穿心蓮內酯介導c-SKI抑制心肌成纖維細胞轉分化和心肌纖維化*

高 敏， 丁歡歡， 鄭麗華， 王 娟

（新疆醫科大學第五附屬醫院心內科，新疆 烏魯木齊 830001）

心血管疾病是我國主要的死亡因素，其致死人數從2005年309萬增加到2020年458萬［1］，嚴重困擾著我國居民身心健康，加重了國家經濟財政壓力。常見的心血管疾病主要包括冠心病、心肌梗死、主動脈狹窄和心力衰竭等。心肌纖維化（myocardial fibrosis， MF）幾乎見于所有類型的心臟?。?］。因此，抑制心肌纖維化的發生發展極為關鍵。

穿心蓮內酯（andrographolide， Andr）為穿心蓮的主要活性成分，具有抗炎、免疫調節等多種生物學活性，對急性腎衰竭、糖尿病腎病和原發性腎病綜合征等多種腎臟疾病具有治療作用［3-4］，對四氯化碳所致肝纖維化和博來霉素所致肺纖維化具有明顯抑制作用［5-6］，在減少心臟纖維化和改善心臟功能方面有著顯著療效［7］，但其功效行使的生物學功能仍不明晰。

轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種多效細胞因子，參與調節多種生物學過程，是心血管疾病的潛在治療靶點［8］。c-SKI （cellular Sloan-Kettering Institute）蛋白是TGF-β1信號傳導的重要核心抑制劑，能夠結合并抑制Smad蛋白活性［9-10］。本課題組前期工作已證實c-SKI和TGF-β1的關系，c-SKI能抑制TGF-β1誘導的人心肌成纖維細胞增殖和細胞外基質（extracellular matrix， ECM）沉 積［11］，過 表 達c-SKI介 導TGF-β1/Smad和p38 MAPK信號通路能夠緩解心房顫動［12］，抑制異丙腎上腺素（isoprenaline， ISO）誘導的小鼠心肌纖維化［13］，抑制人冠狀動脈內皮細胞的內皮-間充質轉化過程［14］。過表達c-SKI可以減輕血管緊張素II誘導的心肌纖維化［15］。因此，本研究擬通過構建心肌纖維化小鼠模型，探究Andr通過c-SKI影響TGF-β1抑制心肌細胞轉分化和心肌纖維化的作用機制，以期為心肌纖維化的治療提供參考。

材料和方法

1 動物

C57雄性小鼠18只，8周齡，（20.0±2.0） g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2019-0004。人心臟成纖維細胞（human cardiac fibroblasts， HCFBs）購自中國科學院細胞庫（上海）。

2 主要試劑

CCK-8試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；mRNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒購于Thermo Fisher；c-SKI、纖連蛋白1（fibronectin 1， FN1）、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型膠原（collagen type I， Col I）和GAPDH抗體，以及兔抗鼠和鼠抗兔Ⅱ抗購于Abcam。

3 主要方法

3.1 小鼠心肌纖維化模型構建 將18只雄性C57小鼠隨機分成3組：control組、模型組（ISO組）和ISO+Andr組，每組6只。ISO組和ISO+Andr組小鼠給予皮下注射5 mg/kg的ISO 1 d后，每天同一時點皮下注射2.5 mg/kg的ISO，持續注射30 d；control組注射生理鹽水［16］。ISO+Andr組Andr灌胃，control組和ISO組均給予等體積生理鹽水灌胃。給藥8周，處死小鼠，取心臟組織進行病理檢測。

3.2 HE染色 將小鼠心臟組織在4%多聚甲醛中固定，經梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、1%氨水返藍、伊紅復染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察心肌組織病理學變化。

3.3 Masson染色 將小鼠心臟組織于4%多聚甲醛固定，經切片、脫蠟入水、透明、浸泡、蘇木素染色、乙酸分化、Masson返藍、麗春紅復染、脫水、封片，鏡檢觀察并拍照，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析并計算膠原容積分數。

3.4 免疫組化 取小鼠心臟組織石蠟切片，經脫蠟、水化、切片，Ⅰ抗4 ℃孵育過夜，相應Ⅱ抗處理15 min，蘇木素復染、脫水、透明、封片，鏡檢觀察并拍照。

3.5 細胞培養及分組 將HCFBs培養于含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素雙抗的DMEM-F12培養液中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養至對數生長期進行后續實驗。以不同濃度（0、10、50和100 μmol/L）的Andr干預HCFBs。接著用50 μmol/L Andr處理10 μg/L TGF-β1誘導的轉分化細胞模型，具體分組為：PBS組、模型組（TGF-β1組）和TGF-β1+Andr組。使用Lipofectamine 3000將sh-NC質粒和sh-c-SKI質粒轉染至TGF-β1誘導的模型組細胞，并聯合Andr處理細胞，具體分組為：PBS組、TGF-β1組、TGF-β1+Andr組、TGF-β1+Andr+sh-NC組和TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組。收集細胞用于進一步分析。

3.6 倒置熒光顯微鏡觀察 將HCFBs接種于6孔板中，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜，藥物干預后，置于倒置顯微鏡下以不同視野、不同倍數明場觀察細胞形態和生長密度，并拍照。

3.7 CCK-8實驗 將HCFBs按實驗分組處理后，接種至96孔板中，培養48 h，棄上清，每孔加入10 μL CCK-8溶液繼續孵育4 h，酶標儀測定波長450 nm處的吸光度。

3.8 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， qPCR） 提取組織和細胞總RNA，計算上樣體積，以逆轉錄得到的cDNA為模板，通過高溫變性、退火和延伸等步驟進行qPCR分析，觀察熔解曲線并用2-ΔΔCt法分析c-SKI的mRNA相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Figure 1.Sequences of the primers

3.9 Western blot 提取組織、細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度后，取適量蛋白樣品進行電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉、4 ℃過夜孵育Ⅰ抗、室溫孵育相應Ⅱ抗2 h、顯影拍照，并使用ImageJ軟件進行灰度分析并計算相對表達量。

4 統計學處理

使用GraphPad Prism 9.0進行統計并繪制圖表。兩組間比較采用t檢驗，多組間采用單因素方差（ANOVA）分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 Andr在小鼠心肌纖維化模型中的干預作用

HE和Masson染色顯示，control組小鼠胞核均一，心肌細胞排列整齊，細胞間緊密連接；ISO組小鼠細胞核固縮變形，心肌組織破壞、有大量藍色膠原纖維沉積，纖維化程度嚴重；與ISO組相比，ISO+Andr組小鼠心肌纖維排列整齊，心肌細胞形態基本正常，細胞膜完整，膠原容積分數顯著減少（P＜0.01），見圖1A、B。免疫組化和qPCR結果顯示，與control組相比，ISO組c-SKI表達顯著下調（P＜0.01）；與ISO組相比，ISO+Andr組c-SKI表達顯著上調（P＜0.05），見圖1C、D。Western blot結果顯示，與control組相比，ISO組c-SKI表達顯著下調（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調（P＜0.01）；與ISO組相比，ISO+Andr組c-SKI表達顯著上調（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著下調（P＜0.01），見圖1E、F。

Figure 1.Effects of andrgrapholide（Andr） on myocardial fibrosis model in mice.A： HE staining（scale bar=50 μm）；B： Masson staining（scale bar=50 μm）；C： the level of c-SKI was detect by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）；D：the level of c-SKI mRNA was detected by qPCR；E： the level of c-SKI was detect by Western blot；F： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I（Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs isoprenaline （ISO） group.圖1 穿心蓮內酯對小鼠心肌纖維化模型的干預作用

2 Andr對HCFBs增殖及ECM相關蛋白的影響

50 μmol/L和100 μmol/L Andr處理HCFBs 48 h后，c-SKI表達顯著上調（P＜0.01），細胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖2A、B。選用50 μmol/L Andr作為最低有效劑量進行后續實驗。Western blot結果顯示，與PBS組相比，Andr組FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著下調（P＜0.01），見圖2C。

Figure 2.Effect of andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix-related protein expression in human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the protein level of c-SKI was detected by Western blot；B： the cell viability was detected by CCK-8 assay；C： the protein levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group.圖2 穿心蓮內酯對人心臟成纖維細胞活力和細胞外基質相關蛋白表達的影響

3 Andr對TGF-β1誘導HCFBs的影響

與PBS組相比，TGF-β1組細胞數量增多，細胞形態改變；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組細胞形態基本恢復正常，見圖3A。Western blot結果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組細胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著下調（P＜0.01），見圖3B。qPCR和Western blot結果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組c-SKI表達顯著下調（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組c-SKI表達顯著上調（P＜0.01），見圖3C、D。

Figure 3.Effect of andrgrapholide （Andr） on transforming growth factor-β1 （TGF-β1）-induced human cardiac fibroblasts （HCFBs）.A： the cell morphology was observed by microscope （scale bar=100 μm）；B： the levels of fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；C： the mRNA level of c-SKI was detected by qPCR；D： the protein level of c-SKI was detected by Western blot.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖3 穿心蓮內酯對轉化生長因子β1誘導的人心臟成纖維細胞的影響

4 敲減c-SKI聯合Andr對TGF-β1誘導HCFBs細胞增殖與ECM沉積的影響

Western blot結果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組c-SKI表達顯著下調（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調（P＜0.01）；與TGF-β1組相比，TGF-β1+Andr組c-SKI表達顯著上調（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著下調（P＜0.01）；與TGF-β1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組c-SKI表達顯著下調（P＜0.01），FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調（P＜0.05），見圖4A。CCK-8實驗結果顯示，與PBS組相比，TGF-β1組細胞活力顯著上升（P＜0.01）；與TGFβ1組相比，TGF-β1+Andr組細胞活力顯著下降（P＜0.05）；與TGF-β1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組細胞活力顯著上升（P＜0.05），見圖4B。

Figure 4.Effects of c-SKI knockdown combined with andrgrapholide （Andr） on the viability and extracellular matrix deposition of human cardiac fibroblasts （HCFBs） induced by transforming growth factor-β1 （TGF-β1）.A： the levels of c-SKI， fibronectin 1 （FN1）， α-smooth muscle actin （α-SMA）， vimentin and collagen type I （Col I） were detected by Western blot；B： the cell viability was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs PBS group；#P＜0.05， ##P＜0.01 vs TGF-β1 group；△P＜0.05， △△P＜0.01 vs TGF-β1+Andr+sh-NC group.圖4 敲減c-SKI聯合穿心蓮內酯對轉化生長因子β1誘導的人心臟成纖維細胞活力和細胞外基質沉積的影響

討 論

MF是對心肌損傷的反應性重塑過程，主要表現為心肌成纖維細胞增殖，分泌ECM蛋白替代受損組織。然而，ECM的過度產生和沉積，以及I型和III型膠原比例的上升，導致病理性纖維化重塑，從而促進心臟功能障礙的發展，最終導致心力衰竭，并增加死亡率。目前MF得不到很好的控制，是治療中仍待解決的難題。

Andr是從亞洲廣泛存在的草本穿心蓮中提取的二萜類化合物，因其具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性而被廣泛應用，在保護心血管系統和神經系統上具有獨特優勢［17］。Das等［18］的研究發現，Andr能夠通過抑制NF-κB通路抑制腎炎小鼠腎組織纖維化，顯著抑制心肌梗死小鼠的心臟肥大、心臟纖維化、炎癥反應等，緩解不良心臟重塑，增強Nrf2表達，減輕心肌梗死后的氧化應激［19］。在本研究中，我們利用不同濃度的Andr干預HCFBs后發現，細胞數量明顯減少，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，c-SKI顯著上調，FN1、α-SMA、vimentin和Col I顯著下調，表明Andr能有效抑制心肌纖維化，降低ECM相關蛋白水平，其作用可能與c-SKI表達相關。

TGF-β1是TGF-β最常見的一種亞型，對免疫細胞發育和成熟、維持免疫耐受、體內平衡及調節免疫反應都極為關鍵［20］，在心臟和血管形態發生及心血管穩態空間和時間調節中也起重要作用［21］。眾所周知，成纖維細胞的激活及其向肌成纖維細胞轉化是由TGF-β1介導的［22］。Liu等［23］發現，C188-9通過抑制TGF-β1信號通路誘導的成纖維細胞活化，緩解ISO誘導的小鼠心臟纖維化。Jurcic等［24］發現，上調ECM蛋白水平能促進組織纖維化，而ECM的生成需要I型和III型膠原蛋白。本實驗結果顯示，TGF-β1組HCFBs數量明顯增多，細胞形態改變，細胞中FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調，即TGFβ1能夠誘導心肌成纖維化；與TGF-β1組相比，加入Andr干預后，細胞形態恢復正常，細胞數量減少，FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著下調，即Andr能夠逆轉TGF-β1誘導的心臟成纖維化，影響成纖維細胞活力，減少ECM沉積。

本課題組前期已證實過表達c-SKI可顯著抑制成纖維細胞和冠狀內皮細胞增殖，其作用機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路有關［25］，同時c-SKI在快速心房起搏犬模型的心房組織中顯著下調，過表達c-SKI能抑制心房膠原沉積，且通過TGF-β1-Smad途徑逆轉心房顫動誘導的心房重塑［26］。在治療腎纖維化的過程中，上調c-SKI表達可以抑制TGF-β1活性，阻止腎纖維化進程［27］。凌佳等［28］發現，c-SKI沉默不會影響大鼠心肌細胞H9C2的增殖能力，但其侵襲和遷移能力均增強。本實驗先前已證實Andr促進c-SKI表達，TGF-β1的作用則相反。之后，與TGFβ1+Andr+sh-NC組相比，TGF-β1+Andr+sh-c-SKI組c-SKI表達顯著下調，FN1、α-SMA、vimentin和Col I表達顯著上調，提示敲減c-SKI逆轉了Andr對HCFBs活力和ECM沉積的抑制作用。

綜上所述，Andr能有效抑制心肌纖維化和心肌成纖維細胞增殖，減少ECM沉積，其作用機制可能與調控c-SKI表達、影響TGF-β1信號通路有關。下一步應探究Andr介導c-SKI抑制心肌成纖維細胞轉分化和心肌纖維化與TGF-β1信號通路的具體分子作用機制，為心肌纖維化發生發展的分子機制提供參考，給心力衰竭患者帶來新的治療思路。