lncRNA HIF1A-AS1對長春新堿耐藥視網膜母細胞瘤細胞化療敏感性的影響

何道侗,高 玉

0 引言

視網膜母細胞瘤(retinoblastoma,RB)是一種主要發生于兒童的視網膜惡性腫瘤,占所有兒科惡性腫瘤的4%,嚴重影響兒童的視力和生命健康[1]。RB的臨床治療主要包括化療、放療、手術等局部治療,其中化療為最常見的治療方法,化療可以避免患者眼球摘除,提高患者的生存率和生活質量。長春新堿(vincristine,VCR)是臨床常用于RB治療的一線化療藥物,具有良好的療效。但是,長期應用會產生耐藥性及多藥耐藥反應,極大減弱化療效果甚至造成化療失敗[2]。因此,減輕RB的VCR耐藥性對提升化療效果具有重大價值。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在RB的發生發展中起著重要的調控作用。報道顯示,ZF-PM2反義RNA 1(ZFPM2-AS1)、肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcrip,MALAT1)等多種lncRNAs與RB的進展有關[3-4]。lncRNA HIF1A-AS1位于人類第14號染色體缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)的反義鏈上,Hong等[5]研究顯示,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達可通過降低HIF-1α/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)介導的自噬,促進肝癌細胞凋亡。HIF-1α是細胞低氧應激的主要調節因子,可參與腫瘤血管生成,能量代謝,促進腫瘤惡性進展及抗放化療等[6]。已有研究報道顯示[7],HIF-1α在RB組織中表達水平升高,HIF-1α信號通路可介導低氧誘導的RB細胞侵襲,上調HIF-1α表達可增加RB細胞對VCR的耐藥性。但lncRNA HIF1A-AS1是否通過調控HIF-1α表達參與RB對VCR的耐藥性在國內尚未見報道。本研究探索lncRNA HIF1A-AS1對VCR耐藥的人RB細胞化療敏感性的影響及可能機制。

1 材料和方法

1.1材料人視網膜母細胞瘤細胞SO-RB50購于中國科學院細胞庫;VCR(B20157)購自上海源葉生物科技有限公司;抑制lncRNA HIF1A-AS1表達質粒(si-lncRNA HIF1A-AS1,序列5’-GUCAAUUGGUUGAUCACCCG-3’)及對照si-NC(序列:5’-UUCUCCGAACGUCACGUTT-3’)、HIF-1α過表達質粒(HIF-1α,序列:5’-ATCTCATCCAAGAAGCCCT-3’)、對照pcDNA質粒(序列:5’-AAGTAATCAC TCGGTTAGAA-3’ )以及lncRNA HIF1A-AS1、HIF-1α、內參GAPDH引物購自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol試劑(15596018)購自Invitrogen;SYBR Green Master(4913914001)購自Roche;LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(11668030)購自Thermo Scientific;高效RIPA裂解液(R0010)、CCK-8(cell counting kit-8)試劑盒(CA1210)購自索萊寶生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(40302ES20)購自上海翌圣生物科技有限公司;兔抗人HIF-1α(AF7087)、多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance associate protein,MRP)(AF7503)、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)(AF2245)、β-肌動蛋白(β-actin)(AF5003)抗體以及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗(A0208)購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1RBVCR耐藥細胞株SO-RB50/VCR的建立SO-RB50細胞在含有10% FBS的RPMI 1640培養基中培養,加入起始濃度為75 ng/mL VCR連續培養2 wk,采用濃度遞增法[8]建立SO-RB50/VCR,直至SO-RB50細胞可在600 ng/mL的VCR中穩定生長。

1.2.2細胞轉染將對數期的SO-RB50/VCR細胞接種于6孔板中,當細胞達到70%融合時,對細胞進行轉染,根據轉染質粒,將細胞分為對照組(正常培養的SO-RB50/VCR細胞,不進行轉染)、si-NC組(將si-NC轉染至SO-RB50/VCR細胞)、si-HIF1A-AS1組(將si-HIF1A-AS1轉染至SO-RB50/VCR細胞)、si-HIF1A-AS1+pcDNA組(將si-HIF1A-AS1和pcDNA共轉染至SO-RB50/VCR細胞)、si-HIF1A-AS1+HIF-1α組(將si-HIF1A-AS1和HIF-1α過表達質粒共轉染至SO-RB50/VCR細胞),轉染48 h后,使用熒光素同工異構體(FITC)進行標記,并與轉染物結合后通過流式細胞儀檢測轉染效率。流式細胞術檢測顯示轉染效率達60%進行后續實驗。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖和對VCR的半抑制濃度取對數生長期的各組SO-RB50/VCR細胞,按照每孔5×104個細胞接種至96孔板中培養48h,然后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,孵育2 h后,測定各組細胞酶標儀450 nm處吸光度值(optical density,OD450)。

取對數生長期的各組SO-RB50/VCR細胞,按照每孔5×104個細胞接種至96孔板中,每孔分別加入終濃度為0.005、0.010、0.050、0.100、0.500、1.000 μg/mL的VCR,各組對照孔加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶液,培養48 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液,孵育2 h后,測定各組細胞酶標儀450 nm處吸光度值。計算各VCR濃度組的生長抑制率(%)=(1-實驗孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%,其中實驗孔為對照組、si-NC組、si-HIF1A-AS1組、si-HIF1A-AS1+pcDNA組及si-HIF1A-AS1+HIF-1α組給藥濃度>0的含細胞孔,對照孔為各組給藥濃度為0的含細胞孔,調零孔為無細胞的孔。計算時首先將實驗孔或對照孔的值減去調零孔值,再取每個劑量組各孔的平均值。根據抑制率及對應濃度使用SPSS 25.0計算出各組細胞的半抑制濃度(median inhibitory concentration,IC50)。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測lncRNAHIF1A-AS1和HIF-1αmRNA相對表達Trizol試劑提取細胞中總RNA,NanoDrop分光光度計檢測RNA濃度和純度,使用逆轉錄試劑盒將RNA合成cDNA后,通過使用ETC811PCR擴增儀進行PCR擴增,qPCR引物如下:lncRNA HIF1A-AS1上游引物5’-TTCGGTACTTTACGCACCCT-3’;下游引物5’-TTTTCCTCCTTTTCGCCAGC-3’;HIF-1α上游引物:5’-TCAAGTCAGCAACGTGGAAG-3’;下游引物:5’-ATCGAGGCTGTGTCGACTG-3’;3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物:5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTT-3’G;下游引物:5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。以GAPDH為內參,采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.2.5細胞凋亡實驗轉染后的各組SO-RB50/VCR細胞接種于96孔板中培養24 h后,胰酶消化后用binding buffer制備成1×105cell/mL的細胞懸液,再加入5 μL Annexin V-FITC與10 μL的PI,避光孵育20 min,通過使用BD FACSCantoTMⅡ流式細胞儀檢測細胞凋亡,并使用flowjo 10軟件對數據進行分析。

1.2.6Westernblot檢測HIF-1α和MRP及P-gp蛋白表達收集各組細胞,加入RIPA蛋白裂解液冰上裂解1 h,離心收集上清,BCA法檢測蛋白濃度,取30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入按照說明書進行稀釋的抗HIF-1α(1∶1 000稀釋)、MRP(1∶500稀釋)、P-gp(1∶1 000稀釋)、β-actin(1∶1 000稀釋)一抗稀釋液,4 ℃孵育過夜,次日加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶2 000稀釋),室溫孵育60 min,TBST洗滌后加ECL發光液顯影,以β-actin為內參,Image J 軟件分析蛋白相對表達。

2 結果

2.1lncRNAHIF1A-AS1和HIF-1α蛋白在SO-RB50和SO-RB50/VCR細胞表達情況與SO-RB50細胞相比,SO-RB50/VCR細胞中lncRNA HIF1A-AS1和HIF-1α蛋白表達水平明顯升高,差異均有統計學意義(t=7.497、13.717,P<0.001),見圖1。

圖1 lncRNA HIF1A-AS1和HIF-1α蛋白在SO-RB50和SO-RB50/VCR細胞表達情況 A:SO-RB50和SO-RB50/VCR細胞lncRNA HIF1A-AS1表達;B:SO-RB50和SO-RB50/VCR細胞HIF-1α蛋白表達;aP<0.05 vs SO-RB50細胞。

2.2lncRNAHIF1A-AS1表達對SO-RB50/VCR細胞VCR耐藥性的影響與si-NC組相比,si-HIF1A-AS1組SO-RB50/VCR細胞中lncRNA HIF1A-AS1表達水平、OD450及細胞對VCR的IC50值均顯著降低,差異均有統計學意義(F=92.336,62.111,15.545,均P<0.001),si-HIF1A-AS1組SO-RB50/VCR細胞凋亡率顯著升高,差異有統計學意義(F=182.048,P<0.001),MRP及P-gp蛋白表達水平均顯著降低,差異均有統計學意義(F=108.953,93.964,均P<0.001),見圖2。

圖2 lncRNA HIF1A-AS1表達對SO-RB50/VCR細胞VCR耐藥性的影響 A:各組細胞lncRNA HIF1A-AS1表達比較;B:各組細胞OD450值比較;C:各組細胞對VCR的IC50值比較;D:各組細胞凋亡率比較;E:各組細胞MRP、P-gp蛋白表達比較;aP<0.05 vs si-NC組。

2.3lncRNAHIF1A-AS1對SO-RB50/VCR細胞中HIF-1αmRNA和蛋白表達的影響與si-NC組相比,si-HIF1A-AS1組SO-RB50/VCR細胞HIF-1α蛋白表達水平顯著降低,差異有統計學意義(F=188.188,P<0.001),HIF-1α mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05),見圖3。

圖3 lncRNA HIF1A-AS1對SO-RB50/VCR細胞中HIF-1α mRNA和蛋白表達的影響 A:各組細胞HIF-1α mRNA表達比較;B:各組細胞HIF-1α蛋白表達比較;aP<0.05 vs si-NC組。

2.4lncRNAHIF1A-AS1對SO-RB50/VCR細胞VCR耐藥性影響與si-HIF1A-AS1+pcDNA相比,si-HIF1A-AS1+HIF-1α組SO-RB50/VCR細胞OD450、對VCR的IC50值均顯著升高,差異均有統計學意義(F=35.586,7.412,P<0.001),SO-RB50/VCR細胞凋亡率顯著降低,差異有統計學意義(F=21.629,P<0.001),HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表達水平均顯著升高,差異均有統計學意義(F=209.638,105.085,90.196,均P<0.001),si-HIF1A-AS1組與si-HIF1A-AS1+pcDNA組比較差異無統計學意義(P>0.05),見圖4。

圖4 lncRNA HIF1A-AS1對SO-RB50/VCR細胞VCR耐藥性影響 A:各組細胞OD450值比較;B:各組細胞對VCR的IC50值比較;C:各組細胞凋亡率比較;D:各組細胞HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表達比較;aP<0.05 vs si-HIF1A-AS1+pcDNA組。

3 討論

化療是目前治療RB的主要方法,聯合使用長春新堿、依托泊苷和卡鉑的VEC方案是最常用的全身靜脈化療方案[8]。然而RB對VCR耐藥是導致患者化療失敗的原因之一[9]。耐藥性RB會引起腫瘤轉移,并增加復發的可能性。而有關RB對VCR耐藥的機制尚不完全清楚。因此研究其耐藥機制,降低RB對VCR耐藥性對提高RB治療的療效有重要意義[10-11]。

lncRNA對人類多種疾病具有調控作用,已有研究顯示,lncRNA可通過調控腫瘤細胞增殖、凋亡、自噬等影響腫瘤細胞對放化療的敏感性[12]。研究顯示[13],lncRNA X染色體失活基因(X chromosome inactivation,XIST)在RB組織和細胞系中高表達,抑制lncRNA XIST表達可減弱RB細胞的增殖和自噬,增強VCR敏感性。另外,也有研究顯示lncRNA DLGAP1-AS2在RB組織中的表達高于正常視網膜組織,沉默lncRNA DLGAP1-AS2可抑制RB細胞增殖、遷移和侵襲,可作為視網膜母細胞瘤治療的潛在靶點[14]。lncRNA HIF1A-AS1可通過調控腫瘤細胞增殖、凋亡、自噬等生物學行為參與腫瘤的發生發展,研究顯示,lncRNA HIF1A-AS1在肺癌、肝癌、結直腸癌等腫瘤中表達上調,與腫瘤進展和患者預后相關[15-16]。另外,有研究表明lncRNA HIF1A-AS1還可參與調節血管平滑肌細胞增殖,可能與動脈瘤的發病機制有關[17]。lncRNA HIF1A-AS1與RB化療耐藥性的關系及其機制尚不完全明確。本研究發現耐藥SO-RB50/VCR細胞中lncRNA HIF1A-AS1表達水平高于SO-RB50細胞,初步證實了的高表達狀態與RB細胞呈現化療耐藥性有關。為探究lncRNA HIF1A-AS1對SO-RB50/VCR細胞的作用,在SO-RB50/VCR細胞中轉染si-lncRNA HIF1A-AS1,結果顯示,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達可顯著降低SO-RB50/VCR細胞增殖水平,誘導細胞凋亡,表明抑制lncRNA HIF1A-AS1可以顯著降低SO-RB50/VCR的生物學功能,提高其對VCR藥物的敏感性。MRP是細胞耐藥形成機制調節蛋白之一,P-gp是膜轉運蛋白,單一藥物的長期治療激活P-gp是腫瘤細胞耐藥的主要原因[18]。本研究抑制lncRNA HIF1A-AS1表達后,SO-RB50/VCR中耐藥相關蛋白MRP、P-gp蛋白表達水平顯著降低,細胞對VCR的IC50值降低,進一步證明,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達則可顯著抑制RB細胞化療耐藥性的產生。

HIF-1α是一種轉錄因子,在低氧環境下,通過低氧反應原件與靶基因結合,調控轉錄過程,可參與調節腫瘤血管形成、腫瘤轉移與侵襲、糖酵解、癌細胞干性等生物學功能。研究顯示,HIF-1α在肝癌、肺癌等腫瘤中高表達,并在缺氧條件下促進腫瘤惡性發展[19-20],而抑制HIF-1α表達可增強結直腸癌細胞的放射敏感性[21]。另外,也有研究顯示下調HIF-1α表達后可促進缺氧損傷的視網膜神經膠質細胞活力,并能抑制視網膜新生血管[22]。本研究結果顯示,HIF-1α在SO-RB50耐藥細胞SO-RB50/VCR中表達水平升高,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達后HIF-1α蛋白表達水平降低,而HIF-1α mRNA表達水平不變,提示HIF-1α參與SO-RB50/VCR耐藥,且lncRNA HIF1A-AS1可能調控HIF-1α轉錄后水平。在SO-RB50/VCR細胞中同時抑制lncRNA HIF1A-AS1表達和過表達HIF-1α,發現SO-RB50/VCR細胞凋亡率較單抑制lncRNA HIF1A-AS1表達顯著降低,OD450、VCR對細胞的IC50值及HIF-1α、MRP、P-gp蛋白表達水平顯著升高,提示過表達HIF-1α可部分抵消抑制lncRNA HIF1A-AS1表達對SO-RB50/VCR細胞耐藥性的抑制作用。以上結果表明,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達可以通過抑制HIF-1α表達,降低SO-RB50/VCR細胞對VCR的耐藥性。但本研究僅測試一種RB細胞株,缺乏實驗全面性,對于RB常用化療藥物還有卡鉑、依托泊苷等臨床用藥,因此,后續本研究將使用不同的RB細胞株,并建立不同的耐化療藥物細胞株,深入探究lncRNA HIF1A-AS1與HIF-1α對RB的耐藥性影響。

綜上,lncRNA HIF1A-AS1在SO-RB50/VCR細胞中高表達,抑制lncRNA HIF1A-AS1表達可通過下調HIF-1α表達抑制SO-RB50/VCR細胞增殖,并降低SO-RB50/VCR細胞對VCR的耐藥性,從而提高VCR耐藥RB細胞對VCR的化療敏感性,可作為耐VCR視網膜母細胞瘤化學藥物治療的新的潛在靶點。