基于轉錄組測序的油菜花粉BpFLS 基因克隆與分析

劉曉寧,郭宇錦,蔣雨萱,王一凡,陸玉晴,徐全樂

(1 黃河科技學院,鄭州 450006;2 西北農林科技大學 生命科學學院,陜西楊凌 712100)

油菜屬于十字花科蕓薹屬植物,其栽培品種主要包括甘藍型油菜(BrassicanapusL.)[1],白菜型油菜(BrassicarapaL.)[2]和芥菜型油菜(Brassica junceaL.)[3]。甘藍型油菜具有較高的營養價值,農業產量和觀賞價值,目前是世界上廣泛種植的第二大油料作物[4-6]。白菜型油菜具有抗寒、耐瘠薄、生育期短等優良特性,且種植歷史悠久,遺傳變異豐富,是油菜育種的重要資源庫[7]。油菜花粉是中國最富產的花粉,黃酮類物質是油菜花粉中重要的活性物質,不僅具有抗氧化和預防多種疾病等作用[8],而且在植物生長發育和抵御逆境脅迫中發揮著重要作用[9-13]。

黃酮醇是植物中最豐富的類黃酮,根據苯環(B環)的羥基化模式分為山萘酚和槲皮素[14-16]。黃酮醇來自于苯丙烷類代謝途徑,黃酮醇合成酶(flavonoid synthase,FLS)、黃烷酮-3-羥化酶(flavonoid 3-hydroxylase,F3H)在黃酮醇生物合成及積累中發揮關鍵作用[17]。FLS包含2個高度保守的蛋白結構域 DIOX_N(Pfam:PF14226)和 2OC-Fell_Oxy(Pfam:PF03171),因此與F3H 都屬于2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(2-oxoglutaratedependent dioxygenase,2-ODD)家族[18]。FLS基因在擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)[19-20]、苦蕎(FagopyrumtataricumL.)[21]、羅布麻(ApocynumvenetumL.)[22]、玉米(ZeamaysL.)[23]、葡萄(VitisviniferaL.)[24-25]和水稻(OryzasativaL.)[26]等植物中已有諸多報道,近年來,油菜FLS基因也被分離并對其開展了廣泛研究,Vu 等[27]從Hanla油菜幼苗中克隆BnFLS基因,過表達BnFLS轉基因油菜表現出明顯高的黃酮醇含量,ROS水平降低引起植株抗氧化能力顯著增加。Schilbert等[28]研究了13 個BnaFLS基因在甘藍型油菜Express 617中的基因結構、基因組定位和表達模式,發現BnaFLS1-1_express617和BnaFLS1-2_express617 可以恢復擬南芥ans/fls1和f3h突變體中山萘酚和槲皮素的含量,表明FLSs在生成二氫山萘酚和山萘酚中發揮了雙功能酶的作用。BnFLSs基因啟動子都含有MYB 識別序 列(5′-AcCTACCa-3′/5′-tGGTAGgT-3′),表 明油菜黃酮醇的合成途徑在轉錄水平上主要受R2R3-MYB轉錄因子的調控[29]。

門源油菜是青海省油料主產區之一,其花粉是前列康牌普樂安片的主要原料。門源油菜性陰涼、耐寒冷、生長期短、抗性強。然而,門源油菜花粉積累豐富的類黃酮物質含量和油菜抗逆性在分子水平上的研究少有報道,且FLS基因在門源油菜中還鮮見報道。因此,該研究依據門源油菜花粉與鄭州油菜花粉差異轉錄組測序數據,篩選BpFLS(BrassicapollenFLS)基因并進行生物信息學分析和基因克隆,為進一步分析BpFLS基因功能提供一定參考依據。

1 材料和方法

1.1 材 料

供試材料來源于青海門源油菜青油241,河南鄭州油菜豫油1號。

1.2 候選基因篩選

隨機采集若干株油菜花粉混合,3次平行取樣。用Trizol試劑提取花粉總RNA,由北京諾禾致源科技股份有限公司構建測序文庫,用Illumina NovaSeq 6000測序平臺進行轉錄組雙末端測序。經過原始數據過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查,獲得后續分析使用的有效數據(clean reads)。用HISAT2軟件將有效數據與甘藍型油菜參考基因組(ensemblplants_brassica_napus_ ast_ prjeb5043_v1 _gca_000751015_1)進行快速精確比對,獲取clean reads在參考基因組上的定位信息,用String-Tie軟件進行新轉錄本組裝,通過PFam、GO 和KEGG 等數據庫注釋新轉錄本,用subread軟件統計每個基因從起始到終止范圍內覆蓋的測序序列數(reads count),通過FPKM 計算基因的表達值,DESeq篩選差異表達基因,篩選標準為|log2αFC|≥1,且P≤0.05。

1.3 生物信息學分析

通過在線軟件ExPASy-ProtParam 對候選基因的基本理化性質進行分析;用ExPASy-PortScale、TMHMM server 2.0、SignalP 5.0 server和Plant-mPLoc v.2.0進行親/疏水性預測、蛋白質跨膜結構域預測、信號肽預測和亞細胞定位分析;用SWISS-MODLE進行蛋白質的三級結構預測。

1.4 系統進化樹構建和多序列比對分析

下載擬南芥和油菜中已報道的FLS氨基酸序列[19-20,27-28],用Clustal W 進行多序列比對,MEGA 11.0 軟件構建進化樹,Bootstrap method 設置為2 000,通過iTOL v3美化進化樹。

用EMBL-EBI網站的Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)分析工具,對BpFLSs基因和其他已知FLS的氨基酸序列進行多重序列比對,并用Jalview 進行多序列比對可視化,分析與FLS功能相關的保守結構域。

1.5 RACE擴增

按照天根RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒(DP441)操作說明提取總RNA,使用全式金EasyScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(one-step gDNA removal,N20415)獲得油菜各組織cDNA。根據轉錄組數據設計BpFLSs基因的熒光定量PCR引物P1/P2(表1),參照全式金PerfectStart? Green qPCR SuperMix說明書,以Actin基因為內參進行實時熒光定量PCR分析。設置3個重復,采用2-ΔΔCT計算基因相對表達量。目的基因編碼區擴增條件:94 ℃預變性60 s,98 ℃變性10 s,55 ℃退火15 s,68 ℃延伸60 s,35個循環,最后72 ℃延伸10 min。

表1 PCR 所用引物Table 1 Primers for PCR analyses

根據InvitrogenTMTRIzolMT試劑說明書提取青海門源油菜花粉RNA,按照SMARTer? RACE 5′/3′Kit制備cDNA。根據轉錄組數據設計Bp-FLS1-1編碼區引物P3/P4(表1),PCR 反應體系含10×Ex Taq Buffer 2 μL,10 μmol/L dNTPs mixture 2 μL,10 μmol/L FLS-F 1 μL,10 μmol/L FLS-R 1 μL,5 U/μL Ex Taq DNA 聚合酶0.5 μL,cDNA 1 μL,并用滅菌蒸餾水補充至20 μL。PCR 反應條件:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72℃延伸60 s,35個循環,最后72 ℃延伸5 min。

根據所得的已知編碼區設計5′端特異引物,以5′RACE-GSP/UPM 為引物建立RACE-PCR 反 應體系,擴增程序:94 ℃變性30 s,72 ℃延伸3 min,5個循環;94 ℃變性30 s,70 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,5個循環;94 ℃變性30 s,68 ℃退火30 s,72℃延伸3 min,25個循環?；厥誔CR 產物,連接到pRACE載體,轉化感受態細胞,陽性克隆送至生工測序。用Vector NTI軟件將測序得到的片段拼接得到BpFLS 的完整CDS 序列,設計全長引物Bp-FLS-F/BpFLS-R(表1),通過PCR 擴增得到目的條帶,用M13載體通用引物對陽性重組子進行測序。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因BpFLS 篩選

油菜花粉轉錄組測序后,獲得原始數據量在42.95～52.20 M 之間,原始測序量在6.44～7.83 G 之間;過濾后的平均數據量為45.06 M,平均測序量為6.76 G,Q30均值為93.72%,GC 含量均值為47.12%,表明測序質量良好,有效數據(clean reads)質量合格可用于后期數據分析。使用HISAT2和StringTie軟件對有效數據進行比對和組裝,獲得基因83 013個,KEGG 數據庫中注釋的為46 339個,其中,有92個基因參與類黃酮生物合成代謝通路。以|log2αFC|≥1且P≤0.05為標準進行青海門源油菜花粉和河南鄭州油菜花粉的差異轉錄組分析(圖1),結果顯示48個基因在不同來源的花粉中顯著差異表達,BpFLS基因家族成員被鑒定6個(表2),BpFLS1-1、BpFLS2、BpFLS3-1和BpFLS3-2基因在青海油菜花粉中顯著上調,Bp-FLS1-2和BpFLS4顯著下調,差異表達增強最大的為BpFLS1-1。

圖1 油菜花粉類黃酮生物合成通路的差異表達基因Hz.河南鄭州;Qm.青海門源。Fig.1 The differentially expressed genes in flavonoid biosynthesis pathways in rape pollenHz,Zhengzhou,He'nan;Qm,Menyuan,Qinghai.

表2 篩選的BpFLS 基因Table 2 Selected BpFLS genes

2.2 BpFLS 基因的生物信息學分析

2.2.1 BpFLS 基因編碼產物的基本性質分析

用ExPASy ProtParam 在線軟件對BpFLSs蛋白進行理化性質的分析,預測結果(圖2)顯示,BpFLS1-1蛋白由336個氨基酸組成,相對分子質量38 273.75 D,理論等電點為5.48,屬于酸性蛋白;含C、H、O、N、S共5種元素,分子式為C1737H2702N458O503S7,總原子數為5 407;有20種組成氨基酸,含量由大到小分別為亮氨酸(Leu)9.8%、谷氨酸(Glu)9.5%、脯氨酸(Pro)8.9%、纈氨酸(Val)8.0%、賴氨酸(Lys)6.5%、絲氨酸(Glu)6.2%、天冬氨酸(Asp)6.0%、異亮氨酸(Ile)6.0%、精氨酸(Arg)5.7%、甘氨酸(Gly)5.7%、丙氨酸(Ala)5.1%、苯丙氨酸(Phe)3.6%、蘇氨酸(Thr)3.6%、酪氨酸(Tyr)3.6%、天冬酰胺(Asn)3.0%、組氨酸(His)3.0%、谷氨酰胺(Gln)2.1%、色氨酸(Trp)1.8%、蛋氨酸(Met)1.5%、半胱氨酸(Cys)0.6%;精氨酸和賴氨酸共帶41個正電荷,谷氨酸和天門冬氨酸共帶52個負電荷;半衰期在大腸桿菌體內大于10 h,在酵母菌體內大于20 h,在哺乳動物體外網狀紅細胞為30 h;該蛋白為不穩定蛋白,其穩定系數為44.91;脂肪系數為89.88。BpFLS1-2、BpFLS2、BpFLS3-1、Bp-FLS3-2和BpFLS4均為酸性蛋白,氨基酸組成中占比最高的氨基酸為谷氨酸(Glu)、亮氨酸(Leu)和纈氨酸(Val),最低為半胱氨酸(Cys);與BpFLS1-1蛋白一樣,BpFLS1-2 屬于不穩定蛋白,BpFLS2、Bp-FLS3-1、BpFLS3-2和BpFLS4均為穩定蛋白。

圖2 BpFLS1-1為代表的親水性、跨膜結構、信號肽和三級結構的預測分析Fig.2 Analysis of hydrophilicity,transmembrane structure,signal peptide,and tertiary structure of BpFLS1-1

2.2.2 BpFLS蛋白的親/疏水性和跨膜域分析

用ExPASy K-D 法對BpFLSs蛋白進行親/疏水性的分析,預測結果(圖2)顯示,BpFLS1-1蛋白親水性最低值為-2.778,位于第153位氨基酸,疏水性最高值為2.011,位于第256位氨基酸。從整條肽鏈的氨基酸預測值來看,大部分為負值,沒有明顯的疏水區域,且平均疏水性為-0.414,表明該蛋白是一種親水性蛋白。與BpFLS1-1一樣,BpFLS1-2、BpFLS2、BpFLS3-1、BpFLS3-2 和BpFLS4 蛋 白的親水性平均系數均為負值,表明油菜花粉FLS蛋白都是親水性蛋白。

通過在線軟件TMHMM 2.0對BpFLSs蛋白進行跨膜結構的分析,預測結果(圖2)顯示,Bp-FLS1-1、BpFLS2、BpFLS3-1、BpFLS3-2和BpFLS4蛋白不存在跨膜結構域,因此,油菜花粉FLS蛋白均為非跨膜蛋白。

2.2.3 BpFLS蛋白信號肽、亞細胞定位和三級結構分析

用Signal P 5.0在線分析軟件對油菜花粉FLS基因所編碼的蛋白質進行信號肽預測。預測結果(圖2)顯示,這6個BpFLS蛋白質的氨基酸殘基平均信號肽最大得分值小于0.5,均無信號肽。因此,油菜花粉FLS蛋白均為非分泌型蛋白。

用Plant-mPLoc 2.0在線軟件對油菜花粉的黃酮醇合酶進行亞細胞定位預測。與上述通過Signal P 5.0 平臺對信號肽的預測結果吻合,油菜花粉FLS蛋白定位在細胞質中的可能性最大。

用SWISS-MODEL在線工具,對FLS蛋白進行三級結構預測(圖2)。油菜花粉FLS蛋白主要以α螺旋為主,其次是無規則卷曲,延伸鏈占的比重最小。

2.3 BpFLSs系統進化分析

擬南芥與油菜同為十字花科植物,其基因組包含6個FLS基因,迄今為止甘藍型油菜中已報道了14個FLS基因,在FLS氨基酸序列的系統進化樹中,18個FLS聚為4個分支,BpFLS1-1_pollen、Bp-FLS1-2_pollen 與AthFLS1、BnFLS、BnaFLS1-1_express617、BnaFLS1-2_express617 聚類到第1 個分支FLS1 家族,BpFLS2_pollen 與AthFLS2、BnaFLS2-1_express617聚類到第2個分支FLS2家族,BpFLS3-1_pollen、BpFLS3-2_pollen 與Ath-FLS3、BnaFLS3-3_express617、BnaFLS3-4_express617聚類到第3 個分支FLS3 家族,BpFLS4_pollen與AthFLS4 聚類到第4 個分支FLS4 家族(圖3)。

圖3 BpFLS 基因和擬南芥、油菜FLS 基因的系統發育分析Fig.3 Phylogenetic analysis of BpFLS candidates and FLS genes from Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.4 BpFLS氨基酸序列分析

多序列比對分析發現BpFLSs蛋白與擬南芥AthFLS、Express617 油 菜BnaFLS 和Hanla 油 菜BnFLS具有較高的同源性,BpFLS1-1與AthFLS1、BnFLS和BnaFLS1-1 的相似性分別為91.96%,98.81%和98.81%,BpFLS1-2與AthFLS1、BnFLS和BnaFLS1-2的相似性分別為91.37%,97.92%和99.70%,BpFLS2與AthFLS2、BnFLS和BnaFLS2-1的相似性分別為70.85%,61.11%和100.00%,Bp-FLS3-1與AthFLS3、BnFLS和BnaFLS3-3的相似性分別為67.65%,60.91%和100.00%,BpFLS3-2與AthFLS3、BnFLS 和BnaFLS3-3 的相似性分別為82.49%,65.20%和71.86%,BpFLS4與AthFLS4和BnFLS的相似性分別為58.69%和56.54%(表3)。

表3 油菜花粉BpFLS與其他成員的序列同源性Table 3 Sequence identity of BpFLS and other members %

BpFLSs蛋白序列中存在多個高度保守的氨基酸和基序,6個BpFLSs蛋白質結構中都包含與Fe2+結合的組氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸共3個保守氨基酸,以及與2-酮戊二酸結合的精氨酸、蘇氨酸共2個保守氨基酸,然而,與底物結合的保守氨基酸分析顯示BpFLS2和BpFLS4蛋白質有多個位點的氨基酸變化。Bp-FLS2、BpFLS3-2、BpFLS4缺少與FLS活性相關的重要基序——“P***IR***EQP”,“CPQ/RP*LAL”,“S**T*LVP”,但是保留了F3H 活性相關的A、G、H、P、P、P、H、D、G、H、R、S等12個氨基酸。與BnaFLS1s相似,BpFLS1-1和BpFLS1-2為雙功能酶,含有與F3H和FLS活性相關的所有氨基酸和基序(圖4)。

圖4 油菜花粉BpFLS與其他FLS的多重比較分析“P***IR***EQP”(紫色),“CPQ/RP*LAL”(藍色),“S**T*LVP”(橙色)是FLS活性必需的保守基序;綠色代表與底物結合的氨基酸,粉色代表與Fe2+結合的氨基酸,黃綠色代表與2-酮戊二酸結合的保守氨基酸;黑框代表與F3H 活性相關的氨基酸;紫藍色和黃色表示其他高度保守序列。Fig.4 Multiple comparison analysis of BpFLS with other FLSThe “PxxxIRxxxEQP”,“CPQ/RPxLAL”,and “SxxTxLVP” motifs are shown in purple,blue and orange,while residuesi nvolved in substrate-,ferrous iron-,and 2-oxoglutarate-binding are marked in green,pink,and chartreuse,respectively.Residues relevant for F3H activity are marked with a black box.Other highly conserved amino acids are labeledi n violet and yellow.

2.5 BpFLS1-1 基因克隆

以青海門源油菜花粉cDNA 為模板,RT-PCR擴增出1 011 bp產物(圖5),根據此片段設計特異性引物擴增出約500 bp 的5′端RACE-PCR 產物(圖6)。將測得的序列進行拼接,獲得1 170 bp的BpFLS1-1基因編碼序列。在獲得的完整編碼序列基礎上,設計用于擴增BpFLS1-1基因編碼區的引物并進行擴增,將該編碼區產物克隆至T 載體并篩選陽性重組子進行測序。

圖5 BpFLS1-1 基因RT-PCR 擴增產物Fig.5 RT-PCR products of BpFLS1-1

圖6 5′RACE擴增產物Fig.6 Products of 5′ RACE-PCR

2.6 BpFLS1-1 基因表達檢測

分別提取青海門源油菜的花粉和葉片總RNA,利用實時熒光定量PCR 進行BpFLS1-1基因表達水平分析,結果表明,花粉中的BpFLS1-1基因相對表達量是葉片組織的6倍,呈顯著差異(圖7)。

圖7 BpFLS1-1基因的qRT-PCR 檢測不同小寫字母表示不同樣本之間差異顯著(P＜0.05)。Fig.7 Expression analysis of BpFLS1-1 gene by qRT-PCRDifferent lowercase letters indicate significant differences among tissues (P＜0.05).

3 討論

黃酮醇廣泛存在于各種植物,其水平與花粉活力、萌發和花粉管生長密切相關[30]。研究表明,BnaFLSs基因在花藥組織中的表達水平較其他組織高[28],銀杏花粉總黃酮含量顯著高于葉片[31]。本研究中,BpFLS1-1基因在青海門源油菜花粉中的表達量較高,表明該基因在門源油菜花粉發育和黃酮積累中可能發揮關鍵作用。

提高黃酮醇含量的基因工程育種具有重要的農學意義。過表達EkFLS擬南芥通過提高類黃酮合成及ROS清除通路的關鍵酶轉錄表達水平,增加總黃酮及黃酮醇含量的積累,增強抗氧化酶活性以增強植物的抗氧化性,從而提高了植物MeJA 的耐受性以及耐鹽耐旱性[32]。擬南芥中過量表達AvFLS基因,能夠提高擬南芥的黃酮類化合物含量、光合速率,降低MDA 含量,從而顯著提高轉基因擬南芥的耐鹽能力[33]。已有研究從不同油菜品種的葉片組織中克隆 到BnFLS、BnaFLS1-1和BnaFLS1-2基 因,其cDNA長度均為1 011 bp,編碼336個氨基酸[27-28]。而本研究在門源油菜花粉中先后克隆了BpFLS1-1基因的2 個不同cDNA 序列,分別為1 011 bp 和1 170 bp,但是否在逆境脅迫應答中發揮作用,還需要后續進行體外酶活檢測[34]和功能驗證[35]。

綜上所述,該研究通過油菜花粉轉錄組測序,在黃酮類生物合成通路中篩選了6個差異表達的Bp-FLSs基因,BpFLS1-1基因在門源油菜花粉積累豐富的類黃酮物質和門源油菜抗逆性方面起關鍵作用。