萊州灣日本蔓草分布調查及遺傳多樣性分析

◎ 文/丁金強 張世奎 凌濤 徐一文 趙曉杰

日本蔓草是我國分布最為廣泛的海草種類之一，是藍碳生態系統的重要組成部分。本文通過對萊州灣濰坊龍威底播型海洋牧場海域日本蔓草生態位進行調查，并利用11 個微衛星分子標記對該海域內日本蔓草的種群遺傳多樣性進行分析評價，檢測到等位基因共85 個。其中單個標記的表觀等位基因數（NA）分布為2 ～13，表觀雜合度（HO）的分布為0.5319 ～0.9792，期望雜合度（HE）的分布為0.4806 ～0.8824，該數據表明萊州灣海域的日本蔓草群體遺傳多樣性較高。本項目將為以后開展海草場生態修復工作奠定基礎。

日本蔓草（Zostera japonica）又稱矮蔓草，屬多年生草本，是亞洲特有的擬大葉藻亞屬（Subgenus Zosterella）種類，在中國黃渤海和南海等沿海地區均有分布，也是中國分布最為廣泛的海草種類。日本蔓草具有更強的適應能力，因而生活在大葉藻難以適應的較淺潮間帶（該區域的水溫和光照波動強烈）。日本蔓草還具有重要生態價值，據文獻記載，黃渤海區內日本蔓草曾出現在濰坊市、青島市、煙臺市、威海市、日照市等地。近年來，黃渤海區海草場生境遭破壞嚴重，已很難找到連續大面積日本蔓草分布的海草床。因此，本研究以萊州灣日本蔓草為研究對象，分析萊州灣海域內種群遺傳多樣性，以期為黃渤海海區海草床退化機制、環境效應等研究以及海草場修復奠定基礎。

一、材料與方法

（一）材料

本試驗中所用的日本蔓草全部取自濰坊龍威底播型海洋牧場海域（采樣點見圖1），該區域位于濰坊濱海經濟技術開發區彌河入?？?，中心點經緯度為N（37°11′23.26″）E（119°8′48.9″）。選取完整植株，用清水沖洗干凈，置于塑封袋中，做好標識，–20℃暫存。

圖1 萊州灣分布區（濰坊龍威底播型海洋牧場）采樣站位圖

（二）日本蔓草DNA的提取

使用植物基因組DNA提取試劑盒對日本蔓草進行基因組DNA提?。ň唧w操作參照說明書，略有改進），并利用1%瓊脂糖凝膠電泳對所提取的DNA進行電泳檢測，合格后置于–20℃保存備用。

（三）引物設計與篩選

本研究選用的微衛星標記為中國科學院海洋生態與環境利學重點實驗室開發，選取其中多態性高的微衛星標記，參照其引物序列，略改進，交由基因科技有限公司合成。引物設計的具體參數主要包括：GC含量范圍為45%～55%，引物長度范圍17bp ～25bp，退火溫度范圍為50℃～60℃，控制產物長度范圍100bp ～300bp。

隨機選取該群體內8株日本蔓草的DNA作為模板，對微衛星標記進行多態性篩選。PCR反應參照中國水產科學院研究院黃海水產研究所宋文濤所述方法，總體系具體包括：1μL的日本蔓草DNA（1ng/μL），0.3μL的Taq酶（5U/μL），上、下游引物（10μM）各0.5μL，1.2μL的dNTP（2.5mmol/μL），1.5μL的10×PCR Buff er（Mg2+），滅菌去離子水10μL，共計15μL。PCR程序設置如下：94℃條件下預變性持續3min；94℃條件下變性持續15s，55℃條件下退火持續30s，72℃條件下延伸持續30s，共35個循環；72℃條件下延伸持續10min；4℃條件下暫存。對PCR產物用6%聚丙烯凝膠電泳進行等位基因分型，并用硝酸銀對膠體進行染色、甲醇顯色，篩選統計出多態性豐富的微衛星標記，并拍照保存。

（四）萊州灣日本蔓草群體的種質遺傳學評價

隨機挑選48株日本蔓草作為樣本，用多態性豐富的微衛星標記（共11個）對萊州灣日本蔓草群體的遺傳學特征進行評價（見表1）。所使用的PCR體系、反應程序及基因分型方法同上述。校正電泳偏差，識別并統計各標記位點的等位基因個數：使用GENEPOP3.4軟件計算各標記位點是否符合哈迪-溫伯格平衡，使用Bonferroni軟件予以校正。使用FSTAT2.9.4軟件計算各標記位點間的連鎖不平衡關系，使用Popgen32軟件計算每個標記位點的等位基因數（number of alleles，NA）、有效等位基因數（effective number of alleles，NE）、表觀雜合度（observed heterozygosity，HO）、期望雜合度（expected heterozygosity，HE） 和多態信息含量（Polymorphism Information Content，PIC）等種群遺傳學特征值。

表1 日本蔓草11對微衛星引物的基本信息

二、結果

（一）萊州灣海域日本蔓草的形態學觀察

實地調查發現，萊州灣濰坊龍威底播型海洋牧場海域潮間帶上日本蔓草根狀莖匍匐，直徑為0.5mm ～1.5mm，節間長5mm ～30mm，節上生1枚先出葉和2條纖細的根?；ㄆ跒?月～9月，作為海草場常見的兩種植物，日本蔓草植株較大葉藻矮小。日本蔓草生物學形態見圖2。

圖2 日本蔓草的自然生境和形態特征（示意圖摘自網絡）

（二）基于微衛星標記的種群遺傳學評價

選取11個多態性豐富的微衛星標記對萊州灣（濰坊龍威底播型海洋牧場）日本蔓草群體進行種群遺傳學評價，結果如下：共檢測到等位基因85個；單個標記位點的表觀等位基因數（NA）為2 ～13，平均值為4.722；表觀雜合度（HO）為0.5319 ～0.9792，平均值為0.5037；期望雜合度（HE）為0.4806 ～0.8824，平均值為0.5011（見表2）。經過哈迪-溫伯格平衡檢驗和Bonferroni軟件校正后，有2個微衛星標記位點（Zj042，Zj011）的等位基因頻率不符合（見表2）。經過連鎖不平衡檢測后的結果顯示，本研究中所有標記位點對之間均不存在連鎖不平衡現象。

表2 微衛星標記的萊州灣（濰坊龍威底播型海洋牧場）日本蔓草群體遺傳學特征

三、討論

本研究所用的日本蔓草群體分布于萊州灣群體，是由濰坊龍威底播型海洋牧場海域內3個不同的位點的日本蔓草植株組成，隨機選取的48株個體作為試驗樣本，樣本數量上可代表總體。經Bonferroni軟件校正，仍有2個標記（Zj042和Zj011）的等位基因頻率不符合哈迪-溫伯格平衡：其中Zj042標記位點表現出雜合子顯著缺失（P＜0.05），Zj011標記位點則表現出雜合子顯著過剩（P＜0.05）。分析原因可能是生態條件惡化等因素造成了海草場一定程度上的退化，以及日本蔓草數量減少，致使其種群結構受到影響。此外，該群體是由來自萊州灣3個不同地點的個體組成，人為選擇因素會對結果干擾較大，且日本蔓草本存在營養生殖，導致2個標記（Zj042和Zj011）位點的基因頻率不符合哈迪-溫伯格平衡。上述數據充分說明本研究中萊州灣的日本蔓草群體的遺傳多樣性總體較高，這對于萊州灣群體日本蔓草的遺傳多樣性保護和利用，指導海草場修復具有重要意義。

四、總結與展望

海草場處于近岸淺海，其中日本蔓草分布于離岸更近的潮間帶，自然因素多變，人為擾動對其影響較大，目前仍無法實現對某些因素的精準調控?？傮w而言，我國對海草床生態系統研究還不夠深入，生態修復仍局限于小范圍試驗，更高效、便捷的海草場修復方法尚需進一步研究，大范圍應用推廣尚未展開。本研究通過對萊州灣（濰坊龍威底播型海洋牧場海域）日本蔓草的生境、形態進行初步調查，并對該區域種群的遺傳多樣進行分析評價，為下一步進行海草場修復和海洋資源養護、穩定海洋生態系統以及發揮藍碳功能具有重要意義。