丹參-川芎-紅花對顱腦損傷后大鼠抑郁-心臟損傷的多病研究*

高曌，孫波，蔡雅文，黃熙

（南京中醫藥大學，南京 210023）

顱腦損傷（TBI）是一種臨床中較常見的腦外傷類型，也被稱為“沉默的流行病”。TBI 的嚴重程度根據格拉斯哥昏迷量表（GCS）進行評價：輕度13～15 分，中度9～12 分，重度≤8 分，病理學則多將TBI分為原發性TBI 與繼發性TBI[1]。有研究在腦外傷后2 周開始對患者進行追蹤測評，用GCS 表來評價患者的嚴重程度，漢密爾頓量表（HADS）評估抑郁水平，以談話的方式進行評價。結果顯示，TBI 會引發多種精神疾病，抑郁是TBI 后最主要的并發癥之一[2]。此外，有研究發現一次腦震蕩應激后大鼠，尤其是雄性大鼠即可出現抑郁表現[3]，大鼠TBI 后4 d 出現抑郁樣行為[4]，還有研究通過評估TBI 后24 h 大鼠海馬新生細胞水平以評估TBI 后抑郁發生情況[5]。TBI 后的水腫、神經膠質活化和周圍免疫細胞浸潤等繼發性損傷機制導致細胞死亡和神經功能障礙，有醫學影像學證實TBI 引發抑郁患者顳葉、頂葉和扣帶區域與未引發抑郁患者相比體積顯著變小[6]。此外，也有研究發現抑郁的發病率與TBI 的損傷程度并非正相關，反而是輕度腦損傷（mild TBI）更易引發抑郁。研究發現，mTBI 后1 年發生抑郁癥的患病率為15.3%～18.0%，TBI 后1 年的抑郁發生率53.1%，在mTBI 后8 年高達61.0%。TBI 患者高發抑郁癥的概率范圍很廣，約為15%～77%[7]。此外，有研究發現嚴重TBI 患者通常伴有心血管功能障礙[8]，TBI 患者心臟的肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平以不同于心肌梗死患者的方式升高[9]。認為TBI 可能是一種心腦同病的疾病，并對此進行探究。

研究選擇的中藥方劑丹參-川芎-紅花（丹川紅，DCH）是丹參、川芎、紅花按2∶1∶1 組成的中藥藥隊，其來源是陳可冀院士聯合郭世魁老中醫創建的中藥復方冠心Ⅱ號。該方具有行氣活血，祛瘀通絡的功效，臨床常用于治療冠心病、胸悶不適等，研究發現該方及其主要吸收成分的阿魏酸（FA）具有通過抑制心肌細胞凋亡和半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）活性的方式減少梗死面積，提供了一種心臟保護作用[10]。研究發現，DCH 能發揮抗氧化、抗炎、增加冠狀動脈流速的作用來有效治療缺血性心臟病，并能改善心絞痛[11]，還有證據表明，DCH 可以通過抗炎和神經保護作用有效緩解抑郁癥指標，保護心臟免受炎癥和細胞凋亡[12]。FA 是DCH 中用于大腦保護的主要吸收化合物[11]，最近的1 項研究表明，FA 取代白藜蘆醇是“法國悖論”的主要原因，即盡管高脂肪飲食，但葡萄酒和葡萄多酚的攝入與冠心病的發病率低有關，也證明FA 對心臟有顯著的保護作用[13]。本課題組既往通過超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC-MS/MS）法測得DCH 中主要成分FA的質量濃度為（0.232±0.003）mg/mL，而DCH 臨床治療TBI 患者的劑量為1.5 g/kg（生藥/體質量）。大鼠灌胃量為人的6.7 倍，故DCH 的大鼠灌胃劑量確定為10 g/kg，FA 的大鼠灌胃劑量確定為2 mg/kg，大鼠灌胃體積為1 mL/100 g。

本實驗的造模方式，CCI（controlled cortical impact）造模是常用的TBI 造模方法，通過顱腦損傷儀TBI0310 進行打擊，對大鼠造成中-輕度TBI[14-15]。有研究發現，TBI 后引起的海馬損傷是TBI 后抑郁發生的重要原因[4，16]，本實驗因此選擇使用研究最為廣泛的海馬作為TBI 后大鼠抑郁表現的研究對象。目前對于抑郁癥的研究常用有強迫游泳測試、慢性輕度壓力模型和習得性無助模型[17]，但也有研究發現，即使是一次應激創傷也會引發精神病理學的變化，這一新的概念可以了解應激反應的適應與不適應軌跡的決定因素，以此研究抗抑郁藥的機制[18]。還有研究表明，抑郁癥與樹突萎縮和樹突棘缺失高度相關，特別是在包括海馬在內的與情緒相關的大腦區域[19]，因此選擇海馬神經元樹突的密度和長度作為應激后抑郁發生的評價標準并對其改變的發生機制進行探究，同時，將心肌凋亡指標CK-MB 和Caspase3 作為心臟損傷的評價標準[9-10]?；谏鲜鲅芯勘尘?，認為DCH 和FA 可能對TBI 后的抑郁-心臟損傷具有調節作用，同時認為可能存在一種共享的途徑以調控TBI 后的抑郁-心臟損傷共病，并在接下來的實驗中對這一共享機制進行驗證。

1 材料和方法

1.1 實驗動物信息及分組 SD 大鼠，雄性，體質量約200～280 g；購于南京青紫藍，產地：上海必凱科翼生物科技有限公司；動物許可證號：SCXK-2018-0006。所有動物的飼養和實驗操作都嚴格遵守均遵循國家實驗動物管理條例及南京中醫藥大學實驗動物中心動物飼養和倫理委員會的指導方針，并報送南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會備案，實驗動物倫理號：201912A017。大鼠在適應性喂養1 周后進行TBI 急性實驗。隨機把12 只雄性SD 大鼠分為4 組，每組3 只；對照組-假手術組（Sham）：不擊打直接縫合；模型組（TBI+Vehicle）：造模后待蘇醒灌胃生理鹽水；DCH 組：造模后待蘇醒灌胃10 g/kg DCH 湯劑；FA 組：造模后待蘇醒灌胃2 mg/kg FA。

1.2 主要儀器及試劑耗材 顱腦創傷儀TBI0310Head Impactor（head trauma cont 公司，美國），超純水系統（Millipore 實驗室設備有限公司，美國），酶標儀全波長檢測系統（Tecan TWINFINIE 200，瑞士），Allegra X-30 臺式高速冷凍離心機（貝克曼庫爾特有限公司，美國），HYCD-205 冷藏箱（海爾生物醫療公司，中國），-80 ℃超低溫冰箱（三洋，日本），旋轉蒸發儀（鞏義市予華儀器有限責任公司）BSA2202S 型十萬分之一天平（賽多利斯科學儀器有限公司，德國），Freezone-12L 冷凍干燥機（LABCONCO 公司，美國），正置熒光顯微鏡（Zeiss 公司，德國），冰凍切片機（Thermo 公司，美國），伊文斯藍、甲酰胺、中性樹脂（北京索萊寶科技有限公司，中國），50%/75%/95%/無水乙醇、二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司，中國），FD 快速高爾基染色試劑盒（FD Neuro technologies，inc，美國），5-羥色胺（5-HT）、Ghrelin試劑盒（南京奧青生物技術有限公司，中國），c-Fos試劑盒（Kendall Scientific，美國），腦源性神經營養因子（BDNF，Rabbit，抗體貨號：28205-1-AP），Caspase3（Rabbit，抗體貨號：ab32351），CK -MB（Rabbit，抗體貨號：15137-1-AP），GAPDH（Rabbit，抗體貨號：10494-1-AP），辣根過氧化物酶（HRP）[Goat anti-Rabbit IgG （H+L）Secondary Antibody，抗體貨號：AWS0002]，阿魏酸（南京景竹）。

1.3 中藥DCH 湯劑、凍干粉制備 用天平稱量丹參（批號：20032901，長沙湘雅醫院，山東）68 g，川芎（批號：200525，長沙湘雅醫院，四川）34 g 和紅花（批號：19040296，長沙湘雅醫院，新疆）34 g 置于不銹鋼鍋中，按1∶12 加純水浸泡30 min，用武火煮沸，文火煮30 min。8 層紗布過濾，得濾液。再加12 倍體積純水，重復上述方法，合并兩次藥液。用旋轉蒸發儀將藥液濃縮。取適量液氮將藥液均勻冷凍，放入凍干機冷凍干燥24 h，取下。凍干粉得率（%）=凍干粉質量/中藥質量×100%=45.33%。實驗前稱取凍干粉適量，配成體積適量的濃度為10 g/kg（生藥）的DCH 藥液。

1.4 CCI 造模 使用異氟烷氣體麻醉大鼠，誘導麻醉流量3 mL，麻醉時間3 min。用小動物剃毛機剃去在兩后眼角連線到耳部連線部位毛發。麻醉后放上手術臺，手術臺上墊上保溫墊，大鼠固定在立體視框架中，并在維持2%異氟烷吸入的情況下，先將頭部皮膚剪開，用干棉球擦破黏膜暴露顱骨。在人字縫右邊，前后囟間右側象限，打開一個骨窗，暴露硬腦膜。在顱腦創傷儀TBI0310Head Impactor 上設置好深度速度、停留時間，使用TBI 打擊造成中-輕度損傷（速度：5 m/s，停留時間：2 000 msec，深度：3 mm）[14-15]。然后將頭部傷口縫合，在傷口涂上碘伏，將老鼠放在保溫墊上待蘇醒后灌胃。造模后存活率100%。

1.5 高爾基染色及分析法 大鼠腹腔取血后取出整個腦組織，在雙蒸餾水中沖洗血液。使用FD 快速高爾基氏染色試劑盒按照要求進行染色。染色結束后室溫晾干，在正置熒光顯微鏡下觀察并拍攝圖片。使用Image J 對神經元照片進行樹突棘密度（Spine density）和樹突長度的計數分析。樹突棘密度是由End-pooint voxels 除以Longest Shortest Path 計算得出，數據結果通常以樹突棘數/10 μm（Spines/10 μm）表示。樹突的長度是通過對目標神經元樹突描摹后進行測量，其結果為來自一個神經元的樹突長度的總和，二值化后獲取神經元樹突骨骼圖。

1.6 制備大鼠血清、海馬、心臟樣本 持續吸入異氟烷麻醉狀態下對大鼠進行腹腔取血，取血后斷頭處死，將腦置于冰盒上，剝離海馬、心臟，胃、小腸，用超純水沖洗干凈。吸干表面的液體，放入凍存管中經液氮速凍，后存放于-80 ℃超低溫冰箱待檢。血液放入離心機，在3 500 r/min 離心15 min，離心半徑為10 cm，取上清液存于EP 管，保存在-80 ℃冰箱。

1.7 ELISA 檢測 對各組大鼠血清、海馬和心臟樣本處理后，按照ELISA 試劑盒的步驟進行檢測。指標包括：血清、海馬、心臟：c-Fos、Ghrelin；血清：5-HT、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β和IL-6；心臟：內皮型一氧化氮合酶（eNOS）。

1.8 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測方法 組織蛋白提取后進行電泳，電泳結束后轉膜清洗，用1×磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置90 min，而后用一抗孵育90 min后4℃過夜，二抗室溫孵育90 min。ECL 顯色曝光。指標包括海馬：BDNF；心臟：BDNF、CK-MB、Caspase3。

1.9 數據處理及統計學方法 所有數據均采用graphpad prism 9 軟件進行統計分析和作圖。計量資料以均值±標準誤（Mean±SEM）表示。多組間計量資料的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用Dunnett’s 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 TBI 應激前后及給藥后大鼠海馬樹突棘密度變化比較 TBI 應激后Vehicle 組樹突棘密度顯著降低，給藥后給藥組樹突棘密度有所恢復。證明急性應激TBI 會導致海馬樹突棘密度變小，給藥后有一定恢復效果。見圖1。

圖1 TBI 應激前后及給藥后海馬樹突棘密度對比（樹突棘數/10 μm，n=3）Fig.1 Comparison of dendritic spine density in hippocampus before and after TBI stress and after drug administration (Spines/10 μm，n=3)

2.2 TBI 應激前后及給藥后大鼠海馬樹突長度比較 TBI 造模后Vehicle 組樹突長度降低，給藥后給藥組樹突長度有所恢復，證明TBI 急性應激會導致海馬樹突長度變短，給藥后有一定恢復效果。見圖2。

圖2 TBI 前后及給藥后海馬神經元長度比較（50 μm，n=3）Fig.2 Comparison of hippocampal neuron length before and after TBI and after drug administration(50 μm，n=3)

2.3 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清相關指標水平差異比較 研究發現，炎性因子對海馬神經元突觸可塑性具有調控的作用，并因此對神經系統疾病產生影響[20]。TBI 應激后，與Sham 組相比，大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 均有顯著增加（P＜0.000 1），給藥DCH 和FA 后炎性因子水平均顯著降低。血清5-HT 水平可以反映抑郁發生的情況，TBI 后大鼠血清5-HT 水平顯著降低，給藥后水平升高。見圖3。

圖3 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清炎性因子水平差異比較（n=3）Fig.3 Comparison of serum inflammatory factors in rats before and after TBI stress and after drug administration(n=3)

2.4 TBI 應激前后及給藥后大鼠心臟相關指標水平差異比較 研究發現eNOS 對血管內皮具有重要的保護作用[21]，eNOS 水平可以反映應激后心臟損傷的程度。大鼠TBI 應激后心臟eNOS 水平明顯降低，在給藥后eNOS 升高。心肌損傷指標CK-MB 和心肌凋亡指標Caspase3 均可反映心臟的損傷水平。TBI 應激后心臟CK-MB 和Caspase3 水平明顯均明顯上升趨勢，在給藥后有不同程度的下降趨勢。見圖4。

圖4 TBI 應激前后及給藥后大鼠心臟eNOS，CK-MB 和Caspase3 水平差異比較（n=3）Fig.4 Comparison of eNOS，CK-MB and Caspase3 levels in rat heart before and after TBI stress and after drug administration(n=3)

2.5 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清、海馬、心臟c-Fos 表達比較 TBI 應激后大鼠血清、海馬、心臟c-Fos 表達均呈現明顯上升趨勢，給藥后減少。見圖5。

圖5 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清、海馬、心臟c-Fos 表達（n=3）Fig.5 Expression of c-Fos in serum，hippocampus and heart of rats before and after TBI stress and after drug administration(n=3)

2.6 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清、海馬、心臟Ghrelin 表達比較 TBI 應激后大鼠血清、海馬、心臟Ghrelin 表達，呈現為TBI 應激后大鼠海馬Ghrelin明顯下降，給藥后上升。見圖6。

圖6 TBI 應激前后及給藥后大鼠血清、海馬、心臟Ghrelin 表達（n=3）Fig.6 Expression of Ghrelin in serum，hippocampus and heart of rats before and after TBI stress and after drug administration(n=3)

2.7 TBI 應激前后及給藥后大鼠海馬、心臟BDNF 表達比較 大鼠TBI 后海馬、心臟中BDNF 水平明顯降低，在給藥后BDNF 有不同程度的上升。見圖7。

圖7 TBI 應激前后及給藥后大鼠海馬、心臟BDNF 表達（n=3）Fig.7 Expression of BDNF in hippocampus and heart of rats before and after TBI stress and after drug administration(n=3)

3 討論

盡管已有研究認識到TBI 與心血管病變發生之間具有相關性[22]，對于TBI 后抑郁-心臟損傷多病發生的機制依舊并不明確，本實驗對TBI 后抑郁-心臟損傷的機制探究基于多病這一概念。越來越多的醫學研究者將目光放在多病這一概念上，有報道對蘇黎世大學醫院內科急診患者進行研究[23]，發現內科臨床住院患者約有70%～90%為多病患者[24]。以冠心病為例，約有83%以上的冠心病患者為多病人群，即同時主要合并有兩個及以上的疾病表現[25]。

有研究表明，抑郁癥與樹突萎縮和樹突棘缺失高度相關，特別是在包括海馬在內的與情緒相關的大腦區域[26-27]，本研究通過對TBI 后大鼠海馬的精神病理研究，發現TBI 應激后大鼠海馬樹突長度、樹突棘密度顯著減少，給藥DCH 和FA 后這一情況有所緩解。TBI 應激后顯著增加的血清促炎性指標（IL-1β、IL-6 和TNF-α）也在給藥后降低，說明給藥后可以通過對突觸可塑性發揮作用以發揮抗抑郁作用。此外，心臟eNOS 應激后水平下降，心臟損傷指標CK-MB 和Caspase3 顯著上升，給藥后逆轉，表明給藥后心臟損傷問題有改善。上述結果一定程度上體現了DCH 和FA 的抗抑郁和心臟保護作用。

c-Fos 作為信號傳導系統的第三信使對細胞的生長、分化和功能活動至關重要，通常通過對不同腦區表達量的分析用來識別神經元的活動情況來描繪在使用精神活性化合物治療后被調節的神經元回路[28-29]。c-Fos 的短暫激活伴隨著皮層腦損傷，其表現類似于抑郁癥的發展[30]，同時還對神經的可塑性產生作用[31]。研究發現，c-Fos 的異常高表達可能是高血壓病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的發病原因之一[32]。在本實驗對TBI 應激及給藥前后大鼠血清、海馬、心臟均進行了c-Fos 水平的檢測，發現c-Fos 在各個組織的表達具有一致性，即應激后的模型組c-Fos 在各個組織的表達量最高，給藥后c-Fos 表達一定程度上有所減少。在海馬中，FA 和DCH 均顯著降低了應激后大鼠的c-Fos 水平，一定程度上證明治療對應激后的腦具有重要的保護作用，緩解了突觸可塑性的損傷加重程度，在心臟中也具有緩解應激損傷的作用。

Ghrelin 是一種胃腸道分泌生成的生長激素釋放肽。有研究認為Ghrelin 可以通過與生長激素促分泌激素受體的結合而發揮作用參與調節多種生命活動進程，對許多疾病產生有益影響[33]。Ghrelin可以通過調節海馬突觸可塑性改善患者的抑郁狀態[34]，可以改善心臟功能和重塑，預防嚴重的心律失常，促進心肌梗死后的重塑[35]。本實驗對TBI 應激及給藥前后大鼠血清、海馬、心臟均進行了Ghrelin 水平的檢測，發現Ghrelin 在各個組織的表達具有一致性，即TBI 后的模型組c-Fos 表達量最低，給藥后Ghrelin 表達一定程度上有所增加。

BDNF 是一種腦源性神經營養因子，具有調控神經元突觸可塑性的能力，有研究發現，BDNF 的上調可能會逆轉成人大腦中應激誘導的結構和突觸可塑性缺陷[36]，在抑郁癥患者血液中低水平表達，予抗抑郁藥物后明顯增加[37]。BDNF 在對血管內皮細胞的生長、發育，以及缺血內皮細胞增殖、移行的過程中同樣起著重要的作用[38]，有研究發現BDNF 可以降低氧化應激和細胞凋亡，并通過激活eNOS/一氧化氮（NO）通路，保護心臟免受感染性心功能不全的損害[39]。還有研究發現，Ghrelin 可以通過環磷酸腺苷（cAMP）/環磷酸腺苷效應元件結合蛋白（CREB）通路調節BDNF 的表達[40]。本實驗中，給藥后顯著增加應激后TBI 大鼠的BDNF 的表達，可能是通過調節Ghrelin 水平，使BNDF 表達量增加，對突觸可塑性產生影響，減輕了TBI 大鼠的抑郁樣行為，同時在心臟發揮保護作用。

基于上述研究結果，研究發現TBI 后的抑郁-心臟損傷具有多病發作的特征，Ghrelin-BDNF/c-Fos 可能是抑郁-心臟損傷的共享途徑，其發生機制可能是在TBI 應激后，在腦中，海馬中Ghrelin 水平降低，導致BDNF 水平降低，腦保護作用減弱，同時Ghrelin 對c-Fos 的表達抑制效果減弱，表現為c-Fos表達量劇增后誘導的炎性因子增多，對突觸可塑性造成損傷，海馬樹突長度、樹突棘密度減少，抑郁發生。與此同時，在心臟中，應激后Ghrelin 減少導致BDNF 減少，eNOS 減少，心臟保護能力減弱，心臟保護能力減弱，與此同時c-Fos 高表達損傷了心肌細胞和內皮細胞，對心臟造成了負面影響。DCH 及主要吸收成分FA 可能是通過對這一調控途徑的調節改善了抑郁-心臟損傷的多病病變，值得進一步研究。