安菲博肽生物活性測定

戴向榮,梁杰,蔣濤,李剛,許雷鳴

[1.兆科藥業(合肥)有限公司,合肥 230088;2.安徽省食品藥品檢驗研究院,合肥 230051]

目前抗血小板藥物根據不同的作用機制主要有環氧化酶(cyclooxygenase,COX)抑制劑,如阿司匹林;腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,adp)受體拮抗劑,如氯吡格雷;磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制劑,如雙嘧達莫、西洛他唑;血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(platelet membrane glycoprotein Ⅱb/Ⅲa,GPⅡb/Ⅲa)受體拮抗劑,如替羅非班以及其他抗血小板藥物,如奧扎格雷[1-4]。

GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑主要作用于血小板膜糖蛋白(glycoprotein,GP),通過阻斷GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原結合阻止血小板聚集[5-8]。GP是介導血小板聚集的關鍵成分,GPIb是血小板表面最主要的糖蛋白之一,與GPⅡb/Ⅲa介導的粘附機制不同,它通常只介導在高剪切力作用下的粘附[9-11]。GPIb與血管性血友病因子(von willebrand factor,vWF)特異性結合,使血小板粘附到血管壁上,導致血小板聚集,引起血栓[12-13]。因此,通過阻斷GPIb與血漿vWF結合,可阻止血小板粘附在血管內皮細胞壁上,抑制血小板聚集。這種阻斷作用不涉及凝血酶類及任何其他凝血因子,安全性高,將成為特異性更好的抗血栓藥物的新方向。

安菲博肽(anfibatide,ANF)是從皖南尖吻蝮蛇毒中提取到的一種多肽藥物,由α、β 鏈兩條肽鏈組成,其比活力大于每毫克蛋白1 000個活力單位[14],是首創血小板GPIbα受體拮抗劑。在健康測試人中具有快速起效、有效及可逆的抗血栓作用,不損害凝血功能或延長出血時間。其作用機制為介導血小板聚集關鍵成分的GPIb 蛋白,阻斷其與血漿vWF 結合,阻止血小板粘附在血管內皮細胞壁上,從而抑制血小板聚集[15]?？寡“逯委熓切难懿≈匾闹委煼椒?由于其治療后仍存在出血或再次血栓的問題,臨床實驗室可以通過檢測血小板功能監測患者治療情況。檢測血小板功能有諸多方法,如光學比濁法、全血電阻法、連續血小板計數法等,其原理是通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后血小板數量的改變來評估血小板功能[16-17]。本研究通過比較以上3種血小板功能檢測方法,優選安菲博肽生物活性測定方法,并對該方法進行驗證。

1 儀器與試藥

1.1儀器 四通道光學聚集儀(CHRONO-LOG Corporation,型號:700),血小板聚集儀(CHRONO-LOG Corporation,型號:700),血小板功能分析儀(江蘇英諾華醫療技術有限公司,型號:PL-12),真空采血管(Becton,Dickinson And Company,規格:0.109 M,3.2%枸櫞酸鈉),微量移液器[艾本德(上海)國際貿易有限公司,規格:10 μL,100 μL,1 000 μL];PL-12專用樣品杯(江蘇英諾華醫療技術有限公司)。

1.2試藥 安菲博肽[兆科藥業(合肥)有限公司,規格:每支10 U,批號:20180205、20180206、20190601];安菲博肽安慰劑[兆科藥業(合肥)有限公司,批號:20190603];0.9%氯化鈉溶液(華潤雙鶴利民藥業有限公司,批號:21011301B);PLR-01血小板稀釋液(江蘇英諾華醫療技術有限公司,批號:22006022)、血小板分析儀專用清洗液(江蘇英諾華醫療技術有限公司,批號:22001151);瑞斯托霉素(American Biochemical &Pharmaceuticals Ltd.,批號:880204)。

2 方法與結果

2.1溶液的制備

2.1.1誘聚劑的配制 取1支瑞斯托霉素(ristomycin,RIS)凍干粉,加0.9%氯化鈉溶液配制成100 mg·mL-1RIS母液,分裝,-20 ℃冰箱保存;檢測前取出,室溫溶解后混勻,0.9%氯化鈉溶液稀釋至250 mg·mL-1(光學比濁法、全血電阻法)和7.7 mg·mL-1(連續血小板計數法),備用。

2.1.2血樣的制備

2.1.2.1富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)的制備 抽取健康受試者血液,置含有1/10體積枸櫞酸鈉抗凝液(0.109 mol·L-1)的硅化玻璃管中混勻,1 000 r·min-1(r=8.2 cm)離心6 min,收集上清液。

2.1.2.2貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP)的制備 將上述剩余血液4 000 r·min-1(r=8.2 cm)離心10 min,取上清液。

2.1.2.3全血取樣 空腹或餐后2 h采用肘靜脈取血法采取健康人血液于真空采血管中備用。本試驗已獲得蚌埠醫學院第一附屬醫院臨床醫學研究倫理委員會審查通過批件。

2.1.3供試品溶液配制 取安菲博肽(每支10 U)3支,每支加入0.9%氯化鈉溶液200 μL溶解,合并,混勻,備用。

2.1.4空白溶液的配制 取0.9%氯化鈉溶液10 μL和全血290 μL,置PL-12專用樣品杯,輕輕混勻樣品,室溫孵育5 min,備用。

2.1.5空白輔料溶液的配制 取安菲博肽安慰劑(批號:20190603)3支,每支加0.9%氯化鈉溶液200 μL溶解,合并、混勻,取稀釋空白輔料溶液10 μL和全血290 μL至PL-12專用樣品杯,輕輕混勻樣品,室溫孵育5 min,備用。

2.2方法步驟

2.2.1光學比濁法 以PPP 350 μL進行透光率調節。比濁管中加入PRP 350 μL,37 ℃孵育3 min,加入125 mg·mL-1誘聚劑7.2 μL,記錄對照管血小板聚集百分率。比濁管中加入PRP 350 μL,加入供試品溶液10 μL,37 ℃孵育3 min,加入125 mg·mL-1誘聚劑7.2 μL,記錄樣品管血小板聚集百分率。血小板聚集抑制百分率(%)=(對照管血小板聚集百分率-樣品管血小板聚集百分率)/對照管血小板聚集百分率×100%。

2.2.2全血電阻法 取全血0.5 mL,加入0.9%氯化鈉溶液0.5 mL,37 ℃孵育3 min,加入電極放入檢測通道,然后加入誘聚劑20 μL(125 mg·mL-1),記錄聚集曲線,測定電阻值,為對照電阻值。取全血0.5 mL,加入0.9%氯化鈉溶液0.5 mL和供試品溶液10 μL,37 ℃孵育3 min,加入電極放入檢測通道,再加入誘聚劑20 μL(125 mg·mL-1),記錄聚集曲線,測定電阻值,為供試品電阻值。血小板聚集抑制百分率(%)=(對照管電阻值-供試品電阻值)/對照管電阻值×100%。

2.2.3連續血小板計數法 將含待測供試品溶液(或空白溶液)的PL-12樣品杯,移至PL-12全自動血小板功能分析儀自動檢測。檢測開始后,首先進行2次血小板基礎值計數(最終基礎值為2次平均值),然后自動加入7.7 mg·mL-1RIS誘聚劑30 μL,當血小板計數達到最低時停止檢測,計算最大聚集率(maximal aggregation ratio,MAR)。MAR(%)=(最終基礎血小板數-最低血小板數)/最終基礎血小板數×100%,血小板聚集抑制率(%)=(空白溶液聚集率-供試品溶液聚集率)/空白溶液聚集率×100%。

2.3數據分析方法 采用SPSS19.0版統計軟件分析,多組樣本間差異采用單因素方差(One-way ANOVA)分析方法,對數據進行分析。

2.4方法篩選 分別以光學比濁法、全血電阻法和連續血小板計數法對3批安菲博肽進行活性檢測,結果見表1—3。3種不同方法檢測3批安菲博肽活性,均差異無統計學意義,說明3種方法檢測安菲博肽活性結果呈正相關。此前,也有通過光學比濁法與連續血小板計數法監測血小板聚集功能的比較,證實連續血小板計數法對全血標本檢測與光學比濁法在檢測血小板聚集功能時具有較好相關性[16-17]。綜上,連續血小板計數法檢測安菲博肽活性,RSD較小,檢測數據較其他2種檢測方法更穩定,故采用連續血小板計數法檢測安菲博肽生物學活性。

表1 安菲博肽活性檢測結果(光學比濁法)

表2 安菲博肽活性檢測結果(全血電阻法)

表3 安菲博肽活性檢測結果(連續血小板計數法)

2.5方法學考察

2.5.1專屬性考察 考察空白溶液(0.9%氯化鈉溶液)、空白輔料溶液是否干擾安菲博肽活性檢測結果,結果見表4。由表4可知,空白溶液、空白輔料溶液抑制率為0,不干擾安菲博肽活性檢測。

表4 專屬性實驗結果

2.5.2線性范圍考察 配制0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 U供試品溶液(批號:20190601),平行測定,結果見表5。以供試品活性單位(U)為橫坐標,抑制率(%)為縱坐標,擬合標準曲線得Y=1.334X+0.062 4,相關系數r為0.994(>0.990)。安菲博肽活性檢測在0.3～0.5 U范圍內呈線性關系。

表5 線性范圍考察結果

2.5.3精密度考察

2.5.3.1重復性 分別配制供試品溶液6組(批號:20190601),平行測定,結果見表6。由表6可知,6組樣品抑制率RSD為11.0%(<20%)。

表6 精密度、重復性、中間精密度實驗結果

2.5.3.2中間精密度 不同時間、不同人員分別配制供試品溶液6組(批號:20190601),平行測定,結果見表6。結合重復性檢測結果,12組樣品抑制率RSD為9.8%(<20%)。

2.5.4不同人血樣對活性的影響 考察不同人血樣對連續血小板計數法檢測安菲博肽活性的影響,隨機采用6份不同人的血樣作為樣本,另取2份處于血小板正常范圍[(100～350)×109·L-1]上限和下限血樣,作為樣本7(85×109·L-1)、樣本8(383×109·L-1);以上述空白溶液、安菲博肽(批號:20190601)于血小板功能分析儀檢測樣品溶液的抑制率。結果見表7,以6份隨機不同人血樣檢測得安菲博肽(批號:20190601)抑制率為50.7%、48.1%、43.3%、45.4%、47.4%、43.7%,RSD為6.2%,以樣本7、樣本8血樣檢測得安菲博肽(批號:20190601)的抑制率為45.3%、42.8%,RSD為4.0%,可知不同人血樣不影響連續血小板計數法檢測安菲博肽的生物活性。

表7 不同人血樣對安菲博肽活性測定的影響

3 討論

光學比濁法應用于血小板功能檢測比較廣泛,甚至被認為是血小板功能檢測方法的“金標準”,但該法存在操作繁雜、質量控制難等問題[18-19]。全血電阻法則通過加入誘導劑,誘導血小板聚集,因電極回路中電阻增加,電流減少,儀器通過檢測電阻的變化來確定血小板聚集率[20]。連續血小板計數法是以庫爾特原理為基礎的新型血小板功能檢測方法,通過觀察誘聚劑引起血小板聚集前后全血中血小板數量的改變來評估血小板功能[16]。通過光學比濁法、全血電阻法、連續血小板計數法檢測安菲博肽活性,3種方法檢測安菲博肽活性結果呈正相關,且連續血小板計數法檢測安菲博肽活性RSD較小,檢測數據更穩定。因此,本實驗確定以連續血小板計數法、以藥物抑制率為評價指標檢測安菲博肽的生物活性。

筆者在本實驗建立了安菲博肽活性測定方法,并通過對方法專屬性、精密度、準確度、線性范圍進行驗證,該方法操作簡便,專屬性、準確度和精密度符合生物制品活性測定要求。通過測定3批次安菲博肽活性,3批次結果一致,說明批次之間質量穩定和均一。所建立的方法可用于該產品的質量控制和一致性分析,同時可為其他類型蛋白藥物的質量控制提供參考。