裝置組成。轉盤在驅動裝置的帶動下，以較低的線速度在充滿污水的接觸反應槽內轉動，盤片全浸沒入或部分浸沒入反應槽內的污水中。轉盤轉動時與空氣和污水交替接觸，運行一段時間后，轉盤盤片上會形成一層厚厚的生物膜，生物膜由大量微生物組成[4]。生物膜交替地與廢水和空氣相接觸，形成一個連續的吸氧、吸附和氧化分解過程，不僅能夠維持微生物的生長繁殖，而且能夠去除有機污染物。隨著運行時間的延長，轉盤上的生物膜逐漸增厚老化并脫落下來，經沉淀池沉淀排出，新的生物膜還繼續生長，從而形成一個周而復始的過程[5]。

1.2 改良生物轉盤工藝

改良型生物轉盤BBR（Bacillus Bio-Reactor）工藝是一種新型的污水處理工藝，該工藝是在原來的普通生物轉盤法的基礎上改良的生物膜污水處理系統，可以看作是A2/O2與RBC相結合的新工藝，其中的1號池和2號池是缺氧池，3號池和4號池是有氧池，溶氧分別為（0.08±0.04）mg/L、（0.34±0.34）mg/L、（2.99±1.11）mg/L、（2.04±1.28）mg/L。BBR 生物轉盤浸沒比為40%，轉速為3～8 r/min，溶氧為（0.88±0.42）mg/L。創新點是該工藝通過一次性在BBR 裝置和曝氣池內加入粉末狀菌劑，該菌劑主要是包含了芽孢桿菌（Bacillus），目的是通過芽孢桿菌的生長與繁殖，針對BOD、COD、T-N 和T-P等污染物進行生物處理。BBR 污水處理技術的基本工藝流程如圖1所示。

BBR 系統的優點：處理效果好，對氮、磷污染物的去除效果好，去除速度快；能夠分解吸收處理過程中產生的臭氣，后續處理中不需要增加臭氣處理過程；對COD 去除效果良好，去除能力強，并且工藝簡單，便于運行管理；溶解氧要求低，運行費用較低，不易發生污泥膨脹；系統活性污泥濃度高，耐沖擊負荷能力強，對BOD 去除率高，運行效果穩定；污泥產量小，脫水性能好，可直接濃縮脫水，便于進一步處理與處置。

2 有氧反硝化菌介紹

有氧反硝化菌是以硝酸鹽作為最終電子受體進行反硝化作用，其催化反應順序為：NO3-→NO2-→NO→N2O→N2。該過程由下面4 種酶參與完成：硝酸鹽還原酶（Nar）、亞硝酸鹽還原酶（Nir）、一氧化氮還原酶（Nor）和一氧化二氮還原酶（Nos）。反硝化過程中起主要作用的酶是亞硝酸鹽還原酶（Nir），亞硝酸鹽還原酶（Nir）是催化反硝化作用的限速酶，能夠將NO3-催化還原為NO，Nir基因也是在反硝化菌功能基因中研究最多的基因，并作為反硝化菌的分子標記用于研究其種群結構及多樣性。Nir分布于細胞膜外周質中，有2種類型：一是可溶性含銅酶，即Cu 型亞硝酸鹽還原酶，由NirK 基因編碼，這種酶的催化產物是NO 和N2O 的混合物；二是細胞色素還原酶（cd1-Nir），由NirS編碼，其催化的產物也是NO和N2O混合物。NirS是反硝化過程中一個極其重要的基因，也是反硝化細菌檢測的一個重要靶基因。這兩種酶雖然功能相同，但其結構和催化位點卻不同，并且不能共同存于同一種細胞中。

根據近年來的研究報道證實，不同菌屬的有氧反硝化菌對氧氣的耐受能力有顯著差異。對于大部分有氧反硝化菌來說，當溶解氧質量濃度在3 mg/L 時，都具有反硝化活性。隨著溶解氧含量的上升，反硝化作用過程中相關酶的表達會被抑制，進而減弱反硝化作用。

3 有氧反硝化菌的富集篩選與多樣性分析

3.1 菌株篩選

本次樣品采集于BBR 反應器、1 號池、2 號池、3 號池、4 號池5 個位點。將5 g 污泥樣品加入到100 mL 無菌水中，充分混勻后按1%比例接種于盛有玻璃珠的異養硝化培養基（HM）中培養，在30 ℃震蕩培養箱以轉速150 r/min 培養10 d，每隔48 h 更換新鮮培養基[6]。馴化培養結束后，按照10%的接種比例接種到有氧反硝化培養基（DM 培養基）中進行初篩，每隔48 h 按照10%的體積比更換新鮮培養基，連續培養8 d。培養結束后，取1 mL經過初篩的菌液均勻涂布在固體GN顯色培養基平板上，采用稀釋涂布法、連續劃線法分離單菌落。在1 mL 滅過菌的離心管中加入100 μL 的菌液，同時加入900 μL 磷酸鹽緩沖鹽水（1×PBS）進行稀釋，此為稀釋10-1的菌液[7]。從10 倍菌液中取100 μL 到滅過菌的新離心管中，加入900 μL 磷酸鹽緩沖鹽水（1×PBS）再進行稀釋，此為稀釋10-2的菌液。以此類推，依次稀釋到10-4。分別在10-3、10-4稀釋菌液中取100 μL，均勻涂布到LB 固體培養基上。涂布后的固體培養基在30 ℃培養箱中培養。

選擇單菌落能夠變為藍色的菌株作為目的菌株。為進一步驗證所挑選的目的菌株具有能夠使GN 顯色培養基變藍的特性，在盛有3 mL GN顯色培養基的小試管中挑取單菌落接菌，在30 ℃、150 r/min 搖床中培養，觀察GN 顯色培養基是否變色。能使GN 顯色培養基由綠色變成藍色的菌株作為最終目的菌株。篩菌過程中150 r/min條件下溶氧范圍在3.4～5.1 mg/L。

3.2 有氧反硝化菌多樣性分析

利用MEGA4.0將分離得到的菌株構建分類學系統發育樹，選用“Neighbor jioining”，將bootstrap 值設置為1 000 次重復，利用系統發育樹分析不同反應單元樣品中有氧反硝化菌的進化關系和地位。利用MOTHUR軟件對篩選的菌株序列進行OTU 聚類分析，通過OTU 聚類分析了解不同樣品中有氧反硝化菌的多樣性、差異性和相對豐度。利用Venn圖直觀地表述不同采樣位點中OTUs 的組成和群落結構相似性。利用豐度圖分析了解不同反應單元微生物分布情況。

3.3 結果與分析

通過對BBR 反應器、1 號池、2 號池、3 號池、4 號池樣品進行有氧反硝化菌的初篩和復篩，共篩選出226株具有有氧反硝化特性的菌株，這些菌株均因pH 值升高而對BTB 產生陽性反應。根據16s rRNA 的基因測序結果，對篩選出的這些菌株進行分類鑒定，將相似度在98.6%以上的菌株歸類為一個OTU，共分為24 個OTUs。226 株菌在24 個OTUs 中的分布情況如表1 所示。在NCBI 16S rRNA 數據庫的基礎上，分別從24 個OTUs 中挑選出一個代表菌株，代表菌株的分類信息如表2所示。

表1 有氧反硝化菌在不同OUTs中的分布情況Tab.1 Distribution of aerobic denitrifying bacteria in different OUTs

表2 24個OTUs的分類信息Tab.2 Classification information for 24 OTUs

為比較各反應單元中可培養有氧反硝化菌的分布特性，本研究對不同采樣點分離出來的有氧反硝化菌多樣性進行了分析。圖2 是各反應單元有氧反硝化菌的Venn 圖，圖中所示的數字是不同反應單元中OTUs的數量，重疊部分表示共有OTUs 的數量，通過Venn 圖可以直觀地了解每個反應單元中共有和特有的OTUs數量。從Venn 圖可以看出，BBR 反應單元有13 個OTUs，1 號反應池中有11 個OTUs，2 號反應池中有14個OTUs，3 號反應池中有10 個OTUs，4 號反應池中有10 個OTUs。其中5 個采樣位點共有的OTUs 有3 個，分別是OTU1（Pm.stutzeri）、OTU8（Pm.monteilii）、OTU10（G.cholesteroliborans）。在不同反應池中OTUs分布呈現出不均勻性，由此可以表明有氧反硝化菌在不同反應池中的群落結構是存在一定差異性的。

圖2 不同反應單元中可培養有氧反硝化菌的Venn 圖Fig.2 Venn diagram of culturable aerobic denitrifying bacteria in different reaction units

為了更好地了解不同反應單元可培養有氧反硝化菌的群落結構特點，繪制了相對豐度圖，詳情如圖3 所示。結合Venn 圖可知，在5 種樣品中相對豐度最大的是OTU1（Pm.stutzeri），在BBR 反應單元、1 號池、2 號池、3 號池、4 號池的相對豐度分別為30.95%、22.81%、24%、52.17% 和23.08%。OTU2（Pm.guguanensis）在BBR、1 號池、2 號池和3 號池中所占比例分別是17.31%、23.81%、15.79%和18%，而在4 號池中沒有該OTU 存在。在4 號池中特有的OTUs 有4 中，分別是OTU17（Ac.Xylosoxida），OTU18（An.Haemolyticus），OTU19（Bj.Fluminensis），OTU23（Rc.Ruber），它們所占的比例都是4.35%。OTU9（Az.communis）只在2 號池和4號池中存在，豐度分別為5.26%、13.04%。

圖3 各反應單元中有氧反硝化菌的相對豐度圖Fig.3 Relative abundance of aerobic denitrifying bacteria in each reaction unit

在24 個OTUs 中，OTU24（Ar.Protophormiae）只存在于1 號池中，OTU14（Ac.aegrifaciens）、OTU16（N.puris）和OTU22（Pa.phragmitetus）只存在于2 號池中，OTU17（Ac.xylosoxidans）、OTU18（Ac.haemolyticus）、OTU19（Bj.Fluminensis）、OTU23（Rc.Ruber）只存在于4號池中，OTU15（B.unclassified）、OTU20（Pm.pseudoalcaligene）、OTU21（St.acidaminiphila）只存在于BBR 反應單元，3號池中沒有特有OTUs存在。

4 討論

本研究中，有3 個OTUs 同時存在于5 個反應池中，分別是OTU1（Pm.stutzeri）、OTU8（Pm.monteilii）、OTU10（G.cholesteroliborans）。Pm.stutzeri和Pm.monteilii具有有氧反硝化能力均有文獻報道過。一株Pm.stutzeriYZN-001 在2011 年被分離出來，并證實在低溫條件下能夠去除氨基鹽。菌株Pm.stutzeriKTB 從活性污泥中被分離出來，并證實具有異養硝化有氧反硝化能力。近年來，Pm.stutzeri被從各種環境樣品中分離出來，例如，土壤、污水、地表水等，在自然界中廣泛存在。本研究中Pm.stutzeri在所分離的可培養有氧反硝化菌中是所占比例最大的優勢菌，因而在用于污水處理生物脫氮方面具有重要的價值。與Pm.stutzeri一樣，Pm.monteili也被研究人員從深海底泥、香蕉根際土壤、制革廢棄地等各種環境樣品中分離篩選出來。已有文獻報道過Pm.monteili具有有氧反硝化能力，例如菌株Pm.monteiliiH97 和Pm.monteiliiLKX-1。G.cholesteroliboransChol-3 首次被分離出來是在污泥樣品中，目前針對G.cholesteroliborans具有有氧反硝化能力鮮有文獻報道。

OTU9（Az.Communis）在4 號池中豐富度較高，而未發現存在于其他反應池中。目前針對Az.Communis具有有氧反硝化能力的研究鮮有報道，在之前的報道中，有研究人員發現從煉油廠含油污泥中分離出的Az.Communis具有嚴格的需氧代謝特征，能夠從硝酸鹽中形成N2O。這一結論與本研究結果相一致，4 號池處于好氧條件，說明該菌是好氧菌。此外，有研究人員發現Az.Communis能夠為植物提供N2并且能夠利用甲苯作為底物進行反硝化作用。推測這一結論可能與Az.Communis有氧反硝化有關。在本研究中，Az.Communis已被證實能夠去除硝酸鹽，但其反硝化作用途徑有待進一步研究。由Venn圖所顯示的豐富度的不均勻分布表明，可培養有氧反硝化菌群落結構在這5個取樣點具有差異性。2 號池和BBR 反應池有氧反硝化細菌群落較豐富，分別有14 個OTU 和13 個OTU，且缺氧池中有氧反硝化菌的結構與其他組相比有顯著差異。因此，在這5個采樣點中導致可培養群落結構多樣性的因素還需要進一步研究。

5 結論

本研究通過利用有氧反硝化培養基、異養硝化培養基等特定培養基，從污水處理系統5個不同反應單元活性污泥樣品中共篩選出226株有氧反硝化菌，歸類為24 個OTUs，并對5 個不同采樣點的微生物群落分布情況進行了分析，結果表明5個不同反應池中微生物群落結構存在一定的差異性。本試驗針對污水處理系統中的有氧反硝化微生物進行研究，對篩選高效生物脫氮微生物提供了技術支持，為污水系統中有氧反硝化菌的研究提供了理論依據，但影響不同反應單元微生物群落結構多樣性的因素還需要進一步研究。