蒙藥角茴香配方顆粒指紋圖譜及含量測定研究

韓子璇，劉夢，楊立茹，李佳，康廷國*，張純剛，2，3*（.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 6620；2.長治醫學院藥學系，山西 長治 046000；3.祈蒙股份有限公司，內蒙古 赤峰 024330）

蒙藥材角茴香是蒙醫常用藥材，為罌粟科植物直立角茴香（或細葉角茴香）HypecoumerectumL.的干燥全草，別名咽喉草、山黃連等，主產于內蒙古、河北、遼寧等地[1-2]。角茴香具有解毒、解熱、止痛等功效，含有生物堿類、黃酮類、糖類、酸類、微量元素等多種化學成分，其中的生物堿類成分具有抗炎、抗菌、鎮痛、保肝等藥理作用，是角茴香的主要活性成分[3-5]。

蒙醫藥的理論基礎獨特，在劑型方面多以散劑、丸劑為主，而且在許多藥方、制劑中習慣性采用原粉入藥，導致蒙藥制劑服用口感差，患者依從性差。本課題組在前期研究中成功制備了角茴香配方顆粒，改善了原散劑的適口性，便于臨床調配。經過實驗室初步驗證及試驗生產，證實該顆粒符合蒙藥制劑企業的制劑需要與生產要求。

通過對角茴香藥材和相關制劑的質量標準及有關文獻進行調研發現，目前角茴香藥材收錄于2020版《內蒙古蒙藥飲片炮制規范》，并規定HPLC法測定藥材中原阿片堿的含量不得少于0.3%[1]；文獻涉及有對角茴香中生物堿、黃酮類成分的提取、含量測定及指紋圖譜的研究，但文獻數量較少，且內容不全，更無關于角茴香配方顆粒的研究[6-9]。為更好地對蒙藥角茴香配方顆粒進行質量控制，本研究建立蒙藥角茴香配方顆粒的HPLC指紋圖譜，并在此基礎上對指紋圖譜指認的3種化學成分進行含量測定，以期為蒙藥角茴香配方顆粒的質量控制及蒙藥新劑型的發展提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

15批直立角茴香藥材細粉（批號：YL2022201、YL2022301、YL2022302、YL2022401～YL2022404、YL2022501～YL2022503、YL2022601～YL2022604、YL2022701，產地：祈蒙股份有限公司）；蘆?。ㄅ枺?00080-202012，純度：91.6%）、原阿片堿（批號：110853-201805，純度：99.6%）（中國食品藥品檢定研究院）；黃連堿對照品（批號：F1111AS，純度＞98.0%，大連美侖生物技術有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）；乙腈（色譜純，瑞典歐森巴克化學公司）；甲醇、乙酸銨（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；冰醋酸、鹽酸（分析純，上海潤捷化學試劑有限公司）。

1.2 儀器

Y-2搖擺制粒機（上海天和制藥機械有限公司）；SG3300H超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；CP225D十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；LC-1100高效液相色譜儀（美國安捷倫公司，包括四元泵，VWD可變波長掃描紫外檢測器，Chemstations化學工作站）。

2 方法與結果

2.1 角茴香配方顆粒的制備

分別取15批過100目篩的角茴香藥材細粉各200.0 g，加入適量輔料混合均勻，再加入適量水為潤濕劑，用手不斷揉捏混勻得到“手握成團，輕壓即散”狀態的軟材，通過搖擺制粒機制粒（14目篩網），收集所得顆粒，60℃下烘干。按照2020年版《中國藥典》四部通則0982雙篩分法整粒（能通過一號篩但不能通過五號篩），包裝，得到15批蒙藥角茴香配方顆粒，均符合制藥企業生產要求，批號為JHXPFKL-1～JHXPFKL-15。

2.2 色譜條件

采用COSMOSIL 5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以乙腈（A）-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）（B）為流動相，梯度洗脫（0～5 min，5%～6%A；5～15 min，6%～11.5%A；15～20 min，11.5%A；20～25 min，11.5%～17.5%A；25～30 min，17.5%A；30～35 min，17.5%～ 20%A；35～45 min，20%A；45～50 min，20%～ 25%A；50～55 min，25%A；55～60 min，25%～ 30%A；60～65 min，30%～5%A）；流速1.0 mL·min－1；柱溫28℃；檢測波長300 nm；進樣量10 μL。

2.3 供試品溶液的制備

取蒙藥角茴香配方顆粒樣品，研細，精密稱定0.200 g，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50），超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，放至室溫后定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，取續濾液，即得[10]。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取適量蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品分別置于10 mL量瓶中，用甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）超聲溶解，放至室溫后定容至刻度，分別得到質量濃度為0.181、0.366、0.165 mg·mL－1的蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品儲備液。精密移取各儲備液適量于10 mL量瓶中，用甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）稀釋定容至刻度，配制成質量濃度分別為54.28、183.14、16.45 μg·mL－1的混合對照品溶液。其中，蘆丁校正質量濃度為49.72 μg·mL－1。

2.5 角茴香配方顆粒HPLC指紋圖譜的建立

2.5.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），在“2.2”項色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果各共有峰的相對保留時間RSD值均＜0.79%，相對峰面積RSD值均＜1.2%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性試驗 取同一批角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進行分析測定，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果各共有峰的相對保留時間的RSD值均＜0.82%，相對峰面積的RSD值均＜1.5%，表明該方法重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），按“2.2”項下色譜條件分別于第0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜圖，以13號峰（原阿片堿）為參照峰，計算18個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值，結果各共有峰的相對保留時間RSD值均＜0.91%，相對峰面積的RSD值均＜3.4%，表明角茴香配方顆粒供試品溶液在24 h內穩定。

2.5.4 指紋圖譜的建立 取15批角茴香配方顆粒（JHXPFKL-1～JHXPFKL-15），按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按照“2.2”項下色譜條件進樣分析，得到指紋圖譜見圖1。

圖1 角茴香配方顆粒（S1）和混合對照品（S2）指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of hypecoum formula granules（S1）and mixed reference substances（S2）

2.5.5 共有峰標記 以原阿片堿作為參考峰，標定了18個共有峰，其中11號峰是蘆丁，13號峰是原阿片堿，16號峰是黃連堿，角茴香配方顆粒及混合對照品HPLC指紋圖譜見圖1。以13號峰（原阿片堿）為參照峰，18個共有峰相對保留時間的RSD均＜0.49%，相對峰面積的RSD在2.9%～28.3%。表明不同批次的角茴香配方顆?；瘜W成分種類相似，但成分含量存在一定差異。

2.5.6 相似度計算 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》2012版，導入15批角茴香配方顆粒的圖譜數據，采用“平均數”法生成對照圖譜R，經多點校正、色譜峰匹配，得到15批角茴香配方顆粒的色譜圖見圖2。以對照圖譜R為參照，15批角茴香配方顆粒的相似度均在0.982以上，相似度見表 1。反映角茴香配方顆?；瘜W成分組成基本一致，整體質量相對穩定，符合指紋圖譜研究要求。

表1 15批角茴香配方顆粒指紋圖譜相似度Tab 1 Fingerprint similarity of 15 batches of hypecoum formula granules

圖2 15批角茴香配方顆粒HPLC疊加指紋圖譜Fig 2 HPLC overlapp fingerprint of 15 batches of hypecoum formula granules

2.6 角茴香配方顆粒有效成分的含量測定

2.6.1 專屬性考察 取空白溶劑（甲醇-1%鹽酸溶液（50∶50）、混合對照品溶液、角茴香配方顆粒供試品溶液（批號：JHXPFKL-1）適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，結果見圖3。角茴香配方顆粒供試品與蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品在相同保留時間有相同色譜峰且分離度良好，空白溶劑在供試品及對照品色譜峰的保留時間處無干擾，說明該方法專屬性較好。

圖3 空白溶劑（A）、混合對照品溶液（B）、角茴香配方顆粒供試品（C）HPLC色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of blank solvent（A），mixed reference substances（B），and sample of hypecoum formula granules（C）

2.6.2 線性關系考察 精密吸取“2.4”項下混合對照品溶液適量，逐級稀釋并定容搖勻，得到含蘆?。ò葱Ｕ|量濃度記）13.03、16.30、20.36、25.46、31.82、39.77、49.72 μg·mL－1，原阿片堿48.01、60.01、75.01、93.77、117.21、146.51、183.14 μg·mL－1，黃連堿3.45、4.31、5.39、6.74、8.43、10.53、16.45 μg·mL－1系列濃度的混合對照品溶液。依照“2.2”項下色譜條件進樣，測定蘆丁、原阿片堿、黃連堿的峰面積。分別以3種對照品的質量濃度X（μg·mL－1）和峰面積Y繪制回歸曲線，得回歸方程如表2所示[10]。

表2 各成分線性關系考察結果Tab 2 Linearity of each component

2.6.3 精密度試驗 取同一份角茴香配方顆粒供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），依照“2.2”項下色譜方法連續進樣6次，記錄蘆丁、原阿片堿、黃連堿峰面積，結果RSD值分別為0.49%、0.15%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 重復性試驗 取同一批角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1）6份，每份0.200 g，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，進樣測定，計算蘆丁、原阿片堿、黃連堿平均含量分別為0.15%、0.54%、0.05%，RSD值分別為0.22%、0.56%、0.90%，表明該方法重復性良好。

2.6.5 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（批號：JHXPFKL-1），分別于第0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄蘆丁、原阿片堿、黃連堿峰面積，結果RSD值分別為0.72%、0.41%、0.95%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.6.6 加樣回收試驗[11]精密稱取6份已知含量的角茴香配方顆粒（批號：JHXPFKL-1），每份0.100 g。按供試品中指標成分量與加入對照品量之比1∶1原則，分別在每份樣品顆粒中加入適量的蘆丁、原阿片堿、黃連堿對照品。按“2.3”項下方法制備6份供試品溶液進樣測定，計算3種成分的加樣回收率。結果顯示，蘆丁、原阿片堿、黃連堿的平均加樣回收率分別為101.57%、107.44%、101.44%，RSD值分別為0.78%、0.96%、1.7%，表明該方法回收率良好。

2.6.7 樣品含量測定 取15批角茴香配方顆粒，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，分別計算蘆丁、原阿片堿、黃連堿的含量，結果見表3。15批角茴香配方顆粒中蘆丁的含量為0.12%～0.23%、原阿片堿的含量為0.50%～0.54%、黃連堿的含量為0.04%～0.05%，表明各批次顆粒間3種成分含量有一定差異，但整體含量較穩定。

表3 15批角茴香配方顆粒中3種成分的含量測定結果Tab 3 Content of 3 chemical ingredients in 15 batches of hypecoum formula granules

3 討論

3.1 色譜條件的優化

本課題組在前期研究中分別對乙腈-1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.1%醋酸（三乙胺調pH 5.0）、甲醇-0.3%三乙胺、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨、乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）作為流動相進行考察，發現采用乙腈-0.1 mol·L－1乙酸銨（含0.05%冰醋酸）作為流動相時色譜峰較多、分離度較好且基線穩定，故選用此流動體系。同時，對不同溫度（25、28、30℃）、不同檢測波長（280、289、300 nm）、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL·min－1）等條件進行考察。結果不同溫度條件下，出峰時間與各峰之間分離度有一定差異，25、30℃條件下存在部分色譜峰峰高不明顯或分離度不夠的情況，故選擇柱溫為28℃。檢測波長為300 nm時，指紋圖譜整體峰高比例較好且溶劑峰影響較小，故選擇檢測波長為300 nm。

3.2 指紋圖譜的建立及含量測定結果分析

指紋圖譜技術兼具模糊性、整體性與差異性，可在成分不明確的情況下區分藥材種屬、反映藥材整體質量，適用于成分復雜或對照品不足的中藥及中藥制劑的質量研究[12]。角茴香作為一種天然藥物，物質基礎復雜，僅采用單一指標很難綜合考察其質量。因此本研究建立角茴香配方顆粒指紋圖譜，并對其中有效成分含量進行測定，更加科學、全面地考察角茴香配方顆粒的質量。

生物堿是角茴香的主要藥效成分，其中的原阿片堿具有鎮痛、抗炎的藥理作用。黃酮類是角茴香中除生物堿外的另一主要化學成分，因此，在指認原阿片堿、黃連堿的基礎上，增加黃酮類成分蘆丁色譜峰的指認，并對3種有效成分進行含量測定，可更加完善對蒙藥角茴香配方顆粒的化學表征。建立的蒙藥材角茴香配方顆粒指紋圖譜及含量測定結果顯示，制備的15批角茴香配方顆粒質量穩定，符合質量要求，可為后續角茴香藥材及制劑的質量研究提供參考。