角膜基質再生與修復的研究進展

鄭天爍,時雪靜,辛 萌

0 引言

角膜是眼部的一個透明、無血管的組織,其中基質層是角膜最主要的組成部分,厚度占整個角膜的90%以上,在維持角膜物理學特性、形態的穩定和透明性等方面起到關鍵的作用。因此,任何由于損傷或疾病引起的角膜基質損害都會導致視力不同程度的下降,當這種視力損害進行性加重且不可逆轉時,往往需要通過角膜移植手術來恢復角膜透明度和視力[1]。角膜移植手術是目前最常見和最成功的器官移植手術,大致分為穿透性角膜移植、板層角膜移植、角膜內皮移植和其他方式移植。盡管角膜移植的總體成功率高達85%-90%,但接受角膜移植術的患者中出現免疫排斥反應和不可預測的散光等術后并發癥的概率大約為18%-21%,而對于有炎癥和合并其他病癥(例如化學燒傷、自身免疫性疾病)的高?；颊?并發癥和失敗率高達49%。并且,隨著角膜移植需求的日益增長,全球人類角膜供體組織已經無法滿足這一日益增長的需求[2-3]。因此,本文就角膜基質再生技術研究進展和存在的問題做一綜合分析,期望為角膜基質再生醫學的研究提供新的思路。

1 干細胞誘導的角膜基質再生

干細胞是存在于胚胎和成體生物體中的未分化細胞,具有多向分化的潛能和自我更新的能力。由于干細胞的增殖潛力和可塑性,已在包括眼睛在內的許多組織和器官中探索用于組織再生,如利用胚胎干細胞或誘導多能干細胞進行干細胞治療,替代喪失的視網膜細胞并改善視力[4]。目前已有多項干細胞治療角膜疾病的臨床試驗,包括使用間充質干細胞、角膜基質干細胞等進行基質再生[5]。

1.1間充質干細胞間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)具有分化為多種角膜結構細胞的能力,通過免疫調控、減輕炎癥和抑制新生血管在組織結構修復中發揮重要作用[6]。MSC可以從許多人體組織中獲得,包括骨髓、臍帶、脂肪組織、牙髓、毛囊和胎盤等[7]。有研究表明,所有類型的MSC在體內可能具有相似的行為,因此能夠實現角膜細胞分化并通過免疫調節特性調節角膜基質[8]。既往研究已經證明骨髓間充質干細胞可以轉化為角膜細胞樣細胞,并有可能恢復角膜基質的透明度[9]。在另一項研究中,使用人類臍帶間充質干細胞(umbilical mesenchymal stem cells,UMCS)直接注射到角膜基質中,結果顯示它們能夠恢復異常膠原蛋白的生成,增加角膜厚度并提高角膜透明度。此外,注入的細胞減少了炎癥細胞因子,減輕了排斥反應[10]。Aghamollaei等[11]研究則進一步證實了使用人臍帶沃頓膠間充質干細胞的再細胞化人角膜透鏡的安全性。一項基于脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSC)的Ⅰ期臨床試驗證明,使用自體ADSC對人角膜基質進行細胞治療是安全有效的[12]。此外,另一項涉及11例晚期圓錐角膜病患者的臨床研究表明,無論是否使用脫細胞供體角膜基質植片,ADSC移植后都能產生良好的療效。術后3 mo內,所有患者都完全恢復了角膜透明度[13]。但是要驗證這種治療方法的有效性,還需要更多的參與者和更長時間的隨訪。牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSC)與角膜基質細胞具有相同的神經嵴譜系起源,并且與角膜基質細胞具有相似的蛋白多糖分泌特征,將人類DPSC移植到小鼠角膜內,可導致Ⅰ型膠原蛋白和角膜蛋白聚糖的表達,并表現出與角膜基質細胞相似的表型,同時保持角膜透明度和基質體積[14]。盡管上述MSC都在治療角膜基質疾病中展示出良好的前景,但是,最近的一些研究表明MSC不僅直接與癌細胞相互作用,促進腫瘤生長和轉移,還能調控腫瘤微環境的形成,因此應謹慎在臨床治療中使用MSC[15]。

然而,受損組織中MSC的治療效果并不總是與MSC的直接分化相關,因為多種機制可能同時促成這種治療作用,例如干細胞在組織微環境中的旁分泌作用[16]。MSC可以通過產生包括生長分化因子、外泌體和微囊泡在內的可溶性因子來發揮治療作用,這些因子有助于調節組織愈合、炎癥反應、血管生成和免疫反應[17]。Jiang等[18]用MSC條件培養基處理原代培養的兔角膜細胞來檢測MSC的旁分泌因子對角膜基質細胞功能的影響。結果表明在培養基中檢測到多種促傷口愈合介質,包括血管內皮生長因子、血小板源性生長因子、肝細胞生長因子、轉化生長因子-β1、白細胞介素-8、白細胞介素-6和單核細胞趨化蛋白-1。這表明MSC通過旁分泌作用以改善細胞活力、遷移和細胞外基質形成,促進角膜基質再生。最近,Mittal等[19]報道了MSC可以通過分泌肝細胞生長因子調節角膜同種異體免疫并促進移植物存活。由此可見,間充質干細胞的旁分泌在受損角膜基質的修復與再生中同樣起著關鍵作用。

1.2角膜基質干細胞角膜基質干細胞(corneal stromal stem cells,CSSC)是位于角膜緣干細胞(limbal stem cells,LSC)基底層下特定干細胞小凹。LSC和CSSC都起源于神經嵴來源的MSC,但二者在角膜中具有不同的特性和功能。LSC在角膜上皮再生中起著重要的作用,而CSSC則用于角膜基質的再生[20]。CSSC可以表達Pax6和MSC標記物(CD90、CD73),具有修復和再生透明基質組織以及降低角膜炎癥反應和減少瘢痕生成的能力[10]。相較于其他類型的干細胞,CSSC表現出更強的分化為基質細胞的潛力,并在體外具有更高的抗炎特性[21]。Jhanji等[22]證明基質內注射外源性CSSC能夠減輕角膜混濁,并且在基質內注射基質細胞沉積的膠原蛋白和硫酸角質素蛋白多糖可以協助天然細胞外基質重塑。Ghoubay等[23]建立了液氮誘導的角膜基質瘢痕小鼠模型。將小鼠或人類角膜基質干細胞直接注射到損傷的角膜可改善角膜基質的超微結構,角膜混濁度降低、炎癥反應減弱,進一步證實了CSSC具有促進透明基質組織再生和逆轉瘢痕形成過程的能力。

2 組織工程誘導的角膜基質再生

組織工程是再生醫學中一個迅速興起的領域,通過創建替代組織來恢復、維持或改善組織功能,為許多疾病提供解決方案具有巨大潛力。目前,組織工程已被應用于生成不同復雜程度的角膜組織等效物,其中的一些表現出與天然人類角膜的高水平仿生性,為治療角膜疾病提供了新的替代方案。

2.13D生物打印技術3D生物打印是一種制作生物級角膜的新興方法,它能夠制造出具有與天然角膜相似光學特性的半透明角膜基質組織,同時保持植入基質組織中細胞的表型[24]。目前,主要應用于生物和醫學的3D打印技術包括:基于VAT聚合、材料擠出和材料噴射的打印技術。生物打印能否成功取決于生物墨水的可印刷性和生物活性,目前,無細胞水凝膠或載細胞生物材料的生物墨水已經被應用在眼科領域[25]。Isaacson等[26]利用氣動擠出式生物打印機,以海藻酸鈉和由甲基丙烯酸鹽化的膠原蛋白為生物墨水,通過掃描患者眼部定制角膜的形狀,成功打印出人類眼角膜。在打印成型之后第1 d角膜基質細胞保持了92%的活性,7 d后仍舊有83%的高細胞活性。Duarte Campos等[27]以按需滴墨的方式利用膠原水凝膠制造出與天然角膜基質組織相似的角膜基質等效物,并在體外培養7 d后保持其天然角膜細胞表型。甲基丙烯酸酯化明膠(methacrylate gelatin,GelMA)具有可調的理化性質及良好的生物相容性,尤其與天然細胞外基質的性質高度相似,是3D打印中使用最廣泛的墨水之一。Mahdavi等[28]利用立體光刻3D生物打印,將GelMA和角膜基質細胞混合用作生物墨水,打印出與人角膜基質透明度和含水量相似的穹頂狀結構。Ⅰ型膠原蛋白、硫酸角質素、人基膜聚醣表達的上調表明了支架內細胞的附著、生長和整合。最近,He等[29]提出了用于角膜再生的仿生上皮/基質雙層植入物的3D生物打印技術。將GelMA和長鏈聚乙二醇二丙烯酸酯[poly (ethylene glycol) diacrylate,PEGDA]混合制成生物墨水以提高GelMA的機械性能。利用數字光處理技術打印的植入物由帶有兔角膜上皮細胞的上皮層和裝載兔脂肪來源間充質干細胞的纖維基質層組成。將這種載有雙層細胞的角膜支架應用于兔角膜移植模型,結果顯示其可以有效地通過再上皮化和基質再生促進角膜再生,為角膜的多層再生提供了新的途徑。盡管3D生物打印技術在醫學領域的方面已經取得了巨大成就,但在制造眼部組織和保存相關生物學功能方面的應用仍有待進一步研究,未來的發展必須要優化技術和組件,以匹配人類角膜基質的復雜性。

2.2原位成型水凝膠水凝膠具有透明度好、含水量高、滲透性強等優點,特別是由膠原及其衍生物制成的水凝膠,具有良好的生物相容性和生物活性。目前,預成型水凝膠和原位成型水凝膠已被廣泛應用于角膜再生。預成型水凝膠因需要精確的尺寸和機械強度來承受手術縫合,并且術后并發癥多(傷口滲漏、微生物殘留、高度散光、角膜新生血管和移植物排斥反應等),正逐漸被原位成型水凝膠替代[30]。原位成型水凝膠具有膠前流動性和組織黏附性的特點,可以滲透到角膜缺損處后再凝膠化,以促進角膜再上皮化和基質再生。Shen等[31]通過非競爭性雙交聯過程開發了一種由豬脫細胞角膜基質和甲基丙烯酸化透明質酸組成的復合水凝膠。該復合水凝膠不僅保留了豬脫細胞角膜基質的生物活性成分,而且具有與人角膜相似的透明度和力學性能。在兔角膜基質缺損模型中,經復合水凝膠處理的實驗眼保持透明,并與基質緊密黏連,加速了角膜上皮化和基質再生。Li等[32]基于GelMA、F127DA、AF127和Ⅰ型膠原蛋白制備了一種光固化水凝膠。使用紫外線照射5 min后即可形成透明、高韌性和高生物黏附性能的水凝膠貼片,該貼片可在兔模型中再生深部角膜基質缺損,并在4 wk內整合到角膜組織中。具有生物活性的多交聯水凝膠可以在無需縫合的情況下快速修復角膜缺損和實現組織的再生,未來需要進一步的研究來評估長期的傷口愈合特征,包括長期的生物反應和光學清晰度,以驗證其長期有效性和安全性。

2.3絲素蛋白絲素蛋白因具有良好的生物相容性、生物可吸收性、柔韌性和抗拉伸性等特點,被看作是一種優良的制作角膜支架的生物聚合物[33]。與不加入絲素蛋白相比,加入絲素蛋白組成的聚ε-己內酯-絲素蛋白復合支架具有更高的透明度、親水性、細胞相容性和體外降解率[34]。利用絲素蛋白、京尼平交聯的多孔聚乙烯醇和納米羥基磷灰石制備成的復合水凝膠表現出良好的物理和生物特性。復合水凝膠在改善了水凝膠網絡結構完整性的同時,還保持了人角膜成纖維細胞的活性[35]。Sahi等[36]使用絲素蛋白和明膠制備出絲素蛋白-明膠復合支架。該復合支架具有良好的透明度、細胞生物相容性以及與天然角膜相當的機械穩定性,并且支持小鼠和兔角膜成纖維細胞的增殖。利用靜電紡絲蛋白可將支架透明度提高到接近天然人類角膜的水平,加入明膠可以進一步改善細胞材料的相互作用。Bhattacharjee等[37]利用不同比例的絲素蛋白和聚丙烯酰胺制備出半互穿網絡水凝膠,可在37 ℃下快速凝膠化,高孔隙率促進角膜細胞在愈合過程中遷移,改善細胞黏附且沒有細胞毒性。絲素蛋白的加入增強了半互穿網絡水凝膠中的細胞增殖,并增加了角膜細胞基因的表達。

3 基因治療誘導的角膜基質再生

基因治療是治療角膜疾病的一種有前途的方法?；蛑委熜枰獙⑤d體和基因傳遞到角膜的目標組織細胞中,替代或編輯有缺陷的基因,以預防或治療角膜疾病。將足量的治療基因引入相對應的細胞是基因治療的關鍵。目前,部分病毒和非病毒載體被應用于角膜瘢痕化和新生血管的基因治療。

3.1病毒載體的基因治療目前角膜基因治療中常見的病毒載體包括腺病毒(adenovirus,AV)、腺相關病毒(adeno-associated virus,AAV)、逆轉錄病毒(retrovirus,RV)、慢病毒(lentivirus,LV)、單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)。而針對角膜基因治療載體的研究主要集中在AAV載體上[38]。AAV載體可以感染角膜的三種主要細胞,不同的血清型具有獨特的細胞趨向性和傳導效率。使用酪氨酸突變的AAV載體,如AAV2、AAV8和AAV9,可進一步提高其傳導和表達效率。AAV載體的優點包括可以轉導不同類型的組織細胞,不受靶細胞是否為分裂細胞所限,基因表達的時間長,可進行指定部位的特異性整合,但其缺點是運載的基因尺寸較小,高滴度生產所需要的技術較困難,人體對病毒的獲得性和先天免疫反應會影響基因的表達和治療效果[39]。核心蛋白聚糖(decorin,Dcn)分別通過拮抗轉化生長因子-β和血管內皮生長因子-A發揮抗纖維化和抗血管生成分子的作用。Mohan等[40]使用局部AAV5-Dcn基因療法顯著緩解了模型兔眼的角膜基質纖維化和新生血管形成,并且在為期6 mo的治療中證實了其安全性。分化抑制因子3(inhibitor of differentiation 3,ID3)基因是一種轉錄抑制因子,可在體外有效抑制角膜基質細胞向肌成纖維細胞的分化。Gupta等[41]使用AAV5載體介導ID3基因來治療模型兔的角膜瘢痕。局部AAV5-ID3基因治療顯著抑制兔角膜基質纖維化,降低了促纖維化基因mRNA的表達水平,包括α-平滑肌激動蛋白、纖連蛋白、膠原蛋白Ⅰ和膠原蛋白Ⅲ,并且局部AAV5-ID3遞送不會在兔眼中引起臨床相關的眼部癥狀或角膜細胞毒性。

3.2非病毒載體的基因治療納米顆粒(nanoparticle,NP)是指直徑在10-100 nm的微型顆粒,具有顆粒尺寸小、比表面積大、表面能高、表面原子所占比例大等特點,可通過吞噬作用、胞飲作用、網格蛋白或細胞膜穴樣凹陷依賴或非依賴途徑等將大量的配體輸送到細胞中[42]。目前已有多種納米顆粒作為載體用于角膜藥物的輸送,如脂質體、樹狀大分子、聚合物納米粒、非離子表面活性劑囊泡、納米混懸劑和水凝膠[43]。Gupta等[44]使用聚乙烯亞胺偶聯黃金納米顆粒,在體外人角膜和體內兔角膜中低毒性遞送骨形態發生蛋白-7+肝細胞生長因子基因能夠治療角膜基質纖維化,并在長達7 mo的治療期間,沒有產生眼部毒性。

其他非病毒基因載體治療還包括:基因槍,電穿孔,離子電滲療法,超聲波,顯微注射等。盡管這些物理方法可以遞送更大尺寸的治療基因并具有低免疫原性,但非特異性轉基因傳遞的隨機性和低轉染率限制了其更廣泛的應用[39]。

4 總結與展望

目前已經開發了眾多角膜基質修復及再生的新方法。傳統的角膜移植依然被視為治療嚴重角膜疾病的有效方法,但始終受到角膜組織供體短缺和移植后免疫排斥反應的限制。因此,需要新的方法來突破這些限制。細胞移植、干細胞治療、人工角膜、生物工程支架、3D生物打印等技術正在迅速發展。各種類型的角膜和非角膜干細胞可以分化為具有角膜基質細胞特性的細胞,并分泌促進角膜基質細胞再生的因子。雖然許多研究證實了干細胞在再生角膜表面方面的有效性,但干細胞系存在先天變異,且在治療角膜廣泛損傷方面不足,促使研究人員使用支架作為支撐結構。天然或合成的生物材料與各種類型的干細胞相結合,可以再生受損的角膜。選擇合適的干細胞是角膜組織工程中的關鍵因素。支架的存在可以加強再生過程。但是,很難模擬角膜高度復雜的超微結構,既不能匹配正常角膜的力學性能,也不能重建局部的納米結構組織,從而重建正常角膜的透明度和光學特性。因此,目前還沒有一個替代品能夠完全復制這種復雜性。部分干細胞治療的方法工序復雜、價格昂貴且涉及倫理問題,不能被廣泛應用于臨床治療。并且,在將這些細胞用于角膜修復之前,應對其長期安全性進行評估,以確保不會出現排斥、感染和炎癥等不良反應。目前與臨床最相關的方法是使用脫細胞的角膜基質,但仍然受限于供體角膜?；虔煼m然還在早期發展階段,但已經可以成功地預防、治療和治愈角膜盲,具有很高的人類應用潛力。新興的3D生物打印技術,如雙光子聚合技術、激光輔助生物打印、熔絲制造成型技術等將推動角膜再生技術的迅速發展。此外,了解患者傷口愈合和移植物排斥反應的免疫細胞生物學可能對設計新的治療策略至關重要。揭示這些方法的機制將產生新的和有效的角膜再生治療方法,最終應用于人類臨床治療角膜疾病。