木犀草素對D-半乳糖所致小鼠認知障礙的改善作用*

李斯盛，蘭睿，譚淇，賈欣怡，熊煒，羅玥佶，曾杰

（長沙醫學院，湖南 長沙 410219 ）

隨著人口老齡化加劇，阿爾茨海默病的患病率逐漸增高，給老年人及其家庭帶來精神痛苦和經濟負擔［1-2］，抗衰老，防癡呆，已成為醫學界乃至整個社會的研究熱點。衰老導致腦結構與功能的改變，表現為學習記憶能力的減退［1-3］，嚴重者甚至導致癡呆。衰老導致的認知障礙發病機制尚不清楚，研究表明神經炎癥在其發病及進展中起重要作用。目前，西藥治療認知障礙存在許多問題，迫切需要尋找新的藥物。木犀草素是一種天然的黃酮類化合物，具有抗感染、抗氧化等多種藥理學特性，廣泛應用于修復氧化應激損傷，抑制神經元凋亡等臨床應用中［4-6］。本研究擬通過Morris 水迷宮實驗、酶聯免疫吸附測定（ELISA）等實驗，觀察木犀草素對D-半乳糖致衰老模型小鼠學習記憶能力的影響，為木犀草素用于臨床改善學習記憶提供基礎。

1 材料與方法

1.1 動物分組及D-半乳糖皮下注射法建立衰老小鼠模型

購買的小鼠通過Morris 水迷宮的初次篩選，將篩選合格的30 只小鼠［湖南斯萊克景達動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2019-0004］適應性喂養3 d，分為3 組，每組10 只。分別是正常組、模型組、木犀草素（60 mg/kg）組。除正常組外，其它各組均頸后部皮下注射D-半乳糖（120 mg/kg）；同時灌胃給藥，正常組、模型組給予生理鹽水、木犀草素組每天按120 mg/kg 給藥。實驗結束前8 d 進行水迷宮行為學實驗。

1.2 測定SOD、MDA 的活力

模型建立成功后，尾靜脈取血，按試劑盒說明書，羥胺法測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）的活力、比色法測定血清中丙二醛（MDA）的活力。

1.3 免疫熒光染色

各組均隨機選取6 只小鼠，腹腔注射（i.p.）給予水合氯醛40 mg/kg 深度麻醉。4%多聚甲醛灌注，取材海馬，組織經脫水，透明，浸蠟制成蠟塊，每組六張切片，按試劑盒添加相應抗體進行反應，應用熒光顯微鏡，在高倍顯微鏡下，觀察NeuN 陽性細胞并拍照。

1.4 水迷宮檢測

實驗前1 d，讓小鼠在水迷宮中自由游泳以適應環境。隱蔽平臺實驗：將平臺置于第I 象限中央，訓練時將小鼠從同一位置面向池壁放入水中，記錄小鼠游泳的平均速度及逃避潛伏期，此實驗在第1～4 日進行，實驗時，小鼠入水點次序保持一致?？臻g探索實驗：每天的隱蔽和反向實驗結束后撤除平臺，選取第Ⅱ象限為入水點，游泳時間為60 s，記錄小鼠在原平臺處的穿越次數，此實驗在第2～7 日進行。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件統計分析數據。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間多重比較采用Post Hoc Tests 進行。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 木犀草素對衰老小鼠活動度和新事物分辨指數的影響

單因素方差分析顯示，各組小鼠活動度差異無統計學意義（F=1.776,P＞0.05），各組間舔糖時間差異有統計學意義（F=18.25,P＜0.001），見圖1。與正常組［（41.22±10.68）%］比較，模型組［（-4.282±16.34）%］小鼠的新事物辨別指數降低，差異有統計學意義（P＜0.001），木犀草素組［（18.43±21.67）%］小鼠的新事物分辨指數高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 木犀草素對衰老小鼠活動度和新事物分辨指數的影響

2.2 木犀草素對衰老小鼠學習記憶的影響

Morris 水迷宮探索結果如表1 所示。與正常組相比，模型組、木犀草素組小鼠潛伏期明顯增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組相比，木犀草素組小鼠潛伏期均下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組小鼠在目標象限停留的時間比較差異有統計學意義（P＜0.05），與正常組比較，模型組小鼠在原平臺處的穿越次數減少，差異有統計學意義（P＜0.05），木犀草素組停留時間高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

表1 木犀草素對衰老小鼠學習記憶的影響（n=10,,s）

表1 木犀草素對衰老小鼠學習記憶的影響（n=10,,s）

注：1）與正常組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.3 木犀草素對衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響

通過試劑盒檢測各組小鼠海馬組織中SOD、MDA 含量，結果顯示與正常組比較，模型組SOD含量降低，MDA 含量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，木犀草素組SOD 含量升高，MDA 含量降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 木犀草素對衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響（n=10,）

表2 木犀草素對衰老小鼠SOD、MDA 含量的影響（n=10,）

注：1）與正常組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05。

2.4 木犀草素對各組小鼠NeuN 表達的影響

單因素方差分析顯示，各組小鼠海馬CA3 區NeuN 陽性細胞數比較差異有統計學意義（F=15.24，P＜0.001）。模型組小鼠NeuN 陽性細胞數目（170.70±22.34）明顯少于正常組（234.70±35.93），差異有統計學意義（P＜0.05）；木犀草素組小鼠NeuN 陽性細胞數目（240.00±33.75）明顯多于模型組，差異有統計學意義（P＜0.001）。見圖2。

圖2 木犀草素對衰老小鼠NeuN 陽性細胞數目的影響

2.5 木犀草素對小鼠海馬突觸蛋白的影響

WB 檢測條帶及分析如圖3 所示。單因素方差分析表明各組小鼠突觸核蛋白（Syn）的表達差異有統計學意義（F=5.98,P＜0.05），正常組小鼠Syn的表達相對值為（1.084±0.223），模型組小鼠Syn的表達（0.54±0.122）低于正常組，木犀草素組小鼠Syn 的表達（0.65±0.359）高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

圖3 木犀草素對小鼠海馬突觸蛋白的影響免疫印跡分析圖

單因素方差分析表明各組小鼠突觸后密度蛋白-95（PSD-95）的表達差異有統計學意義（F=7.684，P＜0.05），正常組小鼠PSD-95 的表達相對值為（1.003±0.348），模型組小鼠PSD-95 的表達（0.283±0.064）低于正常組，木犀草素組小鼠PSD-95 的表達（0.963±0.268）高于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

阿爾茨海默病病因及機制復雜，病因學說主要有遺傳控制說、自由基損傷說等［7-9］。其中，自由基損傷說是具有代表性的學說［10］。過剩的自由基會引發一系列毒性反應，加速各器官衰老的速度?；谶@種機制的研究，最常用的模型是D-半乳糖導致的衰老動物模型，該模型與自然衰老較為相似［11］。本研究結果顯示，D-半乳糖注射后，小鼠的運動能力并未明顯改變，但是其新舊食物識別指數明顯降低，表明該模型建立成功，D-半乳糖致衰老小鼠認知能力下降。進一步檢測各組小鼠水迷宮實驗，檢測了小鼠找到平臺的潛伏期和目標象限停留時間，發現D-半乳糖注射后延長了小鼠找到平臺的潛伏期，降低了小鼠在目標象限的停留時間，提示D-半乳糖注射損害了小鼠學習記憶和空間探索能力，這與文獻報道一致［12］。

SOD 和MDA 是反映機體氧化還原清除氧自由基能力的主要標志物［13］。本研究結果顯示模型組小鼠SOD 含量降低，MDA 含量升高，提示模型組小鼠清除氧自由基能力下降。進一步檢測表明模型組小鼠海馬成熟神經元數目降低，突觸相關蛋白表達下降，均提示D-半乳糖可能通過減弱氧自由基清除能力，導致神經元死亡，神經突觸可塑性減弱，從而導致小鼠認知障礙。

目前，臨床治療阿爾茨海默病的一線藥物主要是改善膽堿系統功能的藥物和N-甲基-D-天氡氨酸（NMDA）受體拮抗劑。這些藥物對治療中、晚期阿爾茨海默病難見療效，且有胃腸道及心血管方面的不良反應［14］。本研究表明，木犀草素能提高D-半乳糖致衰老模型小鼠新舊食物識別指數，減少定向航行潛伏期，增加探索能力，提示木犀草素能改善小鼠認知能力。進一步檢測結果顯示，木犀草素能增加衰老模型小鼠SOD 含量，降低MDA 含量，保護小鼠海馬成熟神經元，并增加突觸相關蛋白的表達。

綜上所述，木犀草素可能通過增強氧自由基清除能力，保護海馬神經元，增強神經突觸可塑性，從而改善D-半乳糖導致的小鼠認知障礙，具體機制有待進一步深入研究。