血清和玻璃體中miR-126和miR-325與增生性玻璃體視網膜病變嚴重程度的關系

唐 辛,劉志明,徐寧達,李佳睿,黃旅珍

0 引言

增生性玻璃體視網膜病變(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是指患者孔源性視網膜脫離(rhegmatogenous retinal detachment,RRD)后出現的炎癥性眼病,也是致盲的主要原因[1]。其臨床特征主要為玻璃體混濁、出現棕色顆粒、視網膜組織僵硬且有褶皺等[2]。臨床只能通過手術干預治療,尚無特效治療PVR手段[3]。因此,尋求新的生物標志物為PVR的診治研究提供新的研究方向十分必要。微小RNA(miRNA)在各種生物學過程中發揮關鍵作用,如細胞免疫、增殖、分化、血管生成等[4]。除血清、眼淚、母乳等常規體液外,最近在玻璃體中也發現了miRNA[5]。據報道,一些miRNA與玻璃體視網膜疾病的進展關系較為緊密[6]。miR-126、miR-325在緩解炎癥和促進血管的形成中發揮重要作用,但其在PVR發生發展中的作用研究較少[7-9]。本研究通過檢測PVR患者血清和玻璃體中miR-126、miR-325的表達情況,旨在探討miR-126、miR-325與PVR嚴重程度的關系。

1 對象和方法

1.1對象回顧性研究。選取2019-10/2022-10在本院治療的PVR患者100例100眼。納入標準:(1)確診為PVR患者[10];(2)均接受標準的平坦部玻璃體切除術;(3)自愿參與本研究;(4)無認知障礙,能自主交流并主動配合醫生的檢查。排除標準:(1)雙眼病變患者;(2)孕婦、哺乳期的婦女;(3)合并青光眼、白內障、先天性弱視者;(4)患有高血壓、系統性紅斑狼瘡、惡性腫瘤等疾病。按照視網膜病變程度分級[9],分為A(玻璃體內有云霧狀或色素性顆粒中混濁)、B(視網膜內面出現皺褶和視網膜裂孔有卷邊,視網膜血管明顯迂曲)、C(視網膜脫離處,出現全層固定皺褶)、D(整個眼底有視網膜全層固定皺褶,皺褶以視乳頭為中心形成漏斗狀,漏斗的尖端朝向視乳頭)。A/B為輕度組42眼,C/D為重度組58眼。選取同期因眼外傷在本院進行玻璃體切除術無視網膜病變的患者30例30眼為對照組。本研究通過醫院倫理委員會批準,所有參與者均知情同意。

1.2方法所有患者術前抽取靜脈血,4 ℃自然凝固后離心分離血清,玻璃體液在手術室完成采集。使用TRIzol總RNA抽提試劑盒(德國Qiagen公司)提取總RNA,紫外分光光度計測定RNA純度,使OD260/OD280為1.8-2.0,逆轉錄試劑盒(TaKaRa)轉錄合成cDNA。采用qRT-PCR試劑盒(德國Qiagen公司)配制25 μL反應體系:SYBR Green I qPCR Master Mix 12.5 μL,正反向引物各0.5 μL,cDNA模板2.5 μL,ddH2O 9 μL?；靹蚝笤跓晒舛縋CR儀(美國ABI公司)中進行擴增,反應設置為95 ℃預變性2 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環。以U6為內參基因。根據NCBI相應的序列設計引物,引物序列見表1。反應結束后采用2-ΔΔCt法計算miR-126、miR-325的相對表達量。使用特定的酶聯免疫測定(ELISA)試劑盒(Abcam,San Francisco,USA)檢測血清、玻璃體中轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β),血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor,PDGF),血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)水平。使用酶標儀(EpochTMMicroplate Spectrophotometer,USA)測量450 nm處的吸光度。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1兩組患者一般資料比較PVR組與對照組患者一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2兩組患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較PVR患者血清和玻璃體中miR-126水平較對照組降低,miR-325水平較對照組升高,差異均有統計學意義(P<0.01),見表3。

表3 兩組患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較

2.3不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平比較重度組患者血清和玻璃體中miR-126水平較輕度組下降,miR-325水平較輕度組上升,差異均有統計學意義(P<0.01),見表4。

表4 不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中miR-126和miR-325水平

2.4不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中細胞因子水平比較重度組患者血清和玻璃體中TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平較輕度組上升,差異均有統計學意義(P<0.01),見表5。

表5 不同病變程度PVR患者血清和玻璃體中細胞因子水平比較

2.5PVR組患者血清miR-126和miR-325水平與細胞因子水平的相關性PVR組患者血清miR-126水平與miR-325、TGF-β、VEGF、TNF-α水平負相關(r=-0.677、-0.486、-0.498,-0.513,均P<0.05),與PDGF水平弱相關(r=-0.289,P<0.05)。miR-325與TGF-β、VEGF、TNF-α水平正相關(r=0.509、0.544、0.492,均P<0.05),與PDGF水平弱相關(r=0.253,P<0.05)。

2.6PVR組患者玻璃體中miR-126和miR-325水平與細胞因子水平的相關性PVR組患者玻璃體中miR-126水平與miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平負相關(r=-0.458、-0.375、-0.608、-0.478、-0.714,均P<0.05)。miR-325水平與PDGF、TNF-α水平正相關(r=0.527、0.562,均P<0.05),與TGF-β、VEGF水平弱相關(r=0.242、0.261,均P<0.05)。

2.7影響PVR病變嚴重程度的Logistic分析以是否發生重度PVR為變量(是=1,否=0)為因變量,以表4、5中有統計學差異性的miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、VEGF、TNF-α水平(均為實測值)為自變量,采用逐步回歸法進行Logistic回歸分析,提示血清和玻璃體中miR-126、miR-325、TGF-β、PDGF、TNF-α均是發生重度PVR的影響因素(均P<0.05),見表6。

表6 影響PVR病變嚴重程度的Logistic分析

3 討論

PVR是一種致盲性疾病,與視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)細胞中的上皮細胞-間充質(epithelial-mesenchymal transition,EMT)有關,病理發展過程為破壞血-視網膜屏障、使細胞增殖遷移、形成與收縮增殖膜、沉積細胞外基質(extracellular matrix,ECM)以及視網膜皺褶形成[11-12]。在因孔源性視網膜脫離而接受視網膜手術患者中,約5%-10%患者會發生PVR,占術后失敗75%[11]。視網膜反復脫離和PVR的產生導致視網膜損傷,手術結果較差[13]。目前PVR發病機制尚不明確,但多項研究表明,miRNA與PVR發生、發展密切相關[14],因此分析血清和玻璃體中miRNA水平可能是識別疾病生物標志物一個有希望的熱門領域。

研究發現,miR-126在視網膜病變中發揮作用,如miR-126-5p在糖尿病視網膜神經變性中表達下調,可作為評估視網膜神經變性的生物標志物[15]。Zheng等[16]發現與非糖尿病大鼠相比,糖尿病大鼠血清和視網膜miR-126水平下調,向玻璃體內輸送miR-126可緩解視網膜病變情況。然而miR-126、miR-325在PVR中的研究較少。本研究結果顯示,在PVR患者血清和玻璃體中,miR-126表達量均下調,隨著疾病加重進一步下調,且血清和玻璃體中高水平miR-126是發生重度PVR的影響因素,提示miR-126在PCR發生發展中發揮作用。PVR發生時,ECM和各種類型細胞會形成視網膜前膜(epiretinal membranes,ERM),導致視網膜皺褶的出現對視網膜進行牽拉最終導致視網膜脫離(retinal detachment,RD)[12]。有報道稱miR-325-3p過表達可促進EMT進程[17]。本試驗中PVR患者血清和玻璃體的miR-325表達量上調,且重度組高于輕度組,血清和玻璃體中高水平miR-325是發生重度PVR的影響因素,提示miR-325可能在PVR中發揮致病作用。本試驗中還發現,PVR患者血清和玻璃體miR-126與miR-325水平呈負相關,提示miR-126、miR-325表達可能相互調節共同參與PVR的發生發展,并且與PVR的嚴重程度有關。

幾乎PVR所有危險因素都與RPE在玻璃體中的擴散或血眼屏障的破壞有關[18]。在PVR患者的視網膜撕裂過程中,分離RPE細胞會接觸到玻璃體,導致玻璃體刺激視網膜表面RPE細胞的遷移;同時,炎癥介質等促進RPE細胞產生膠原蛋白,進一步導致ERM形成和收縮[19]。由此可見,RPE細胞是ERM形成的主要參與者,在PVR中起著至關重要作用。生長因子和炎癥因子都是PVR中EMT過程的介質,主要包括TGF-β、TNF-α、PDGF以及黏附因子ICAM-1等[20]。研究發現,PVR中ERM發生與TGF-β和TNF-α信號通路激活有關,且TNF-α信號通路是該過程中的關鍵,這些因素協同激活成人RPE細胞中的EMT程序[21]。也有研究表明TGF-β、TNF-α和PDGF上調與PVR的嚴重程度密切相關[22]。Hsiao等[23]表明TGF-β2的釋放可能促進人類RPE細胞中VEGF產生。本研究結果與Mudhar[22]研究類似,在PVR重度組患者的血清和玻璃體中,TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF水平均顯著高于輕度組。進一步分析顯示,上述指標與miR-126水平均呈負相關,而與miR-325水平均呈正相關。在增殖型糖尿病視網膜病變中,miR-126已被證實,可通過靶向VEGF調節血管發育,進而影響視網膜病變過程[24]。因此推測,miR-126在PVR進展中的作用可能與靶向調節TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF有關。另外,miR-325-3p的表達已被證實可被TGF-β誘導,并對EMT有積極影響[25]。本研究推測miR-325在PVR中可能通過調節TGF-β、TNF-α、PDGF、VEGF等炎癥因子和血管生成因子表達,影響視網膜中的炎癥反應和EMT過程,進而促進視網膜前膜的沉積和剝離,導致PVR發生或進展。

綜上所述,隨PVR疾病的加重,血清和玻璃體中miR-126表達降低,miR-325表達升高,且與TGF-β、TNF-α、VEGF、PDGF具有相關性。二者可能通過調節炎癥反應和EMT過程參與PVR的發生和進展,然而具體的作用和機制需要設計進一步的試驗來確定。