一株適用于短程反硝化的細菌篩選及其脫氮特性

張建美，朱永茂，謝健強，呂鈺楠，梅江雪，蔣興超

（1.長江大學資源與環境學院，湖北武漢 430100；2.長江大學油氣地球化學與環境湖北省重點實驗室，湖北武漢 430100）

近些年來，隨著人們對污水處理認知的不斷深入以及污水脫氮研究的進一步發展，一些新型脫氮方法不斷出現，厭氧氨氧化（ANAMMOX）是指厭氧氨氧化菌在厭氧條件下，以NH4+-N為電子供體，以NO2--N為電子受體生成N2的過程，該反應具有能耗低、脫氮效果好、剩余污泥少等優點，成為污水處理行業的研究熱點〔1-2〕。一般污水中NO2--N濃度較低，難以維持ANAMMOX的持續進行，如何獲得穩定的NO2--N積累是該工藝能否被廣泛應用的關鍵。短 程 硝 化（Partial nitrification，PN）常 被 用 做ANAMMOX的前置工藝〔3-4〕，但該工藝對環境條件要求嚴苛，長期運行過程中難以保證NO2--N的穩定積累，使ANAMMOX工藝面臨崩潰風險〔5〕。短程反硝化（Partial denitrification，PD）是指將NO3--N僅還原到NO2--N階段，未進一步還原為N2的過程，因其具有更加穩定的NO2--N積累廣受關注〔6-9〕。

J.S.ALMEIDA等〔10〕認為PD的發生與硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase，Nar）和亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，Nir）對碳源所提供電子的競爭有關，若Nar在競爭中占據優勢，則反硝化過程中能實現高的NO2--N積累。前期研究表明，碳源類型、C/N、pH、溫度等環境因素都會對Nar和Nir的活性產生影響，從而引起不同程度的NO2--N積累〔11-14〕。除環境條件的影響外，反硝化細菌的群落結構對于NO2--N的積累也至關重要，自然界中反硝化細菌種類繁多，一類反硝化細菌僅能進行PD，以NO2--N為最終產物，另一類反硝化細菌可以同時還原NO3--N和NO2--N，無NO2--N積累，還有一類反硝化細菌盡管可以同時還原NO3--N和NO2--N，但NO2--N的還原速率較慢，仍可實現NO2--N的積累〔15-16〕。如果能富集和篩選出易于進行PD的細菌，則可為短程反硝化-厭氧氨氧化（Partial denitrification ANAMMOX，PD/A）耦合工藝的實際應用提供重要支撐。

本研究采集活性污泥以及水稻田土壤樣品，篩選易于進行PD的細菌，并對影響菌株NO2--N積累的環境因子進行了探析，以期為PD/A耦合新型脫氮工藝提供潛在菌株。

1 材料及方法

1.1 樣品采集

取蔡甸污水處理廠二沉池活性污泥樣品，其懸浮固體（SS）質量濃度為2 870 mg/L，另外取長江大學周邊水稻田表層下5 cm土壤，帶回實驗室進行菌株的富集和分離。

1.2 培養基

富集培養基：KNO31.0 g，葡萄糖5.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，調節pH在7.0～8.0。

分離 培 養 基：KNO31.0 g，葡 萄 糖5 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，定 容至1 000 mL，調 節pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的瓊脂。

純化 培養基：牛肉膏0.5 g，蛋白 胨1.0 g，NaCl 0.5 g，定 容 至1 000 mL，調 節pH在7.0～8.0，加 入1.5%～2.0%的瓊脂。

反硝 化 培 養 基：KNO31.0 g，KH2PO43.75 g，Na2HPO40.98 g，MgSO4·7H2O 30 mg，檸檬酸鈉4.6 g，定容至1 000 mL，調節pH在7.0～8.0。

微量元素：EDTA 50 g，CuSO4·5H2O 1.5 g，CaCl25.5 g，CoCl2.6H2O 1.61 g，FeSO4.7H2O 5 g，ZnSO42.2 g，定容至1 000 mL。

1.3 菌株篩選

1.3.1 菌株分離純化

稱量10 g水稻田土壤，加入100 mL無菌水，磁力攪拌器震蕩10 min，取5 mL土壤懸浮液和5 mL活性污泥樣品分別接種到100 mL富集培養基中，于30 ℃下厭氧搖床培養3 d，重復富集3次。之后將菌液濃度分別稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7這5個量級，均勻涂至分離培養基平板上，30 ℃下于厭氧培養罐中倒置培養。待平板長出菌落后，挑選形態大小各異的菌落用劃線培養法進行分離、純化至無雜菌生長，菌株保藏備用。

1.3.2 菌株篩選

經過富集分離純化后，得到形態不同的單菌落，挑選這些單菌落在試管內進行液體厭氧培養，72 h后，測定試管內NO3--N以及NO2--N濃度，從而獲得反硝化效率高的4株菌株H6、H7、D5、D9。之后對該4株菌株進行NO3--N還原性能測試，選擇檸檬酸鈉為碳源，C/N控制在8，30 ℃下厭氧培養，定期取樣測試OD600、NO3--N和NO2--N濃度，篩選出PD效果好的菌株。

1.3.3 菌株的鑒定

選擇PD性能優良的菌株D5，從形態學以及16S rDNA序列方面對菌株進行鑒定。

1）菌株形態。用平板劃線法和掃描電鏡（SEM）觀察所選菌株D5的形態結構。將菌株接種于反硝化培養基中培養，取2 mL菌液離心，倒掉上清液，加入預冷的2.5%戊二醛溶液固定24 h后用掃描電鏡觀察菌株細胞形態。

2）菌株的PCR擴增。用細菌DNA提取盒提取菌株D5的DNA，然后以基因組DNA為模板，利用細菌 通 用 引 物27F（5'-TTC CGG TTG ATC CTG CCG GA-3'）和1492R（5'-GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3'） 進行PCR擴增，之后由中國典型培養物保藏中心測序，測序結果在NCBI數據庫通過Blast軟件進行同源性比較并用Mega構建系統發育樹。

1.4 不同環境因子對菌株D5脫氮的影響

1.4.1 碳源

選取酒石酸鉀鈉、乙酸鈉和檸檬酸鈉為碳源，配制NO3--N質量濃度為120.01 mg/L，C/N為8的反硝化培養液，分別取300 mL加入到500 mL厭氧瓶內，120 ℃滅菌15 min，冷卻后接種5 mL D5菌液，通高純氮氣20 min除氧，密封，于30 ℃下進行搖床實驗。定期取水樣檢測分析NO3--N和NO2--N，研究碳源對菌株D5脫氮的影響。

1.4.2 C/N

選擇檸檬酸鈉為碳源，配制C/N分別為0.8、1、2、3、5的培養液，按1.4.1實驗步驟于30 ℃下厭氧培養，定期取水樣分析NO3--N和NO2--N，研究C/N對菌株D5脫氮的影響。

1.4.3 溫度

設置3個溫度分別為15、25、30 ℃，控制C/N為5，按1.4.1實驗步驟接種D5于反硝化培養液中，厭氧環境下進行實驗，定期取水樣分析NO3--N和NO2--N，研究溫度對菌株D5脫氮性能的影響。

1.5 分析方法

pH采用pH計測定（上海雷磁公司pHS-3E型）；DO采用110溶解氧儀測定（上海雷磁公司JPSJ-605F型）；OD600采用分光光度計測定（島津公司UV-1100型）；NO3--N采用紫外分光光度法；NO2--N采用分光光度法。水樣分析前均用0.45 μm膜進行過濾處理。

2 結果與討論

2.1 菌株的篩選

經過富集分離純化后，得到24株形態不同的單菌落，挑選這些單菌落在試管內進行厭氧反硝化實驗，根據NO3--N還原能力和自身生長繁殖速度，選取H6、H7、D5、D9共4株菌株，并進一步評價了這4株菌株的反硝化性能以及NO2--N積累能力，結果見圖1。

圖1 不同菌株的反硝化脫氮過程Fig.1 Nitrogen removal of different strains

由圖1（a）可見，H7、D5、D9菌株的NO3--N去除規律類似，實驗開始后NO3--N的去除效果明顯，在24 h內NO3--N質量濃度迅速降低到8.69、14.92、23.29 mg/L，去除率達到94.5%、90.5%、85.2%，在6～24 h內菌株OD600也顯著增加至0.825、0.765、0.743〔圖1（c）〕，實驗結束時，NO3--N去除率均大于90%。H6對硝酸鹽的去除呈現出不同的趨勢，實驗初始階段NO3--N濃度降低較慢，實驗進行60 h后，硝酸鹽去除率僅為40.8%，之后迅速降低，到實驗結束時，去除率為88.4%。由OD600也可以看出H6生長較為緩慢，36 h時僅為0.302，之后進入快速生長期。該結果表明，在該實驗條件下菌株H6的適應期較長，但隨著實驗的進行，仍然具有較高的NO3--N去除率。

整個實驗過程中，各菌株均有不同程度的NO2--N積累〔圖1（b）〕，H7、D5、D9積累NO2--N的規律一致，實驗開始后，系統內的NO2--N濃度迅速升高，24 h時達到最大值，依次為91.70、95.70、94.70 mg/L，之后下降，從36 h開始直到實驗結束，質量濃度分別維持在（44.00±2.40）、（42.94±5.16）、（42.79±3.82） mg/L之間。由以上數據可以判斷，菌株H7、D5、D9在還原NO3--N的過程中，易于發生PD，從而引起顯著的NO2--N積累。H6則呈現出不同的現象，在整個實驗過程中NO2--N的積累量輕微，36 h時質量濃度僅為3.94 mg/L，遠低于H7、D5、D9的積累量，72 h時已無NO2--N檢出，這充分表明菌株H6進行的是完全反硝化作用，NO2--N難以積累。

實驗過程中NO3--N的還原條件一致，細菌種類的不同是引起NO2--N積累程度差異的主要原因，菌株H7、D5、D9在還原硝酸鹽過程中，PD作用明顯，NO2--N積累量大，而H6在整個實驗過程中反硝化作用徹底，NO2--N積累輕微。Rui DU等〔17〕研究發現Thauera屬的反硝化細菌含有的Nir反硝化基因豐度要遠低于Nar，判斷Thauera屬進行的反硝化作用為階段性反硝化反應。據此推測H7、D5、D9菌株中含有Nir反硝化基因，但其活性低于Nar，致使NO3--N被還原為NO2--N后，不能及時進行下一步的轉化，從而引起NO2--N的積累，相反H6中含有的Nar豐度高于Nir，在反硝化過程中產生的NO2--N能被及時還原。

由上面的分析可知，D5菌株PD效果顯著，NO3--N去除率高，NO2--N積累明顯，選為后續研究的菌株。

2.2 菌株的鑒定

菌株D5的形態特征為菌落較大、圓形、淺黃色、表面光滑、濕潤、易挑取。經鑒定該菌株為桿狀細菌。

將菌株D5的16S rDNA進行Blast分析，發現菌株D5與Klebsiella quasipneumoniae、Klebsiella pneumoniae的相似度均達到99%以上。另外由系統發育樹（圖2）可見，菌株D5跟Klebsiella pneumoniae的親緣關系最近，結合菌株的形態學特性，鑒定分離的菌株D5為克雷伯氏菌屬（Klebsiellasp.）、肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）。該菌株在人體腸道、動物血液和內臟等分離的比較多，以往的研究主要針對人體健康及耐藥性等方面〔18〕。在污水處理系統中，常見的反硝化細菌包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、陶厄氏菌屬（Thauera）和不動桿菌屬（Acinetobacter）等〔19〕。本研究篩選的D5來自水稻田土壤，不屬于污水處理中的常見反硝化細菌，但是先前也有一些研究篩選出了Klebsiellasp.反硝化細菌〔20〕，例如劉詠等〔21〕從巢湖蘆葦濕地分離篩選出一株異養反硝化細菌，命名為Klebsiellasp.DB-1，能夠有效地去除水中NO3--N，中間有NO2--N積累，但是72 h后NO2--N快速被分解掉。封勇等〔22〕篩選出的肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）具有降解銨鹽、硝酸鹽和亞硝酸鹽的作用，24 h 內的降解率分別為 96%、100%、100%，中間過程有NO2--N積累，但是在18 h被完全降解掉。而本實驗篩選出的菌株PD作用明顯，盡管實驗后期NO2--N的積累量有所降低，但直到實驗結束，仍保持一個較高的濃度水平。與以往資料中篩選出的Klebsiellasp.相比，菌株D5更易積累NO2--N，這可能與菌株的Nar與Nir活性 相 關，劉 詠 等〔21〕認 為 菌 株Klebsiellasp.DB-1的Nar合成與Nir合成并不協調，72 h后Nir大量合成，將積累的亞硝酸鹽快速還原，據此推測本實驗過程中，菌株D5并未大量合成Nir，Nir活性低，NO2--N積累較為穩定。

圖2 基于16S r DNA分析的菌株D5的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain D5 based on 16S r DNA analysis

2.3 環境因子對菌株D5性能的影響

PD的實現跟反硝化細菌內的Nar與Nir對供應電子的競爭有關，通過環境條件的調控可針對性干預Nar與Nir的競爭，提升Nar的活性，同時抑制Nir的活性，便可取得好的PD效果，使NO2--N穩定積累。

2.3.1 碳源

大部分反硝化細菌都需要依靠外界碳源作為電子供體還原NO3--N，不同類型污水中的有機物種類不同，反硝化菌對其利用能力存在差異，進而影響NO2--N的積累〔23-24〕。碳源對菌株D5反硝化性能的影響見圖3。

圖3 碳源對菌株D5反硝化性能的影響Fig.3 Effect of the carbon source on the denitrification performance of strain D5

由圖3（a）可知，以酒石酸鉀鈉為碳源時，菌株D5還原NO3--N的效果差，去除率僅有12.7%，實驗過程中無NO2--N積累〔（圖3（b）〕，該結果說明D5不能有效地利用酒石酸鉀鈉，短程反硝化難以進行，無NO2--N積累。但是朱紅旭等〔25〕以酒石酸鉀鈉為碳源時，篩選出的反硝化菌株在72 h時NO3--N去除率超過60%，并有一定的NO2--N積累。以往的一些資料也發現不同的反硝化細菌對碳源的利用能力存在差異〔26-27〕，因此針對不同的細菌選擇合適的碳源是取得好的PD效果的關鍵。

當以乙酸鈉跟檸檬酸鈉為碳源時，菌株D5均表現出強的NO3--N還原能力，但仍存在一定差異〔圖3（a）〕。以乙酸鈉為碳源時，24 h內NO3--N去除率較低，僅有23.8%，之后快速升高，36 h的去除率為81.1%，實驗結束時，去除率達到97.9%。實驗過程中PD現象明顯，但是在12 h內無NO2--N積累，結合前面的NO3--N去除率，可以判斷在該實驗階段D5處于適應期，NO3--N還原速率慢，無NO2--N積累。12 h之后NO2--N質量濃度逐漸升高，達到（18.29±1.61） mg/L。由以上分析可知，乙酸鈉為碳源時，菌株D5可以進行PD反應，但是啟動時間較長。以檸檬酸鈉為碳源時，菌株D5的活性更高，24 h內NO3--N的去除率便達到90%，實驗結束時去除率為94.4%，實驗過程中NO2--N積累達到（18.84±2.89）mg/L，PD效果明顯，啟動時間短。以往很多研究曾一度將乙酸鹽視為PD的最佳電子供體，Lingxiao GONG等〔12〕曾以乙酸鹽作為碳源在C/N為2.5時實現了高的PD效果，Rui DU等〔28〕也以乙酸鹽驅動PD實現了NAR達到90%的效果，而本實驗中檸檬酸鈉能更快速地啟動PD，是菌株D5的最佳碳源，與以往的研究存在差異，這可能是由于反硝化系統中細菌的種類不同所致，以前也有資料發現不同的PD菌群對同一類型的碳源利用能力不同〔15，29〕，可以判斷，菌株D5能更有效地利用檸檬酸鈉。朱云等〔30〕同樣發現乙酸鈉、檸檬酸鈉是好氧反硝化細菌Pseudomonas furukawaii的最佳碳源。

由上面的分析可知，檸檬酸鈉和乙酸鈉為碳源時，D5去除NO3--N效果好，NO2--N積累明顯，而檸檬酸鈉能更快速地啟動PD，為菌株D5的最佳碳源。

2.3.2 C/N

C/N通常被認為是實現PD的重要因素，C/N越低，Nir受到抑制，NO3--N還原速率大于NO2--N還原速率，易造成NO2--N積累〔11，15〕，但過低的C/N會抑制反硝化細菌的活性，因此探究C/N對PD的影響對于取得穩定的NO2--N積累有著重要的意義。圖4是C/N對菌株D5反硝化性能的影響。

圖4 C/N對菌株D5反硝化性能的影響Fig.4 Effect of C/N on the denitrification performance of strain D5

由圖4（a）可知，在不同的C/N條件下，菌株D5去除NO3--N的效果有較大的差別。當C/N為0.8、1時，實驗過程中NO3--N有一定的去除，實驗結束時NO3--N質量濃度分別為34.96、23.89 mg/L，去除率為59.0%、71.8%，表明體系中有機碳限制了細菌的生長，導致NO3--N去除率較低。當C/N升高為2時，NO3--N去除率明顯增大，實驗結束時NO3--N質量濃度為14.45 mg/L，去除率達到84%。而當C/N為3、5時，反硝化效果進一步提升，到48 h時，去除率便分別達到88.3%、90.5%，實驗結束時，去除率均高于96.0%，明顯高于當C/N為0.8、1、2時的NO3--N去除率，表明隨著C/N越高，D5還原NO3--N的效果越好。以往的一些研究也表明，細菌的脫氮效果會隨著C/N的增大而升高，達到一定值后，脫氮效果維持穩定〔31〕。本研究中C/N為3、5時，最終的NO3--N去除率接近，劉泳等〔21〕也發現當C/N大于3以后，碳源已不再是反硝化體系的限制性因素，NO3--N的去除率基本不變。而Jinming DUAN等〔32〕卻發現，菌株Vibrio diabolicusSF16在C/N為10時脫氮效果最高，造成這種差異的原因可能跟碳源類型、微生物種類等因素有關。

整個實驗過程中一直有明顯的NO2--N積累，對比圖4（a）、圖4（b）發現，NO2--N的積累規律不同于NO3--N的去除規律，C/N為1、2、3時，36 h后質量濃度便分別達到（61.87±2.43）、（61.76±1.67）、（57.47±2.90） mg/L，積累率超過60%，而當C/N為0.8、實驗中仍存在顯著的NO2--N積累，但是積累量要低于C/N為1、2、3時，結合前面的硝酸鹽去除率，推測C/N為0.8時，體系內碳源不足，Nar和Nir均被抑制，因此積累的NO2--N濃度略低。而當C/N為5時，充足碳源能夠保證Nir的活性，產生的NO2--N被還原，積累量最低，但是仍有一定的積累，可以推斷菌株D5的Nir活性要低于Nar活性，致使NO3--N還原速率大于NO2--N還原速率，易于積累NO2--N。

由上面的分析可知，合適的C/N是取得最佳PD效果的關鍵，結合硝酸鹽去除率以及NO2--N的積累，本研究中的最佳C/N為3。以往的研究也表明，在一定范圍內增加C/N有助于NO2--N的積累，但C/N過高反而不利，T.V.KRISHNA MOHAN等〔33〕研究了乙酸鈉作為碳源時C/N對高濃度硝酸鹽廢水反硝化的影響，發現當C/N為1.5～3.0，完全脫氮時間和最大NO2--N積累量隨C/N比的增大而增大。柳全龍等〔11〕發現在PD過程中，C/N對亞硝酸鹽積累有明顯的影響，當C/N在2.0～2.5時，NO2--N積累率隨C/N的升高而升高，在C/N=2.5時，達到最高值82.18%，而C/N在3.3～5.0時NO2--N積累明顯下降，與本實驗的結果類似。不同研究中的最佳C/N存在差異，這可能跟細菌類型、碳源種類以及其他環境條件有關。

2.3.3 溫度

溫度可以通過影響細菌的生長和新陳代謝而影響細菌的反硝化性能，進而影響NO2--N的積累〔13〕。溫度對菌株D5反硝化性能的影響見圖5。

圖5 溫度對菌株D5反硝化性能的影響Fig.5 Effect of the temperature on the denitrification performance of strain D5

由圖5可知，當溫度為15 ℃時，NO3--N去除率低于10%，且無NO2--N檢出，這說明15 ℃時，D5活性低下，難以還原NO3--N，無NO2--N積累。當溫度上升到25 ℃和30 ℃時，NO3--N去除率明顯提高，去除率均達到95%以上，實驗過程中積累的NO2--N從24 h開始迅速增長，實驗結束時分別達到88.14、76.7 mg/L，積累率分別高達84%、73%，獲得了好的PD效果。先前的研究亦表明反硝化細菌的最適溫度為20～35 ℃〔34〕。

結合前面的分析可以推斷，菌株D5是一類可以同時還原NO3--N和NO2--N的反硝化細菌，Nar在跟Nir競爭中占據主導地位，NO3--N的還原速率要高于NO2--N的還原速率，引起NO2--N的積累，通過調控環境條件可以取得最佳的PD效果。

3 結論

1）從水稻田土壤中篩選出一株具有高效PD性能的菌株D5，根據形態學觀察為桿狀菌，結合16S rDNR測序及系統發育樹比對鑒定為肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）。

2）乙酸鈉和檸檬酸鈉均可作為菌株D5的碳源使用。以乙酸鈉為碳源時，NO2--N顯著積累，但PD啟動較慢，檸檬酸鈉能快速啟動PD反應，24 h內NO3--N的去除率便達到90%，實驗過程中NO2--N達到（18.84±2.89） mg/L，是菌株D5啟動短程反硝化的最佳碳源。

3）C/N對菌株D5的PD效果影響明顯，最佳C/N為3，此時NO3--N的去除率高于96%，亞硝酸鹽的積累量達到（57.47±2.90） mg/L，積累率超過60%。

4）溫度對菌株D5的PD效果影響明顯，當溫度為25 ℃和30 ℃時，NO3--N去除率均達到95%以上，NO2--N積累率達到84%和73%，PD效果顯著。

上述成果不但為PD/A新型脫氮工藝提供了適合的菌株，同時為確定最佳PD條件提供了重要理論支撐，在污水脫氮處理中具有廣闊的應用前景。