基于數據挖掘和網絡藥理學探討楊麗新治療抽動障礙用藥規律和作用機制

胡彬文，段然，張潞璐，余婉兒（1. 廣東省中醫院呂英名醫工作室，廣東廣州 510120；2. 廣東省中醫院兒科，廣東廣州 510120；3.廣州黃埔區蘿崗街社區衛生服務中心，廣東廣州 510700；. 廣州中醫藥大學，廣東廣州 51005）

抽動障礙（Tic disorders，TD）是一種神經精神發育障礙性疾病，主要發生在兒童和青少年，臨床表現以無節律、多發、刻板的運動性抽動和發聲性抽動為特征。抽動障礙常伴有注意力缺陷多動障礙（Attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD）、學習困難（Learning difficulties）等疾病，對患兒的學習、社交和心理健康產生了嚴重影響[1]。目前對于抽動障礙的治療，西藥治療具有一定的局限性和副作用[2]。

在中醫藥方面，雖然無明確記載抽動障礙的病名，但根據其臨床表現，中醫學者將本病歸于肝風證、慢驚風、瘛疭等范疇。楊麗新教授從事小兒神經系統疾病診療30 余年，有豐富的臨床經驗，師從羅笑容教授并繼承了肝脾兩臟辨治的學術觀點[3]，靈活運用“補脾平肝瀉心”六字訣治療抽動障礙[4]，認為抽動障礙病位在肝，與心脾腎相關，其標為風痰，臟腑失調，虛實并見，提出本病病機為“脾虛肝旺，風痰內擾”。

本研究搜集楊麗新教授2016 年于廣東省中醫院兒科門診治療抽動障礙的門診醫案，運用“中醫傳承輔助平臺（V2.5）”分析總結楊麗新教授治療抽動障礙的用藥規律，并根據分析結果進行網絡藥理學分析，以探索其治療抽動障礙處方中核心藥物的藥物靶點及可能作用機制，以期更好地指導該病的臨床實踐。

1 材料與方法

1.1 臨床醫案數據挖掘研究

1.1.2 納入標準 抽動障礙西醫診斷標準符合《兒童抽動障礙診斷與治療專家共識（2017 實用版）》[5]標準。中醫診斷標準參考《中醫診斷學》[6]《中醫兒科學》[7]。符合以上中西醫診斷的患兒；病案信息完整；復診時患兒抽動情況有改善，和/或相關癥狀減輕或消失者，同時符合上述3項者，為納入病例。

1.1.3 排除標準 不符合以上納入標準者；患兒經檢查有其他系統的嚴重疾??；患有其他兒童行為障礙疾病或精神類疾病者。

1.1.4 處方錄入與核對 對中西醫診斷進行統一命名，如“兒童抽動障礙”“小兒抽動癥”“抽動癥”“TS”和“抽動穢語綜合征”都統一為“抽動障礙”；規范處方用藥，根據《中華人民共和國藥典》[8]對處方藥物合并、修改。將全部病案資料導入“中醫傳承輔助平臺（V2.5）”，通過“臨床采集”錄入患兒的基本信息和中藥處方，并且雙人核對，保證資料的正確性。

1.1.5 數據分析 使用“中醫傳承輔助平臺（V2.5）”進行數據管理和挖掘，對處方中藥使用頻數、性味歸經、功效分類進行統計分析。運用關聯規則進行組方分析，基于K-means 算法進行聚類得到核心組合方。

1.2 網絡藥理學研究

1.2.1 核心中藥處方靶點與抽動障礙疾病靶點篩選將處方分析中的高頻藥物在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、TCMID（https：//www.megabionet.org/tcmid/）、Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數據庫中檢索，得到的中藥成分在TCMSP 數據庫中進行篩選，以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 作為條件篩選活性成分，同時結合已發表的文獻報道對篩選后的成分進行補充。在TCMSP 數據庫進行活性成分靶點蛋白的預測，在Uniprot 數據庫（h-ttps：//www.uniprot.org/）查詢所對應的基因名稱，剔除非人類的靶點基因。在Genecard 數據庫（https：//www.genecards.org）、Drugbank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）及TTD 數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）中以“Tic Disorders”為關鍵詞檢索疾病靶點。

Some Ideas on the Development Mode of Smart Grid TONG Guangyi,WANG Mengzhen,DU Songhuai,HU Bo,SU Juan(21)

1.2.2 “藥物-活性成分-靶點”網絡圖構建及蛋白相互作用分析 在Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中導入獲得的疾病靶點與藥物靶點，生成韋恩圖，得到交集靶點。使用Cytoscape 3.7.2 軟件構建“藥物-有效成分靶點”關系網絡。利用STRING 數據庫（https：//string-db.org），限制為“homo sapiens”后，在線分析蛋白之間的互相作用，設置最高置信度評分＞0.40。使用Cytoscape軟件，將互作網絡的信息導入其中，再利用bisogenet插件計算網絡，根據度值（degree）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）等條件，對靶點進行中位數過濾，來選取核心網絡。

1.2.3 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 采用Metascape 在線數據庫（https：//metascape.org/）對獲得的關鍵靶點進行靶點基因GO 功能及KEGG 通路富集分析，分別獲得相應的富集分析結果（P＜0.05），最后利用R語言進行可視化繪圖。

1.3 分子對接分析 通過PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取核心藥物主要有效成分的SDF 格式文件，在PDB 數據庫（http：//www.rcsb.org/）收集關鍵靶點蛋白結構，使用PyMOL 軟件對靶點進行清除水分子和小分子配體等優化處理并用AutoDock Tools 進行加氫與電荷處理并另存為pdbqt格式。以關鍵靶點為受體，以其對應的有效成分作為配體，利用Pyrx軟件內部的vina進行分子對接，計算結合能及輸出結果文件。最終利用PyMOL 軟件進行結果可視化處理。其Affinity（kcal·mol-1）值即代表兩者結合的結合能力，結合能力越低，配體與受體結合越穩定。使用PyMOL（https：//pymol.org/2/）對其行可視化分析。

2 結果

2.1 病案數據挖掘研究

2.1.1 藥物出現頻數及藥效分類 共錄入3 443 個病例，涉及77 味中藥，使用頻率不低于50%的共10 味藥，詳見表1。參考《中藥學》[9]，按照功效對藥物進行歸類和統計，結果發現解表類藥物出現頻數最多，共8 874 次；其次為平肝熄風類藥物，出現了8 648次，藥效分類見圖1。

圖1 楊麗新治療抽動障礙中藥的藥效分類分析Figure 1 Drug eifficacy analysis of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表1 楊麗新治療抽動障礙中藥的頻數分析Table 1 Drug frequency analysis of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.1.2 藥物的性味歸經統計 經過統計分析，發現77 味中藥的性味以寒溫、辛甘苦為主，多歸肺、脾、肝、胃四經，詳見圖2。

圖2 楊麗新治療抽動障礙藥物的性味歸經分析圖（頻數/次）Figure 2 Analysis of drug nature， flavour and meridians of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders（frequence/times）

2.1.3 基于關聯規則的組方規律分析 在“關聯規則”分析中，設置支持度80%、置信度為90%，分析得到6 味核心中藥（竹茹、法半夏、陳皮、牡蠣、茯苓、甘草），共32條藥物組合。按核心藥物組合置信度由高到低排序，常用藥對組合見表2。6 味核心藥物的關系見圖3。

圖3 楊麗新治療抽動障礙核心藥物關系的網絡可視化分析Figure 3 Visualization analysis of relationship network for core TCM of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表2 楊麗新治療抽動障礙常用的核心藥物組合關聯規則Table 2 Correlation rules of core drugs combinations and correlation rules of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.1.4 核心組合統計分析 見表3，利用“聚類分析”功能（k-means 算法與回歸模型相結合），將“聚類”列為4，得到4 組核心組合。反映了楊麗新教授治療抽動障礙處方中配伍關系相對密切、固定的4 組藥物，即核心組方。

表3 基于聚類分析的楊麗新治療抽動障礙的核心組合Table 3 Core drugs formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2 基于網絡藥理學研究核心藥物治療抽動障礙的機制

2.2.1 篩選核心中藥成分與作用靶點 基于中藥頻數分析，陳皮、甘草、法半夏、竹茹、茯苓、牡蠣及鉤藤為使用頻次＞75%的高頻藥物，故選這7種藥物作為楊麗新教授治療抽動障礙的核心組方進行分析。通過TCMSP 數據庫篩選及文獻補充[10-11]，去重后得到核心藥物的活性成分145 個，其中共有成分4 個。對活性成分靶點進行檢索，將數據規范化及去重后得到220 個靶點?；钚猿煞忠云匆羰鬃帜?數字編號，共有成分編號為A、B、C、D，導入Cytoscape 3.7.2軟件中，構建藥物-活性成分-靶點的網絡圖，詳見圖4。網絡共包含373 個節點（含145 個活性成分、220 個靶點基因），2 691 條邊。由于活性成分較多，篩選度值排序前10 位的活性成分進行展示，詳見表4。

圖4 楊麗新治療抽動障礙核心組方藥物的“藥物-活性成分-靶點”網絡圖Figure 4 Network diagram of “medicinals-active ingredients-targets” for core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表4 楊麗新治療抽動障礙核心組方的活性成分Table 4 Active ingredients of core drugs formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.2 核心處方治療抽動障礙的作用靶點 基于Genecard、TTD 及Drugbank 數據庫篩選抽動障礙相關靶標分別有77、5 及1 220 個，經過除重后得到1 290個疾病靶點。將1 290個疾病靶點及220個成分靶點導入Venny 2.1.0 中，取得共同靶點58 個，繪制韋恩圖，詳見圖5。

圖5 楊麗新治療抽動障礙核心組方藥物靶點與抽動障礙疾病靶點共有靶點的韋恩圖Figure 5 Venn diagram of common targets between target of tic disorders and drug target of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.3 蛋白互作網絡分析 將靶點信息導入STRING在線數據庫，置信度評分＞0.40，隱藏游離節點，得到核心處方治療抽動障礙的對應的靶標PPI（Protein-Protein Interaction，PPI）網絡，將其導入Cytoscape 軟件做可視化處理。靶點越接近中心、顏色越紅則靶點相互作用度越高，結果見圖6。運用Cytoscape 的bisogenet 做疾病和藥物的PPI 網絡，根據度值、介度中心性、接近中心性、特征向量中心性來選取核心網絡，詳見圖7。

圖6 楊麗新治療抽動障礙核心組方的蛋白質互相作用網絡圖Figure 6 Protein interaction network diagram of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

圖7 楊麗新治療抽動障礙核心組方的核心靶點網絡Figure 7 Core targets network of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 運用Metascape 數據庫對58 個共同靶點進行GO 功能及KEGG 通路富集分析。得到GO 功能富集條目422 條，其中生物過程（BP）304條，主要包括多細胞系統調節通路、對有機氮化合物的反應通路及膜電位調節通路等。細胞組成（CC）44 條，包括突觸、離子通道復合物及樹突等。分子功能（MF）74 條，包括G 蛋白偶聯胺受體、神經遞質受體活性及門控通道活性等。生物功能186 條。根據GO 富集結果，應用R 語言對前20 位繪圖，見圖8。篩選得到KEGG 通路68 條，取前20 位應用R 語言繪制KEGG 氣泡圖，見圖9。得到神經活性配體-受體相互作用、血清素的神經突觸、cGMP-PKG等關鍵信號通路。

圖8 楊麗新核心組方治療抽動障礙的GO 功能富集分析Figure 8 GO analysis of Professor YANG Lixin’s core formula for the treatment of tic disorders

圖9 楊麗新核心組方治療抽動障礙的KEGG 功能富集分析Figure 9 KEGG analysis of Professor YANG Lixin’s core formula for the treatment of tic disorders

2.3 分子對接分析 選取表4 中度值最高的4 個活性成分與圖6 中前4 個核心靶點，進行分子對接。成分與靶點的結合能見表5，研究[12]認為，對接能量值小于-4.25 kcal·mol-1表示兩者間有一定的結合活性，小于-5.0 kcal·mol-1表示有較好的結合活性，小于-7.0 kcal·mol-1表示有強烈的結合活性。結果顯示，各靶點與活性成分的對接結合能均小于-5.0 kcal·mol-1，說明受體蛋白與配體小分子之間具有較好的結合活性，其中刺芒柄花素與HTR2A，β-豆甾醇與HTR2C，山柰酚與SCL6A4、HTR2A 有非常強的結合活性。PyMOL中進行可視化分析，結果見圖10。

圖10 核心靶點與成分分子對接模式圖Figure 10 Molecular docking pattern diagram between core targets and molecules of active ingredients

表5 分子對接結合能分析（kcal·mol-1）Table 5 The analysis of binding energy of molecular docking（kcal·mol-1）

3 討論

3.1 用藥規律 抽動障礙癥狀及共患病對部分患兒生活造成困擾，治療上存在依從性較差和藥物不良反應的問題。中醫藥治療抽動障礙臨床療效顯著，楊麗新教授經過多年臨床實踐，在治療兒童抽動障礙上形成了一套獨特的理論體系，本研究通過數據挖掘及網絡藥理學研究歸納楊麗新教授的用藥規律及可能的作用機制。

本研究結果顯示，楊麗新教授治療抽動障礙用藥藥性以寒溫并用，藥味以辛、甘、苦味最多。寒藥清熱平肝，溫藥溫化痰邪、溫通經絡，又能以溫宣溫散之法祛除肝風，同時制約寒性藥物，顧護脾胃?！端貑枴づK氣法時論》中指出：“肝苦急，急食甘以緩之”“肝欲散，急食辛以散之，用辛補之，酸瀉之”“脾欲緩，急食甘以緩之，用苦瀉之，甘補之”，以辛開甘補為主，辛開苦降為輔，共奏調肝理脾之功。

楊麗新教授用藥多歸肺、脾經，肝、胃經次之，解表與平肝熄風藥物使用頻率高達8 000 次?！峨s病源流犀燭》曰：“風邪襲人，不論何處感受，必內歸于肺?！薄端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩唬骸爸T風掉眩，皆屬于肝”。小兒肺、脾常不足，肝常有余，肺衛不固，風邪趁虛入里，脾虛不運則痰濕停滯，外風引動內風，風痰流竄，造成抽動反復發作，因此應平肝熄風同時兼顧肺脾，宜用宣肺解表與健脾補肺藥物，提高抗御外邪的能力，日常讓患兒加強調護，增強體質。脾胃互為表里，胃強脾弱則中焦氣機升降失常，氣滯則肝郁，故運脾必當和胃。楊麗新教授治療抽動障礙使用辛、甘、苦、平之品，寒溫并調，通過調肺、健脾和胃、疏肝平肝、化痰的方法，恢復臟腑的正常生理功能，從而達到抽動自止的目的。

使用頻次＞75%的藥物有陳皮（97.30%）、甘草（96.72%）、法半夏（94.25%）、竹茹（94.19%）、茯苓（89.75%）、牡蠣（85.94%）、鉤藤（79.70%），通過關聯規則分析共獲得32 組常用藥物組合，聚類分析共得到4 組核心組合，其中“甘草-法半夏-竹茹-陳皮-茯苓-僵蠶”出現頻率最高，綜合結果得出核心組方為二陳湯，其中：法半夏、陳皮燥濕化痰，二者皆以陳久者良，無過燥之弊，并結合茯苓的健脾滲濕，杜生痰之源，甘草調和諸藥又益氣補中，加竹茹的清熱化痰、除煩，可用于治療膽火挾痰、驚悸不寧[13]等癥狀。鉤藤有平肝熄風之功效，《藥性論》曰：“主小兒驚啼，瘈疭熱壅”。王向明等[14]從鉤藤提取鉤藤堿，發現鉤藤堿組大鼠腦中多巴胺含量顯著高于模型對照組，提示鉤藤堿具有調節腦內多巴胺表達的作用。牡蠣味咸澀，歸肝腎經，具有鎮靜安神、平肝潛陽的功效，主要化學成分為鈣鹽，含有多種微量元素，具有抗驚厥的藥理作用[15]。以上組合體現了楊麗新教授“補脾平肝瀉心”的六字思想。

3.2 作用機制 將楊麗新教授治療抽動障礙的高頻藥物進行網絡藥理學研究，其中的關鍵成分包括：山柰酚、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、刺芒柄花素、β-豆甾醇與黃芩素等。山柰酚（Kaempferol，KAE），又名山柰素、山柰黃酮醇，是一種多羥基黃酮類化合物，廣泛存在于各種蔬菜及水果中。山柰酚對神經系統有保護作用，包括抗炎、抗氧化、抗驚厥、抗抑郁、抗癡呆，以及對缺血腦組織的保護作用等[16]。抽動障礙患兒存在抑制性氨基酸及興奮性氨基酸失衡的情況[17]。山柰酚可以有效降低谷氨酸含量，降低氧化應激作用[18]。刺芒柄花素（Formononetin，FMN）是一種異黃酮類化合物，研究發現[19]FMN可以抑制星形膠質細胞、神經元和小膠質細胞中COX-2 的活性，有效降低顱內炎癥介質含量，如腫瘤壞死因子（TNF）-α和IL-6。β-豆甾醇[19]是一種植物甾醇，實驗證明β-豆甾醇可通過增加過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的活性，提高體內抗氧化酶活性的能力，改善金屬中毒后小鼠認知能力、運動協調性及減少大腦損傷[20]。

為了探索有效藥物活性成分治療抽動障礙的作用機制，構建了活性成分與疾病的網絡PPI圖，篩選出核心作用靶點后進行KEGG 通路和GO 功能富集分析。核心成分的靶標主要與神經遞質的轉運以及活性相關。目前主要認為抽動障礙的產生與神經生化、遺傳、免疫等因素相關，從神經生化的角度分析，相關研究發現抽動障礙與多巴胺（Dopamine，DA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、腎上腺素（Noradrenaline，NE）等神經遞質的水平失調有關，尤其與大腦DA 水平關系密切[21]。SLC6A3編碼多巴胺轉運蛋白，在突觸間的多巴胺濃度調節中發揮重要作用[22]。SLC6A4 編碼的5-羥色胺轉運體可以從突觸或細胞外空間重新攝取5-HT，從而調節大腦中的5-HT活動[23]。HTR2A 編碼5-羥色胺受體2A，其表達增高可引起大腦內5-HT的表達水平下降[24]。

核心靶點的主要信號通路也與體內神經遞質的調節密切相關。神經活性配體受體相互作用信號通路（Neuroactive ligand- receptor interaction）與調控人體學習、認知、焦慮情緒等相關，通過調節細胞內受體結合相關基因表達[25]，對神經遞質調節、心理、行為等產生影響，從而對抽動障礙發揮治療作用。研究[26]表明部分抽動障礙患者在鏈球菌感染后出現癥狀加重，cGHP-PKG 具有調節蛋白磷酸酶、細胞內鈣離子水平以及神經遞質的功能，其中蛋白磷酸酶參與免疫信號轉導的功效。cGMP 信號傳導功能障礙與記憶障礙密切相關，細胞內鈣離子水平影響神經肌肉興奮性，同時也參與神經遞質釋放及激素調節等過程，考慮該通路可能通過影響體內免疫傳導、記憶認知以及神經-體液調節等過程影響患兒的行為和認知[27]。有研究發現抽動障礙患者基底節區5-HT 的含量下降[28]，而給予對5-HT 受體有高親和力的新一代抗精神病藥物利培酮，可有效治療患有情緒障礙的抽動障礙患兒[29-30]，提示核心成分可能通過作用于血清素能突觸通路（Serotonergic synapse pathway），調節5-HT 含量，對疾病起到一定的治療作用。分子對接結果進一步證明，組方核心成分與相關疾病靶點之間有良好的結合活性，核心組方可能通過山柰酚、刺芒柄花素、β-豆甾醇作用于SCL6A4、HTR2C、HTR2A等靶點對兒童抽動障礙起治療作用。

4 小結

通過對楊麗新教授門診病歷處方進行的數據挖掘及網絡藥理學分析，結果表明楊麗新教授治療抽動障礙重在平肝熄風，健脾化痰，兼顧肺臟，常采用溫膽湯結合臨床辨證化裁，用藥配伍寒溫并用，固護脾胃，提倡“補脾平肝瀉心”。網絡藥理學研究得出的核心組方可能通過山柰酚、刺芒柄花素、β-豆甾醇等活性成分作用于相關信號通路，調節大腦DA、5-HT等神經遞質水平來治療兒童抽動障礙。