一株貓皰疹病毒Ⅰ型(FHV-1)的分離鑒定及攻毒模型建立

王璐瑤,謝紅玲,閔娟娟,李晶梅,劉項羽,王明哲,王碧群,李婷婷,馮 釗,石寶蘭,漆世華,張棟梁

(國藥集團動物保健股份有限公司,武漢 430075)

貓皰疹病毒1型(Feline herpesvirus typeⅠ, FHV-1)屬于皰疹病毒科的皰疹病毒亞科[1]。自1958年Crandell和Maurer從患有上呼吸道疾病的貓中首次分離出FHV-1以來[2],FHV-1分布于世界各地,在臨床上是最重要的貓呼吸道感染病原體[3]。由FHV-1引起的貓病毒性鼻氣管炎是一種典型的急性、發熱、傳染性疾病,其特征在于打噴嚏并伴有眼和鼻分泌物。通常的潛伏期為2～4 d,有時更長。這種感染對于小貓或存在免疫系統疾病的貓死亡率較高,成年健康貓大多數在7～10 d內恢復,但會表現出終生潛伏期[4-5]。迄今為止開發的疫苗都沒有能夠在防止再次感染時病毒復制方面提供完全保護[6-8]。本研究將患急性上呼吸道疾病的貓鼻分泌物接種貓腎細胞,并進行連續傳代,將獲得的細胞培養物通過分子生物學的方法、透射電鏡觀察和貓攻毒實驗的鑒定,證實該分離株為FHV-1,為開展貓病毒性鼻氣管炎的診斷及疫苗的研發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 病料、細胞和實驗動物 眼、鼻拭子樣品取自武漢市某貓舍病貓,經臨床診斷和RT-PCR檢測貓皰疹病毒陽性。同時該病貓經試紙條和RT-PCR檢測貓杯狀病毒(FCV)和貓泛白細胞減少癥病毒(FPV)陰性。貓腎細胞系(F81)由國藥集團動物保健股份有限公司保存。2～3月齡健康藍貓購自北京偉特博瑞鼎生物技術有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM培養基、0.25%Trypsin-EDTA購自Gibco公司、胎牛血清(FBS)購自內蒙古奧普賽公司;2×Taq Plus Master MixⅡ (Dye Plus)購自Vazyme公司;FHV-1貓源陽性樣品由國藥集團動物保健股份有限公司保存;PCR儀購自博日科技有限公司;DYY-7C 電泳儀電源購自北京六一生物科技有限公司;倒置顯微鏡購自德國蔡司ZEISS公司。

1.3 病毒的分離純化與病變觀察 將患病貓的眼鼻分泌物病料浸泡在PBS溶液中并通過0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后,按照5%體積比接種于F81細胞中,并使用2%新生牛血清的DMEM培養基繼續培養3～6 d,逐日觀察有無細胞病變。培養物在細胞單層上連續盲傳3代,如不出現病變則棄去。若出現細胞病變則分離結果為陽性,將有80% CPE的細胞培養物按常規方法進行空斑純化3次。收獲的細胞培養物凍融2次,-70 ℃保存。

1.4 病毒的PCR鑒定 使用Multisource Genomic DNA/RNA Miniprep Kit (Axygen, Hangzhou, China)從1.3項獲得的純化后病毒液提取病毒基因組DNA,選擇FHV-1 gD基因的保守區域[9-10],利用DNAMAN軟件設計1對檢測FHV-1的特異性引物。上游引物: 5’- TCCGTCTAATGATGACACGTC-3’;下游引物: 5’-GAATGTGGACTTAAGGATG-3’。PCR反應采用50 μL反應體系,提取的DNA產物2 μL,10×Taq酶buffer(Mg2+plus)(20 mmol/L) 5 μL、引物F(10 μmol/L)1 μL、引物R(10 μmol/L)1 μL及dNTP Mix(2.5 mmol/L)4 μL,加無菌水36.75 μL,加TaKaRa Taq DNA聚合酶0.25 μL(5 U/μL)混勻,反應條件為98 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,30個循環后72 ℃延伸10 min,反應結束。以1%瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結果。

1.5 PCR產物的克隆和序列測定 PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后,使用大連寶生物公司的膠回收試劑盒進行回收,回收的片段在武漢擎科生物有限公司進行序列測定。將測序結果提交GenBank進行比對分析。使用MEGA-5軟件進行同源性分析。

1.6 病毒的形態學觀察 將1.3項收獲的純化后病毒液上清30000 r/min在4 ℃條件下進行超速離心5 h,離心后沉淀使用少量PBS進行復溶,取25 μL復溶樣品與2.5%醋酸鈾染液滴于封口膜上,將有支持膜的銅網先置于樣品滴上,3～5 min后用鑷子夾起,用干凈三角形濾紙片從銅網邊緣輕輕吸去液體,將稍干的銅網置于染液上染色3 min,以同樣的方法使用濾紙吸去染液,將制備好的銅網在JM-100CX透射電鏡下觀察病毒形態并拍照。

1.7 攻毒實驗 選擇6只健康藍貓,中和實驗檢測無FHV-1/FCV/FPV抗體,2～3月齡,體重1.8～2.0 kg,隨機分為兩組,通過常規病毒含量檢測的方法[19]確定分離株F4代細胞培養物的病毒含量,適當稀釋后,實驗組三只貓通過滴鼻點眼的途徑接種含有107.0TCID50/mL的分離株1 mL/貓,對照組三只貓相同的接種方式接種PBS。由于FHV-1的傳播主要是通過與感染動物的直接接觸,實驗組和對照組分別飼養在不同地方,避免交叉。每天測量每只貓的體溫,并觀察臨床癥狀。接種后第3 d開始收集鼻、眼、咽喉分泌物進行PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 病毒的分離培養 在接種病料72 h后,F81細胞表現出明顯皰疹病毒感染后的細胞病變,其特征主要為細胞變圓、圓縮,部分細胞出現壞死脫落呈現空斑狀,96 h時貼壁細胞剩約10%?？瞻呒兓?次后的病毒液以2%比例繼續在F81細胞上進行傳代,通過觀察發現病毒在48 h～72 h出現皰疹病毒典型CPE,而對照的F81細胞未出現CPE(圖1)。

2.2 病毒的鑒定

2.2.1 病毒PCR檢測及同源性分析 使用FHV-1的特異性引物,對FHV-1每一輪空斑純化后克隆毒株進行PCR鑒定,顯示均為 FHV-1 陽性,擴增片段約1125 bp,與預期gD基因大小相符合(圖2)。將成功分離的FHV-1命名為WHFHV05株。gD基因的測序結果通過MEGA-5軟件比對分析發現,與GenBank上美國典型毒株C27(FJ478159.2)、澳大利亞分離毒株(KR381802.1、KR381788.1)、中國黑龍江分離株(MH027311.1)、美國MILW_12、PHIL_01毒株(MH070338.1、MH070336.1)和英國CH-B毒株(MT813047.1)的同源性均為100%,說明分離株WHFHV05的基因保守性良好(圖3)。

圖3 WHFHV05株gD基因同源性分析Fig 3 Homology analysis of gD gene of WHFHV05 strain

2.2.2 WHFHV05株病毒顆粒電鏡觀察 超速離心收獲的細胞培養物通過電鏡觀察,發現病毒粒子為球形,外觀呈圓形,直徑在120 nm左右,特點是體積大,有囊膜,核心電子致密度高,有的在囊膜外可見纖突(圖4)。

圖4 分離株WHFHV05株電鏡觀察結果Fig 4 Electron microscope observation results of isolated strain WHFHV05

A:實驗組貓;B:空白對照組;C:感染后鼻拭子PCR鑒定M: DNA分子量標準(DL2000);1: FHV-1陽性對照組;2: 陰性對照組;3-5: 實驗組貓(1#～3#)A:Experimental group;B:Blank control group;C:PCR identification of nasal swabs of cats after infectionM: DL2000 DNA Maker;1: FHV-1 positive control;2: Negative control; 3-5: Experimental group (1#～3#)圖5 感染分離株WHFHV05的貓臨床癥狀觀察Fig 5 Observation of clinical symptoms of cats infected with isolate WHFHV05

M: DNA分子量標準(DL2000); 1: FHV-1陽性對照;2-6: 實驗組1#貓感染WHFHV05株后3～7 d眼拭子PCR鑒定;7: 陰性對照M: DL2000 DNA Marker; 1: FHV-1 positive control; 2-6: PCR identification of eye swabs 3～7 days after the cats in experimental group 1# were infected with WHFHV05 strain; 7: Negative control圖6 感染分離株后貓的臨床病料PCR鑒定Fig 6 PCR identification of clinical disease materials of cats infected with the isolates.

2.3 分離株的攻毒實驗 F4代細胞培養物病毒含量為108.0TCID50/mL,稀釋后進行攻毒實驗。圖5結果顯示,實驗組3只貓感染WHFHV05株3 d后均出現眼分泌增加和流鼻涕,隨后出現流膿涕及黃色的炎性眼分泌物等臨床癥狀,鼻拭子樣品PCR鑒定均為FHV-1陽性;對照組貓未出現明顯臨床癥狀。對實驗組1#貓感染病毒后3～7 d的眼分泌物進行檢測發現FHV-1 gD基因陽性(圖6)。同時通過采集實驗組和對照組貓血清進行中和試驗排除FCV的感染。因此,分離株WHFHV05感染2～3月齡貓臨床癥狀明顯,且存在持續排毒的情況。

3 討論與結論

貓皰疹病毒引起的貓傳染性鼻氣管炎,對于新生的幼貓或者免疫力低下的貓危害嚴重,結膜和口鼻黏膜暴露病毒后,FHV-1在這些部位大量的復制,導致發熱、打噴嚏、結膜炎、角膜炎和眼鼻分泌物[11-12]。因此,FHV-1的分離和鑒定對于了解貓呼吸道疾病的流行病學和發病機制至關重要。本研究使用F81細胞從臨床樣本中成功分離FHV-1。在受感染細胞中觀察到的細胞病變與之前FHV-1感染的報道一致。受感染的細胞融合聚集,形成大的多核巨細胞,進而形成合胞體是 FHV-1感染的標志[13]。此外,受感染細胞變圓和脫離也是FHV-1感染的典型特征。這些變化表明FHV-1對呼吸道上皮細胞造成了損害,這可能導致受感染的貓出現嚴重的呼吸道癥狀。對細胞培養物富集后電鏡觀察可見明顯的外觀呈圓形,直徑在120 nm左右,有囊膜的病毒顆粒,形狀和大小與所報道的貓皰疹病毒顆粒一致[14]。對分離株的糖蛋白gD基因測序分析發現,與GenBank上已報道的貓皰疹病毒Ⅰ型gD基因序列具有100%的同源性,進一步表明分離的毒株為FHV-1。

FHV-1是一種DNA病毒,屬于α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬。該病毒僅存在一種血清型,并且與其他α-皰疹病毒一樣,會在三叉神經節中誘導潛伏期。因此,臨床上治療后的貓仍會終生攜帶病毒,特別是當自身受到應激時,會經歷周期性的病毒重新激活,引起二次感染[13]。臨床上常見的治療貓感染FHV-1的藥物有泛昔洛韋或阿昔洛韋,這些藥物在一定程度上可以改善臨床癥狀,但常存在嚴重的副作用及治療后復發的情況[15-17]。目前針對該病的預防主要依賴進口的貓三聯疫苗,國內的疫苗產品還處在研發階段。本研究獲得FHV-1分離株WHFHV05以107.0TCID50/mL劑量感染2～3月齡健康貓后,出現膿性的眼鼻分泌物和打噴嚏等臨床癥狀,使用PCR方法對感染貓的眼分泌物進行病原監測發現,病貓在3～7 d內會持續排毒。與報道的FHV-1引起的貓呼吸道感染癥狀一致[18],說明該分離毒株可用于疫苗研發過程中的檢驗用毒。

本研究使用細胞培養和分子生物學技術從臨床樣本中成功分離和鑒定了FHV-1,提供了有關FHV-1流行病學和病原學信息。與此同時,臨床感染模型的成功建立為貓皰疹病毒發病機制的研究和疫苗的研發奠定了基礎。