鲇楚克拉蟲的地理新記錄及不同地理株系的比較研究

袁采莉 唐發輝 楊雨婷 彭建軍 譚祿奇, 張雕雕 楊承忠 趙元莙

(1. 重慶師范大學生命科學學院, 動物生物學重慶市高校重點實驗室, 重慶 401331; 2. 重慶師范大學, 動物生物學重慶市重點實驗室, 重慶 401331; 3. 湖南科技大學生命科學與健康學院, 湘潭 411201; 4. 銅仁學院, 貴州省梵凈山地區生物多樣性保護與利用重點實驗室, 銅仁 554300)

黏孢子蟲(Myxosporea Bütschli, 1881)是一大類個體微小、形態多樣且分布廣泛的后生動物(Metozoa)寄生蟲, 其生活史涉及無脊椎動物終末宿主和脊椎動物中間宿主兩個階段[1—4]。迄今為止, 已記錄的黏孢子蟲超過2600種[5—7]。其中, 兩極蟲科(Myxidiidae Thélohan, 1892)是黏孢子蟲中宿主范圍最廣的類群, 也是典型的腔寄生類群, 極少行組織寄生[8,9]。楚克拉蟲屬(ZschokkllaAuerbach, 1910)是該科中物種豐富度第二的類群[第一為兩極蟲屬(MyxidiumBütschli, 1882)], 迄今記述的有效種超過100種[10]。

鲇楚克拉蟲Zschokkella parasiluri是Fujita[11]于1927年在日本琵琶湖采集的鲇(Silurus asotus)膽囊中檢獲并命名的。后來有學者在浙江、遼寧和四川等地采集的鲇、懷頭鲇(Silurus soldatovi)和黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)的膽囊中發現該種, 并補充描述了其極囊直徑、極囊間距和條紋數等形態學量度數據[12—14]。因受當時技術條件限制, 之前樣本均未獲得分子數據。直到2006年, Fiala[15]從湖北檢獲的鲇楚克拉蟲[(下文統一稱為湖北株系(S1)]中獲得了18S rDNA分子序列(GenBank登錄號:DQ377689), 但該研究卻未提供鲇楚克拉蟲成熟孢子的形態學量度數據。繼后, 又有學者在重慶渝北檢獲該種(下文統一稱為重慶渝北株系(S2))并提供了其形態學和18S rDNA數據(GenBank登錄號:MH517584)[16]。本研究在我國重慶、貴州和河南采集的黃顙魚膽囊中共檢獲5個鲇楚克拉蟲株系[重慶沙坪壩株系(S3)、重慶渝北株系(S4)、重慶秀山株系(S5)、貴州銅仁株系(S6)和河南信陽株系(S7)], 并獲得了相應的形態學及分子生物學數據。

對于自由生活的動物, 地理隔離在其種群分化中起著非常重要的作用, 然而對于營寄生生活的動物而言, 其種群分化卻受到多種因素的影響[17—19]。對此, 黏孢子蟲類群的研究卻很少[20—23]。為探索地理隔離對鲇楚克拉蟲株系分化的影響規律, 本研究基于形態與分子數據對鲇楚克拉蟲各地理株系進行了比較研究, 以期更深入地了解該物種的進化規律。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與物種鑒定

本實驗于2018—2021年分別在重慶沙坪壩區、重慶渝北區、重慶秀山縣、貴州銅仁碧江區和河南信陽市等5地共采集到宿主黃顙魚34尾(表1)?；铙w用適量的MS-222麻醉劑(350 mg/L)進行安樂死, 然后剖檢, 檢查體表、鰓、肌肉、肝胰臟、腸、膽囊、腎臟和膀胱等部位是否有黏孢子蟲孢囊存在。同時, 取各部位的部分組織進行涂片并鏡檢是否有離散孢子存在。檢查到孢囊或離散孢子后, 參考趙元莙等[24]的方法對獲取的黏孢子蟲新鮮樣本進行圖像采集及基因組DNA提取等工作?；谛螒B學方法對其進行物種鑒定, 結果為鲇楚克拉蟲, 這與后續分子鑒定結果一致。

1.2 孢子形態差異性分析

利用Leica DM6000B顯微鏡對檢獲的鲇楚克拉蟲(S3—S7株系)進行圖像采集及形態測量, 基于成熟孢子的孢子長、孢子寬、極囊直徑和極囊間距的測量值, 利用PAST3進行主成分分析(PCA), 以分析鲇楚克拉蟲各株系間的形態差異, 使用變量協變矩陣生成具有95%置信區間的散點圖。利用SPSS 16.0非參數Mann-Whitney U檢驗對5株系間形態量度進行顯著性差異分析。

1.3 DNA 提取與 PCR 擴增

DNA提取鏡檢后剩余膽汁保存于1.5 mL離心管中, 從離心管中吸取10 μL含有孢子的膽汁,離心富集, 采用滅菌水懸浮清洗2—3次以除去雜質?；?因 組DNA的 提 取 采 用Dneasy Tissue Kit(QIAGEN, Germany)試劑盒, 按生產廠家提供的說明書步驟進行操作; 再將成功提取的基因組DNA保存于-20℃冰箱中備用。

PCR擴增用于擴增18S rDNA的引物為18E (5′-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3′)[25]和18R (5′-CTACGGAAACCTTGTTACG-3′)[26]。PCR反 應 體系: Mix (北京擎科生物科技有限公司)12.5 μL, 引物各1 μL (10 μmol/L), 模板DNA 1 μL, 最后用滅菌超純水補足至終體積25 μL。PCR反應程序: 98℃預變性5min; 98℃變性90s, 58℃退火30s, 72℃延伸2min, 35個循環; 最后72℃延伸5min, 反應完成后于PCR儀12℃條件下保存。取獲得的PCR產物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 然后將有目的條帶的PCR產物用DNA凝膠回收試劑盒(Omega Bio-Tek,Norcross City, GA)進行純化回收, 再將回收產物插進pMD18-T載體(TaKaRa, Japan)中, 隨后導入大腸桿菌進行單克隆培養, 每株系送3個克隆子至北京擎科生物科技有限公司測序, 測序返回的每株系的3條18S rDNA序列均一致。

1.4 序列與系統發育分析

序列的選取將本實驗獲得的鲇楚克拉蟲的5條18S rDNA序列上傳至GenBank, 并用在線BLAST工具進行序列同源性比對。根據比對結果,選取同源性較高的30條有效序列, 包含鲇楚克拉蟲序列S1—S7 (因S3、S4和S6共享同一基因型, 因此,僅選用S3株系的序列為代表), 楚克拉蟲屬Zschokkella13條、兩極蟲屬Myxidium11條、囊盤蟲屬Cystodiscus2條、弧形蟲屬Sphaeromyxa2條、碘泡蟲屬Myxobolus1條和四極蟲屬Chloromyxum1條。另外, 選用Tetracapsuloides bryosalmonaeisolate(GenBank登錄號: KF731712)和Buddenbrockia plumatellae(GenBank登錄號: AY074915)為外群構建系統發育樹。

18S rDNA序列分析通過Clustal W程序按照缺省參數進行序列多重比對, 序列相似度的計算用在線序列雙重比對工具( https://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ )計算獲得。所選序列進行兩兩之間的遺傳距離利用MEGA 6.0[27]選擇K2P模型計算完成。

系統發育樹的構建利用MrBayes 3.1.2軟件構建BI樹, 通過Modeltest 3.7[28]計算獲得最佳進化模型為GTR+I+G, 共運行10000000代, 每200代抽樣1次, 在舍棄25%的老化樣本后, 再依據剩余樣本構建一致樹。利用在線軟件CIPRES Science Gateway V. 3.1 (htlp://www.phylo.org/sub_sections/portal)構建ML樹, 選用模式為RAxML-HPC2 XSEDE (8.2.12)。然后用FigTree v 1.4.0及Photoshop 2021編輯系統發育樹。

1.5 18S rRNA二級結構預測

二級結構模型從歐洲核糖體RNA數據庫(http://bioinformatics.Psb.ugent.Be/webtools/rRNA/secmodel/index.html)[29,30]獲得。利用MEGA 6.0對所選18S rRNA基因進行比對以獲得可變序列區域,基于18S rRNA二級結構對鲇楚克拉蟲各株系進行比較。RNA二級結構的預測是使用RNA structure 5.2[31,32]軟件依據最小或次小自由能原理完成, 所有的參數設置均為默認值, 最后通過 Rnaviz 2.0[33]軟件對已構建的二級結構構型進行手動調整。

2 結果

本研究檢獲的鲇楚克拉蟲均寄生于黃顙魚膽囊, 孢子游離于膽汁中, 未形成孢囊。如前所述, 依據地理分布, 將鲇楚克拉蟲分為5個株系, 其中重慶沙坪壩株系(S3)感染率為20.0%、重慶渝北株系(S4)感染率為16.7%、重慶秀山株系(S5)感染率為50.0%、貴州銅仁株系(S6)感染率為50.0%, 河南信陽株系(S7)感染率為12.5% (表1)。

2.1 鲇楚克拉蟲Zschokkella parasiluri Fujita,1927 形態學描述

本研究新獲的鲇楚克拉蟲各株系(S3—S7)孢子形態與原始描述基本一致(表1), 其成熟孢子殼面觀呈橢圓形, 末端鈍圓, 殼瓣表面有7—9條明顯的條紋; 縫脊“S”形, 從一端繞至另一端; 兩個極囊等大、近球形, 位于孢子兩端, 開口相反, 極絲纏繞5—7圈(圖1)。鲇楚克拉蟲重慶沙坪壩株系(S3)的成熟孢子形態學量度(n=30 )為孢子長(11.92±0.38) μm(11.15—12.60 μm); 孢子寬(6.28±0.50) μm (5.41—7.30 μm); 極囊直徑(4.34±0.29) μm (3.76—4.84 μm);兩極囊最小間距(2.22±0.52) μm (1.38—3.27 μm);極絲纏繞6—7圈; 殼面條紋數7—9。其余株系形態量度與重慶沙坪壩株系(S3)接近(表1)?；阪咦有螒B量度的主成分分析結果顯示, 本研究獲得的鲇楚克拉蟲各株系(S3—S7)形態對應散點聚集(圖2),說明各株系間形態非常相似。通過非參數 Mann-Whitney U檢驗結果進一步表明, 5株系間孢子形態量度無顯著差異(P＞0.05)。

圖1 鲇楚克拉蟲孢子形態Fig. 1 Morphology of Zschokkella parasikuri

圖2 鲇楚克拉蟲5株系(S3—S7)主成分分析Fig. 2 Principal component analysis (PCA) of five strains(S3—S7) of Zschokkella parasiluri

2.2 鲇楚克拉蟲18S rDNA分子特征

獲得鲇楚克拉蟲S3—S7株系18S rDNA序列片段長度分別為1919 nt (GenBank登錄號為: OP592188)、1792 nt (GenBank登 錄號 為: OP592198)、1878 nt(GenBank登錄號為: OP592203)、1891 nt (GenBank登錄號為: OP445242)和1976 nt (GenBank登錄號為: OP906307)。序列分析結果顯示: 鲇楚克拉蟲各株系間(S1—S7)序列相似度為98.7%—100%, 遺傳距離為0—0.006 (表2)。其中S3、S4和S6株系間18S r DNA序列相似度為100%, 且遺傳距離為0, 故3株系共享同一基因型。

表2 鲇楚克拉蟲各株系間18S rDNA序列相似度 (右上) 與遺傳距離 (左下)Tab. 2 Similarities (upper right diagonal) and genetic distances (lower left diagonal) of strains of Zschokkella parasiluri based on 18S rDNA sequences

對鲇楚克拉蟲S1—S7各株系18S rRNA共有區段的高變區V2、V3、V4、V5、V6、V7、V8 等7個可變區二級結構進行了預測和分析(V1和V9區不 完 整, 故 未 分 析)。結 果 顯 示, V5、V6 (37)及V8區的相關構型可將鲇楚克拉蟲湖北株系(S1)與其余株系進行有效區分: 湖北株系(S1)V5區二級結構構型多一個由11個堿基構成的內部環, 而其余株系無內部環; 湖北株系(S1) V6 (37)含由11個堿基構成的內部環、無發夾環, 而其他6個株系均含有由12個堿基構成的發夾環; 湖北株系(S1)V8區靠近發夾環的內部環大于其余6個株系對應位置內部環(10 bpvs. 8 bp), 而遠離發夾環的內部環小于其余6個株系的對應位置內部環(8 bpvs. 9 bp), 同時, 湖北株系(S1)與其余株系相比, 多兩個側凸(AA; 圖3)。

圖3 鲇楚克拉蟲各株系18S rRNA 部分高變區二級結構Fig. 3 Secondary structure of partial hypervariable regions of 18S rRNA among strains of Zschokkella parasiluri

2.3 系統發育

以18S rDNA為分子標記構建的ML樹和BI樹,呈現一致的拓撲結構(圖4)。系統發育分析顯示:鲇楚克拉蟲所有株系聚為一支, 其中共享同一基因型的株系(重慶沙坪壩株系S3、重慶渝北株系S4和貴州銅仁株系S6)與重慶秀山株系S5先聚支, 其構成的進化支再與湖北株系S1聚支, 以上共同形成的一大支與河南信陽株系S7和重慶渝北株系S2構成的進化支形成姐妹群關系(圖4)。

圖4 基于18S rDNA序列構建的ML/BI樹Fig. 4 ML/BI phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

3 討論

本研究從重慶、貴州及河南等地的黃顙魚膽囊中檢獲鲇楚克拉蟲5個株系, 并進行了形態與分子的綜合描述, 重慶秀山、河南信陽、貴州銅仁為該物種的地理新記錄。雖然本研究獲得的5株系孢子整體量度比原始記錄略小, 但整體形態特征與原始記錄基本一致(表1), 其微小的形態差異可能與宿主種類以及地理分布有關。通過對S3、S4、S5、S6和S7之間形態學量度的主成分及顯著性差異分析結果顯示, 各株系間無顯著差異, 這表明地理分布差異對鲇楚克拉蟲的形態變異無明顯影響, 推測本研究鲇楚克拉蟲與原始記錄之間的微小差異, 可能主要與宿主種類不同有關。

雖然物種之間并不存在絕對的界限, 但以往諸多基于18S rDNA為分子標記的黏孢子蟲物種鑒定方面的研究表明, 絕大多數黏孢子蟲的種內相似度為98.6%—100%, 遺傳距離為0—0.007[34—37]。本研究鲇楚克拉蟲各株系間(S1—S7)序列相似度為98.7%—100%; 遺傳距離為0—0.006 (表2), 進一步說明這7株系應為同一物種。序列分析的結果表明,鲇楚克拉蟲7株系間已經形成了不同程度的遺傳分化, 其中最明顯的是湖北株系S1與其他6株系間存在較大程度的遺傳差異, 如S2—S7的遺傳距離為0—0.004 (相似度99.0%—100%), 而S1與其余株系的遺傳距離為0.004—0.006 (相似度98.7%—99.1%)。同時, 在18S rRNA的二級結構上, 湖北株系與其余6株系在V5、V6 (37)和V8構型上存在明顯的差異。這表明, 雖然鲇楚克拉蟲7株系處在種內的遺傳差異水平, 但湖北株系S1表現的巨大差異暗示其可能有著不同的遺傳來源。由于該株系無形態學數據可供比較, 其隱種的可能性不能被排除, 或者該株系可能正處在形成新種的進化階段。

一般而言, 宿主種類、地理隔離及寄生部位差異在寄生蟲種群分化過程中起著非常重要的作用[17,18,38]。然而, 對于黏孢子蟲類群并無一致結論。如有關透鏡碘泡蟲(Myxobolus lentisuturalis)的研究結果表明, 宿主種類差異是透鏡碘泡蟲種群分化的主要因素, 地理隔離對透鏡碘泡蟲種群分化的影響不大[21]。又如吉陶單極蟲(Thelohanellus kitauei)不同地理株系之間的遺傳變異與宿主種類、地理隔離和寄生部位均無明顯相關性[22]。再如蛇鯖庫道蟲(Kudoa thyrsites)不同地理區域間存在顯著的基因流阻礙, 而單個區域內基因交流頻率較高, 這表明地理隔離是蛇鯖庫道蟲種群分化的主要影響因素[39]。本研究鲇楚克拉蟲7株系均寄生于黃顙魚膽囊, 不同的是地理分布, 推測地理隔離可能是7株系間遺傳分化的主要影響因素。然而, 系統發育分析卻顯示, 鲇楚克拉蟲重慶株系并未聚成一支, 而是分散在幾個進化支中, 甚至出現與其他地理株系混合聚支的情況(圖4), 即鲇楚克拉蟲各株系間并未形成地理種群特有的單系。同時, 7株系間遺傳分析的結果也表明, 地理隔離可能并非鲇楚克拉蟲株系分化的決定性因素。鲇楚克拉蟲的遺傳分化可能涉及一些更復雜的問題, 如人為干擾因素(魚類宿主的引種或交易等)和終末宿主(環節動物)的分布及行為等, 這些均有待于今后基于更多樣本和數據進一步研究。