基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和網絡藥理學的半夏炮制前后差異性物質基礎及功效分析

石琨群,熊玥,錢香,朱育鳳,姚毅,張倩,劉史佳

(1.南京中醫藥大學附屬醫院/江蘇省中醫院藥學部,江蘇 南京 210029;2.南京中醫藥大學第一臨床醫學院,江蘇 南京 210023;3.江蘇省畜產品質量檢驗測試中心,江蘇 南京 210036;4.宜興市中醫醫院兒科,江蘇 宜興 214299)

半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.) Breit.的干燥塊莖,味辛、性溫,有毒,歸脾、胃、肺經,有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結的功效[1]?！吨袊幍洹分惺珍浀姆ò胂?、姜半夏、清半夏,均為臨床常用品種。陳麗君等[2]在810篇使用半夏的文獻中發現,半夏炮制品的使用頻率較高,共1 062次,占總次數的58.9%。不同炮制品的功效各有側重:法半夏在炮制過程中輔以甘草,著重于祛寒痰;姜半夏為生半夏用水浸泡至內無干心時,加生姜與白礬共煮所得,著重于溫中降逆止嘔;清半夏是由白礬溶液浸泡或煮至內無干心得到,側重于燥濕化痰[3]。盡管前期對半夏的化學成分研究較多,但尚未系統分析半夏及其炮制品的差異性成分,并挖掘差異性功效。本課題組前期已建立了半夏指紋圖譜[4],并發現半夏炮制前后核苷類成分含量有顯著差異。本文擬基于液質聯用技術及多變量統計分析方法,對半夏及其炮制品的成分進行差異性分析并鑒定,進一步結合網絡藥理學分析半夏炮制前后不同的主要作用靶點,及差異性功效作用機制,為半夏及其炮制品的臨床合理應用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀配PDA檢測器及Empower 3工作站(美國Waters公司);Triple TOF 4600超高效液相色譜-飛行時間高分辨質譜儀配OS及MasterView軟件(美國SCIEX公司);FA1204型萬分之一電子分析天平(常州市幸運電子設備有限公司);PL-S60T型數顯超聲波清洗機(東莞康士潔超聲波科技有限公司);高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 試劑

乙酸、甲酸、乙腈均為色譜純(德國Merck公司),純水。

1.3 樣品

半夏于當地農戶處收集與市場購得后經生產加工,得其炮制品樣品,由江蘇省中醫院朱育鳳主任中藥師鑒定為天南星科植物半夏Pinelliaternata(Thunb.)Breit.的干燥塊莖。詳細飲片信息見表1。

1.4 溶液制備

1.4.1 供試品溶液制備 取半夏及其炮制品樣品粉末約2.0 g(過4號篩),精密稱定,置50 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL水,超聲提取60 min(功率280 W,頻率53 kHz),放冷后稱定質量,用水補足減失質量,搖勻后過濾,取續濾液離心10 min(10 000 r·min-1),取上清液即得供試品溶液。

1.4.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱定各對照品,加水溶解配制成濃度分別為1.40、1.14、1.64、1.21、1.16、2.91、3.61、3.05、1.19、3.18、2.98、6.22、1.65 mg·mL-1的檸檬酸、琥珀酸、亞油酸、天冬氨酸、谷氨酸、尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤、肌苷、鳥苷、腺苷、胸苷和6-姜辣素對照品儲備液。精密移取上述各對照品儲備液適量,配成含對照品濃度分別為9.33、9.50、10.93、8.07、11.60、19.40、24.07、20.33、7.93、21.20、19.87、10.37、11.00 μg·mL-1的混合對照品儲備液。

1.5 色譜及質譜條件

1.5.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);柱溫:30 ℃;進樣體積:1 μL;流速:0.2 mL·min-1;流動相A為0.1%乙酸水溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫:0～10 min,2%～5%B;10～20 min,5%～50%B;20～25 min,50%～95%B;25～30 min,95%B;30～30.1 min,95%～2%B;30.1～35 min,2%B。

1.5.2 質譜條件 采用ESI離子源,分別在正、負離子模式下采集數據。正離子模式:電噴霧電壓為5 500 V,溫度為500 ℃,霧化氣體為N2,霧化氣壓力344.75 kPa(50 Psi),輔助霧化氣壓力344.75 kPa(50 Psi),氣簾氣為241.32 kPa(25 Psi);一級質譜掃描范圍為60～1 000 Da,去簇電壓為80 V;碰撞能量為10 eV;二級質譜掃描范圍為60～1 000 Da,去簇電壓為80 V,碰撞能量為35 eV,碰撞電壓擴展能量為15 eV;開啟動態背景扣除(DBS)。負離子模式:噴霧電壓為-4 500 V;一級質譜去簇電壓為-80 V,碰撞能量為-10 eV;二級質譜去簇電壓為-80 V,碰撞能量為-35 eV;其他條件同正離子模式。

1.6 系統穩定性檢測

將樣本等量混合后制備得到質控樣品,每進樣10針樣品進樣1針質控樣品,考察儀器的系統穩定。

1.7 數據分析

獲取UPLC-Q-TOF/MS圖譜后,采用Analyst?TF 1.7導出原始數據,使用MS-DIAL軟件對數據進行峰提取、峰對齊等預處理,分別將處理后的正負離子下的數據表導入SIMCA14.0進行多變量統計分析。利用主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)將半夏炮制品和生半夏進行對比分析,通過變量重要性投影(VIP)值、P值和差異倍數(Fold change,FC)值篩選出差異性成分。并通過數據庫及文獻比對,對差異性成分進行鑒定。

結合上述差異性成分與文獻報道,確定半夏及其炮制品的活性成分,在TCMIP數據庫(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php/Home/Login/login.html)中搜索成分以獲取基因靶點。將得到的基因靶點導入String數據庫(https://cn.string-db.org/)進行PPI網絡分析,將PPI結果數據分別導入Cytoscape3.9.1軟件,利用cytonca功能對結果進行拓撲屬性分析,得到核心靶點。將核心靶點導入Metascape數據庫(https://metascape.org/),進行GO富集和KEGG富集分析,富集均以P<0.01具有統計學差異。將得到的結果利用Cytoscape軟件,作“中藥-成分-靶點-通路”可視化圖。

2 結果

2.1 總離子流圖

正離子和負離子模式下,生半夏、法半夏、姜半夏、清半夏的總離子流圖如圖1所示?？梢钥闯錾胂暮团谥破分g存在差異,說明炮制后部分成分發生變化。

2.2 篩選差異性成分

將數據按“2.4”項下方法預處理后,將正負離子數據分別導入SIMCA14.1,經過log10(x+1)變換和Par縮放標準化后,進行PCA分析。正離子模式下得到有7個主成分的PCA得分圖(R2X=0.813,Q2=0.739),負離子模式下得到有7個主成分的PCA得分圖(R2X=0.793,Q2=0.693)(圖2),可以看出生半夏和炮制品區分均明顯,成分上存在差異。且由圖可以看出QC樣本聚集,且正負離子模式下均有大于70%的峰面積RSD≤30%(表2),說明方法和儀器穩定性良好(PCA是多維空間的二維投影,在投影中產生偏離是正常的)。分別將三種炮制品與生半夏做OPLS-DA分析,并進行200次置換檢驗(圖3),結果顯示,正、負離子模式下生半夏和三種炮制品均區分明顯,檢驗未過擬合,模型預測能力良好。以VIP>1.5,P<0.01,FC>2或<0.5為標準篩選差異性成分。利用MS-DIAL軟件導入msp文件[MA-DIAL官網中公共數據庫MassBank、ReSpect、RIKEN IMS oxidized phospholipids、GNPS、Fiehn HILIC、CASMI2016、MetaboBASE、RIKEN PlaSMA authentic standards、RIKEN PlaSMA bio-MS/MS (MSI level 1,2,3, or 4)from plant tissues、Fiehn/Vaniya natural product library、BMDMS-NP及PFAS],將差異性成分與數據庫中成分進行配對,并參考文獻,最終鑒定出生半夏和其炮制品的差異性成分,見表3。

注:SBX.生半夏;FBX.法半夏;JBX.姜半夏;QBX.清半夏。A.正離子模式;B.負離子模式

正離子模式

表2 QC樣本峰面積RSD(%)Table 2 RSD of peak area of QC sample(%)

表3 生半夏及其炮制品差異性成分Table 3 Analysis of the differences of Pinellia ternata and its processed products

由表3可知,生半夏和法半夏的差異性成分主要來自甘草,如甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、異甘草苷等。法半夏中酰胺類成分含量降低,有機酸類、酯類及3'-磷酸腺苷含量升高。生半夏與姜半夏差異性成分主要為核苷類、黃酮類、氨基酸類等,并由FC值可知:生半夏姜制后多種成分相對含量都降低,主要為鳥苷、黃嘌呤、酪氨酸、O-琥珀酰-L-高絲氨酸等;而磷酸腺苷相對含量升高。生半夏和清半夏的差異性成分與生半夏和姜半夏的差異性成分相似。此外,經白礬炮制后,鞘氨醇相對含量下降,但炮制后上調的成分未鑒定出來[5-7]。

2.3 網絡藥理學分析

結合文獻[8-10]及差異性分析結果,選取生半夏中鳥苷、肌苷、黃嘌呤、酪氨酸、谷氨酸、鞘氨醇、琥珀酸7個活性成分,法半夏中腺苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、異甘草苷、麻黃堿7個活性成分。姜半夏6-姜辣素、腺苷、肌苷、琥珀酸、棕櫚酸、檸檬酸6個活性成分。清半夏與生半夏相比,沒有特有成分,靶點分析結果和生半夏相似,因此不將清半夏作為分析對象。據“2.4”項下的方法,從TCMIP網站獲得生半夏337個基因靶點,法半夏372個基因靶點,姜半夏346個基因靶點。并通過String網站和Cytoscape3.9.1軟件進行PPI蛋白互作分析,得到生半夏310個節點;法半夏304個節點;姜半夏311個節點。計算度值(Degree)、介數(Betweenness)、緊密性(Closeness)3個重要拓撲參數,選取均大于中位數且度值≥50作為核心靶點,得到生半夏67個核心靶點,法半夏45個核心靶點,姜半夏38個核心靶點,構建PPI網絡(圖4、表4)。結果可知,生半夏AKT1、EPRS、ALDH18A1、GOT2、GAD2,法半夏GAPDH、ACTB、AKT1、HSP90AA1、TNF,姜半夏GAPDH、AKT1、INS、MAPK3、SRC等靶點度值較高。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

表4 生半夏及其炮制品前10個核心靶點拓撲參數Table 4 Topological parameters of the first 10 core targets of Pinellia ternata and its processed products

對這些靶點進行GO功能注釋和KEGG富集分析(圖5～6),GO富集結果顯示:生半夏共30條富集,其中20條Biological Processes,3條Cellular Components,7條Molecular Functions,涉及到氨基酸、核苷代謝與合成,煙酰胺代謝,突觸傳遞與調節,細胞因子刺激反應,三羧酸代謝等;法半夏共40個,其中34條Biological Processes,3條Cellular Components,3條Molecular Functions,主要涉及對脂質的反應、腺體發育、前體代謝物和能量的產生、對脂多糖的反應、異物刺激反應等。姜半夏共33個,其中28條Biological Processes,3條Cellular Components,2條Molecular Functions,涉及前體代謝物和能量的產生、腺體發育、蛋白質運輸調節、吞噬作用、類固醇激素反應等。KEGG結果顯示生半夏主要參與氨基酸代謝與合成、Rap1信號傳導、半胱氨酸和蛋氨酸的代謝、抑郁癥和帕金森病的發生發展等;法半夏參與雌性激素信號傳導、COVID-19、病毒性心肌病、擴張型心肌病的發生發展等;姜半夏參與癌癥的中央碳代謝、核苷酸代謝、炎癥介質對TRP通道的調節、酒精性肝病的發生發展等。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

利用Cytoscape軟件將上述成分及對應的靶點通路作“中藥-成分-靶點-通路”可視化圖(圖7)。生半夏6個成分(鳥苷、肌苷、黃嘌呤、酪氨酸、谷氨酸和琥珀酸)作用于AKT1、EPRS、ALDH18A1、GOT2、GAD2等67個靶點,涉及氨基酸代謝與合成、Rap1信號傳導途徑等13條代謝通路。法半夏7個成分(腺苷、甘草酸、甘草次酸、甘草素、甘草皂苷G2、異甘草苷和麻黃堿)作用于GAPDH、ACTB、AKT1、HSP90AA1、TNF等45個靶點,涉及雌激素信號傳導、COVID-19的發生發展等11條代謝通路。姜半夏6個成分(6-姜辣素、腺苷、肌苷、琥珀酸、棕櫚酸、檸檬酸)作用于GAPDH、AKT1、INS、MAPK3、SRC等38個靶點,涉及癌癥的中央碳代謝、炎癥介質對TRP通道的調節等10條代謝通路。

注:A.生半夏;B.法半夏;C.姜半夏

3 討論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術檢測半夏及其炮制品化學成分。網絡藥理學分析選取的生半夏活性成分主要為差異性分析中炮制品里降低的成分;法半夏特有性成分為甘草類,且有研究發現法半夏中未檢測出肌苷[10];姜半夏特有性成分為6-姜辣素,且其有機酸含量最高;且與生半夏比較,炮制品生物堿、多糖含量降低[9]。因此選取這些成分作為活性成分。而清半夏僅用白礬炮制,與生半夏相比,沒有特有成分,靶點分析結果和生半夏相似,因此不將清半夏作為分析對象。

網絡藥理學結果顯示,半夏及其炮制品AKT1基因靶點度值均較高,由TCMIP預測結果可知,AKT1是鳥苷、腺苷的潛在靶點,在KEGG富集結果中參與Rap1信號傳導途徑。Rap1是Ras癌基因家族成員之一,有研究表明,Rap1可以通過ERK/p38信號通路促癌細胞轉移,miR203可以通過下調Rap1的表達從而抑制細胞增殖、黏附和侵襲[11]。抑制AKT1表達可以抑制胃癌細胞遷移及侵襲,抑制肺癌細胞增殖,促進其凋亡[12-14],AKT1在腫瘤發展中發揮重要作用。也有文獻報道,半夏總生物堿有抗腫瘤作用[15],推測核苷類生物堿成分可能通過AKT1調節Rap1信號途徑參與腫瘤發展,抑制腫瘤細胞增殖遷移。

法半夏和生半夏的多變量統計分析結果顯示,法半夏與生半夏的差異性成分主要為甘草中的成分,如甘草素、甘草酸、甘草皂苷G2等,這是因為法半夏是生半夏加入甘草炮制而成,并且由差異倍數FC值均大于2可以看出,甘草的加入對法半夏成分有較大影響。有研究表明,相較于生半夏,法半夏偏于祛寒痰和調和脾胃,多用于痰多咳嗽、痰涎壅盛和治療新型冠狀病毒感染的方劑中[16],法半夏KEGG富集通路結果也顯示,其與新型冠狀病毒感染的發生、發展相關,是與生半夏的差異通路。法半夏中富集該通路的靶點有FOS、IL2、JUN、PIK3CA、RPL11、TLR2、TNF、GNAS、HSP90AA1等,主要為麻黃堿、腺苷、甘草酸的潛在靶點,而甘草酸也是生半夏與法半夏的差異成分。劉寧等[17]分析武漢臨床治療新型冠狀病毒感染驗案,多種方藥中均含有炙麻黃、甘草、法半夏等,臨床療效良好。法半夏佐以甘草,偏祛寒痰,而新型冠狀病毒感染患者早期的基本病證屬于寒濕閉郁脾肺,邪熱內郁,治則當溫散寒濕為主,兼以透熱袪邪[18]。推測法半夏可能通過FOS、IL2、TNF等靶點,發揮抗炎、祛寒痰作用,治療新型冠狀病毒感染。此外,和生半夏相比,法半夏GO富集中生物過程還涉及到腺體發育,其關聯靶點MAPK3、TNF、CASP3、CASP8等為差異成分腺苷、甘草素、甘草次酸、甘草皂苷G2的潛在靶點。呼吸道腺體分泌增加,可以降低痰液黏稠度,易于咳出,從而達到祛痰目的[19]。有研究發現甘草浸膏、甘草次酸能延長引咳潛伏期、減少引咳次數,具有祛痰止咳作用[20],且甘草作為中藥常用輔料,可以和中緩急,調和諸藥。因此,腺苷、甘草中甘草素和甘草次酸等差異物質基礎可能是法半夏與生半夏相比,偏于祛寒痰止咳和胃的物質基礎。此外,腺苷有鎮靜作用[21],文獻報道腺苷有鎮靜作用,可能是法半夏發揮鎮靜作用的物質基礎[16]。

姜半夏、清半夏與生半夏的差異性成分均多為核苷類、黃酮類、氨基酸類等,且由FC<0.5可知,姜制、白礬制后,半夏各成分的含量均有不同程度的下降,其中包括毒性物質鞘氨醇。鞘氨醇屬于鞘脂類成分,是細胞膜組成成分之一。Tao等[22]發現生半夏給藥組與正常組相比,大鼠血清中二氫神經鞘氨醇-1-磷酸(dhS1P)的表達上調。dhS1P是鞘氨醇激酶使鞘氨醇磷酸化的產物,細胞外dhS1P通過JAK/STAT-基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)信號通路增加STAT1、STAT3蛋白的磷酸化水平,促進TGF-β和TIMP1的表達,增加心肌成纖維細胞中的膠原合成,使心肌纖維化[23]。文獻報道生半夏有心臟毒性[17],結合本實驗結果,鞘氨醇等鞘脂類成分可能是生半夏毒性和清半夏炮制減毒的物質基礎之一。有文獻報道,有機酸類成分在姜半夏中含量最高[9],是姜半夏與生半夏的差異成分。且KEGG富集結果顯示,與生半夏相比,姜半夏還與炎癥介質對TRP通道的調節有關,該通道的靶點為差異成分棕櫚酸、檸檬酸等有機酸的潛在靶點CALM1、PIK3CA、PRKACA、SRC等。有研究表明,刺激物經氣道吸入后,經過TRP通道激活可以導致氣道神經源性炎癥而致咳[24]。半夏中有機酸類成分是鎮咳、止嘔的重要活性成分[16],而有機酸類成分在姜半夏中含量最高[9]。因此,有機酸類成分可能是姜半夏相較于生半夏,偏重鎮咳、止嘔的物質基礎之一,并通過CALM1、PIK3CA等靶點調節TRP通道,發揮其止咳作用。和生半夏相比,磷酸腺苷的含量在姜半夏中也顯著升高。磷酸腺苷是產生ATP的中間產物,可以為機體提供能量。差異成分腺苷的潛在靶點MAPK3、GAPDH、GSK3B等富集到的GO富集生物過程也表明其和前體代謝物和能量的產生有關。ATP有改善心肌的代謝作用,可以提高心肌收縮功能,用于治療心動過速、心律失常、心力衰竭等[25]。生半夏有心臟毒性[15],但有研究發現,姜半夏能降低心律失常評分,縮短心律失常持續時間,減輕心肌細胞超微結構損傷[26]。因此,磷酸腺苷可能是姜半夏炮制減毒、保護心臟的物質基礎之一。姜半夏還有降逆止嘔作用,生姜中的6-姜辣素是其活性成分[27]。但與生半夏比較,姜半夏特有性成分揮發油及6-姜辣素未在差異性成分中鑒定出來,可能是因為本實驗采用水提的方法,導致揮發油及姜辣素不易溶,含量較少,在整體成分中體現出的差異性較小,未達到篩選要求。這也在一定程度上反映出炮制對生半夏原有成分影響較大,一方面降低毒性,另一方面緩和藥性,減少副作用。生半夏與姜半夏和清半夏的差異性成分結果相似,主要是因為姜半夏和清半夏炮制方法相似。清半夏是生半夏加白礬而制,長于燥濕化痰,其抗炎作用較生半夏強[16];姜半夏在此基礎上又加入生姜,增加止嘔藥效。

綜上所述,本文建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法能夠較好地分離鑒定半夏及其炮制品中的化學成分,能反映半夏炮制前后的主要差異性物質基礎。并以此為基礎結合網絡藥理學分析差異性功效的作用機制,為半夏及其炮制品臨床合理應用提供數據支持。