煙草NtHPL1基因克隆、表達及功能分析

和 順，馬蘭馨，陳鈺棟，武明珠，徐 馨，李澤鋒，高 茜，楊 軍，黃平俊，王 中*

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001 2.云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明市五華區科醫路41 號 650106 3.湖南中煙工業有限責任公司技術中心，長沙市勞動中路386 號 410007

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）途徑是植物體內脂肪酸氧化的重要途徑［1］，LOX 可催化亞油酸和亞麻酸等脂肪酸形成脂氫過氧化物，這些脂氫過氧化物通常不穩定，能夠被二乙烯基醚合成酶（divinyl ether synthase, DES）、丙二烯氧化物合酶（allene oxide synthase, AOS）、過氧合酶（peroxygenase,POX）和脂氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase,HPL）催化［2］。其中，HPL 是LOX 途徑的關鍵酶，根據催化底物的過氧基位置分為3 個亞族（9-HPL［3］、13-HPL［4］和9/13-HPL［5］），可通過裂解脂氫過氧化物的碳-碳鍵形成揮發性醛和酸［6］。HPL 可參與甜瓜和鷹嘴豆等植物對鹽和干旱脅迫的響應，相關研究已見報道。劉苗苗等［7］發現與未經脅迫處理（對照）的甜瓜幼苗相比，干旱和NaCl 脅迫處理后的幼苗CsHPL基因相對表達量升高，分別為對照的181.02%和162.41%。Domenico 等［8］發現鷹嘴豆根系中的HPL 基因（MtHPL1 和MtHPL2）干旱脅迫處理后相對表達量升高，MtHPL1 基因的相對表達量在處理2 h內上調，在2～72 h 內相對穩定；MtHPL2 的相對表達量隨干旱脅迫處理時間的增加而升高，在72 h 達到最高值。然而，煙草（Nicotiana tabacum L.）HPL參與鹽和干旱脅迫響應的相關研究還鮮見報道。為此，在普通煙草K326 中克隆1 個HPL 基因并命名為NtHPL1，采用生物信息學方法對NtHPL1 蛋白的理化性質、結構域、進化關系等進行系統分析，并采用qPCR 方法分析NtHPL1 基因在煙草不同組織、不同發育時期煙葉、鹽和干旱脅迫處理下旺長期煙葉的相對表達量，創制過表達轉基因植株，驗證NtHPL1基因在煙草抗鹽、抗旱方面的生物學功能，以期為創制抗逆煙草新品系提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試培養基分別為MS 固體培養基（MS 培養基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂粉3 g/L，pH值5.8）、含NaCl（0 mmol/L）的固體培養基（MS培養基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂粉3 g/L，pH 值5.8）、含NaCl（100 mmol/L）的固體培養基（NaCl 5.85 g/L、MS 培養基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂粉3 g/L，pH 值5.8）和含NaCl（200 mmol/L）的固體培養基（NaCl 11.70 g/L、MS 培養基粉4.40 g/L、蔗糖30 g/L、瓊脂粉3 g/L，pH值5.8）。

將普通煙草K326 種子用體積分數為10%的NaClO 消毒后，在MS 固體培養基中于25 ℃恒溫培養，待種子萌發并長出4 片真葉時進行以下處理：①將煙苗移栽至上口徑100 mm、下口徑65 mm、高度85 mm 的花盆中，培養基質為品氏托普園藝(上海)有限公司的營養土和蛭石，營養土與蛭石的體積比為9 ∶1。移栽后的煙苗置于溫室中生長，每天26 ℃光照處理15 h，20 ℃黑暗處理9 h。采集煙草苗期、旺長期、現蕾期、盛花期和成熟期的上部葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于提取煙草基因組DNA（gDNA）和檢測不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量；采集煙草盛花期的根、莖、葉片、花和腋芽，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于檢測煙草不同組織的NtHPL1 基因相對表達量。②選取長勢相同、大小一致的煙苗分別移栽至含NaCl（0、100、200 mmol/L）的3種固體培養基上進行鹽脅迫處理，每個培養基移栽8株煙苗，每種處理重復3 次，7 d 后將煙葉用液氮速凍并保存于-80 ℃冰箱，用于檢測鹽脅迫處理下旺長期煙葉的NtHPL1基因相對表達量。③將煙苗移栽至上口徑120 mm、下口徑80 mm、高度100 mm的花盆中，長至旺長期時，采用停止澆水的方法創造干旱條件，對煙株進行干旱脅迫處理，并取處理0、2、4、6 d 的煙草上部葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于檢測干旱脅迫處理下旺長期煙葉的NtHPL1基因相對表達量。

1.2 煙草基因組DNA提取和RNA提取及反轉錄

使用新型植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取普通煙草K326基因組DNA。使用GenePure 多糖多酚植物RNA 快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）分別提取1.1 節中采集的煙草不同組織、不同發育時期煙葉、鹽和干旱脅迫處理的旺長期煙葉樣品RNA，并使用All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix（with dsDNase）反轉錄試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）將提取的RNA分別反轉錄為cDNA。

1.3 煙草NtHPL1基因克隆

將擬南芥AtHPL 蛋白序列（GenBank ID：9306309）在中國煙草基因組數據庫（http：//218.28.140.17）中進行BLASTP 比對。從比對結果中選擇同源性最高的序列，并使用Primer Premier 5 軟件設計擴增引物NtHPL1-F 和NtHPL1-R（表1），分別以普通煙草K326 的gDNA 和cDNA 為模板進行PCR擴增。反應體系：gDNA（cDNA）模板（100 ng/μL）2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，高保真聚合酶（北京全式金生物技術有限公司）10 μL，ddH2O補足至20 μL。反應程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min，35 個循環；72 ℃保溫7 min。使用凝膠回收試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）回收PCR 產物，并使用DNA 連接酶將回收產物與克隆載體Peasy-T1 相連。將連接產物轉化DH5α大腸桿菌感受態（北京全式金生物科技有限公司）后37 ℃過夜培養，對陽性克隆進行測序驗證。引物合成和測序驗證均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

表1 供試引物序列Tab.1 Tested primer sequence

1.4 生物信息學分析

使用DNAMAN 軟件將擬南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄（Solanum lycopersicum）、辣椒（Capsicum annuum）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）的HPL 蛋白與煙草NtHPL1 蛋白進行氨基酸序列比對。查找其他植物的HPL蛋白序列，使用MEGA 7.0軟件構建NtHPL1 與其他植物HPL 蛋白的系統發育進化樹。煙草NtHPL1蛋白的理化性質用ProtParam在 線 工 具 （https://www.expasy.org/resources/protparam）分析；親疏水性用ProtScale 在線工具（https://www.expasy.org/resources/protscale）分析；跨膜結構特性用TMHMM 在線工具（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預測；二級結構用Sopma在線工具（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）分析。

1.5 煙草NtHPL1基因相對表達量分析

分別以1.2節中獲得的煙草不同組織、不同發育時期煙葉、鹽和干旱脅迫處理的旺長期煙葉樣品cDNA 為模板，采用qPCR 方法檢測煙草NtHPL1 基因的相對表達量。根據NtHPL1基因的CDS序列，使用Primer Premier 5 軟件設計qPCR 引物，命名為qRT-NtHPL1-F 和qRT-NtHPL1-R；內參基因為煙草NtL25 基因（GenBank ID：L18908）［9］，內參引物命名為qRT-NtL25-F 和qRT-NtL25-R，引物序列如表1 所示。qPCR 反應體系：cDNA 模板（100 ng/μL）1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×SYBR Green qPCR Mix（北京艾德萊生物科技有限公司）7.5 μL，ddH2O 補足至15 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，45個循環，混合3個樣品為1個生物學重復，設置3次生物學重復。采用2-ΔΔCT法計算NtHPL1 基因的相對表達量［10］，使用Microsoft Excel軟件對相對表達量進行方差分析，采用LSD法進行數據間的差異顯著性分析。

1.6 過表達遺傳材料創制及抗逆性分析

為分析NtHPL1 基因在煙草抵抗鹽和干旱脅迫過程中的作用，將NtHPL1 基因的CDS 序列連接pCambia 1300 表達載體，構建35S:NtHPL1 過表達載體。將經過測序驗證后的過表達載體轉化普通煙草K326 無菌苗，創制NtHPL1 基因的過表達遺傳材料。采用1.2 節中的方法獲得過表達遺傳材料的cDNA，并通過1.5節中的方法檢測NtHPL1基因相對表達量，鑒定陽性的NtHPL1 過表達轉基因株系，篩選出NtHPL1 基因相對表達量最高的過表達株系（NtHPL1-OE），并收集該株系T2代純合種子。

將過表達煙草（NtHPL1-OE）和野生型煙草（WT）種子培養于MS 固體培養基上，待長至4 片真葉后分別進行鹽和干旱脅迫處理。將NtHPL1-OE和WT的煙苗同時移栽至含NaCl（200 mmol/L）的固體培養基上進行鹽脅迫處理，并以移栽至MS固體培養基上的處理作為對照（CK1）。每個培養基上NtHPL1-OE 和WT 分別移栽8 株，每個處理設置3 次生物學重復。觀察處理7 d 煙苗的生長狀況并拍照記錄；分別取處理0、5、10、15、20 d NtHPL1-OE（3株）和WT（3株）的葉片，檢測葉綠素［11］、脯氨酸和丙二醛（MDA）［12］含量（質量分數）并計算3株含量的平均值。將NtHPL1-OE和WT的種子消毒后分別培養于含NaCl（200 mmol/L）的固體培養基上，重復3次，每個培養基培養30 粒種子，25 ℃培養7 d。分別統計0～7 d 每天累計的發芽數，計算每天的發芽率（發芽率=種子發芽數/測試種子總數×100%）［13］。此外，將NtHPL1-OE 與WT 的煙苗移栽到花盆中，生長至旺長期后各分為4 份，每份NtHPL1-OE 和WT 各3盆，采用1.1節中的方法對4份煙株分別進行0、4、6、10 d 的干旱脅迫處理，以處理0 d 為對照（CK2），觀察不同處理下煙株的生長狀況并拍照記錄；分別取不同處理下NtHPL1-OE（3株）和WT（3株）的上部葉片，檢測可溶性糖［14］、葉綠素、脯氨酸、丙二醛（MDA）含量（質量分數）并計算3株含量的平均值。

2 結果與分析

2.1 煙草NtHPL1基因克隆及序列分析結果

分別以普通煙草K326 的gDNA 和cDNA 為模板進行PCR 擴增，擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1A 所示。測序結果顯示，克隆獲得的NtHPL1 基因全長為4 670 bp，包含2 個外顯子和1個內含子（圖1B），其編碼區全長為1 365 bp，編碼454個氨基酸，命名為NtHPL1。通過比對擬南芥、番茄、辣椒和馬鈴薯的HPL 和煙草NtHPL1 蛋白的氨基酸序列，發現NtHPL1 蛋白屬于細胞色素P450（CytP450）蛋白質家族，具有CytP450 家族典型的A、B、C和D結構域［15］（圖2）。

圖1 NtHPL1基因的瓊脂糖凝膠電泳圖及基因結構Fig.1 Agarose gel electrophoresis and gene structure of NtHPL1 gene

圖2 不同植物HPL蛋白序列對比Fig.2 Sequence alignment of HPL proteins in different plants

使用MEGA 7.0 軟件構建NtHPL1 與其他植物HPL蛋白的系統發育進化樹，結果如圖3所示。煙草NtHPL1 蛋白屬于13-HPL 亞家族，與漸狹葉煙草（Nicotiana attenuata）關系最近，與番茄、馬鈴薯、辣椒、擬南芥、葡萄（Vitis vinifera）HPL蛋白也具有較近的親緣關系。

圖3 不同植物HPL蛋白的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree for HPL proteins in different plants

2.2 NtHPL1蛋白結構分析結果

使用ProtParam在線工具分析NtHPL1蛋白的理化性質，分析結果如表2 所示。NtHPL1 蛋白含454個氨基酸，相對分子量為51.20 kDa，脂肪系數為82.38，理論等電點為6.16，正、負電荷殘基數分別為47和50個，不穩定性系數為34.46。該蛋白的總平均親水性為-0.206（正值為疏水性，負值為親水性）；通過ProtScale 在線工具對該蛋白的親/疏水性進行分析（圖4），發現NtHPL1蛋白的親水區域（親/疏水性得分為負值）多于疏水區域（親/疏水性得分為正值），推測煙草NtHPL1 蛋白屬于親水性蛋白。使用TMHMM在線工具預測NtHPL1蛋白的跨膜區域（圖5），發現該蛋白的454個氨基酸均位于膜外，不存在跨膜區域。

圖4 NtHPL1蛋白的親/疏水性預測結果Fig.4 Hydrophilicity/hydrophobicity prediction results of NtHPL1 protein

表2 NtHPL1蛋白的理化性質分析結果Tab.2 Physicochemical properties analysis results of NtHPL1 protein

NtHPL1蛋白的二級結構主要包含a-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規則卷曲，a-螺旋和無規卷曲分別占38.55%和40.97%（表3）。由圖6 可見二級結構在NtHPL1蛋白中的具體分布。其中，a-螺旋主要分布在蛋白的中間，延伸鏈主要分布在兩端。

圖6 NtHPL1蛋白的二級結構預測結果Fig.6 Secondary structure prediction results of NtHPL1 protein

表3 NtHPL1蛋白二級結構Tab.3 Secondary structure of NtHPL1 protein

2.3 煙草不同組織及不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量

檢測煙草不同組織、不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量，結果如圖7A所示。NtHPL1基因在煙草所有組織中均表達，在花中相對表達量最高，在莖中相對表達量最低。煙草不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量不同（圖7B），盛花期的相對表達量最低，成熟期的相對表達量最高。

圖7 煙草不同組織及不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量Fig.7 Relative expression levels of NtHPL1 gene in different tissues of tobacco and in tobacco leaves at different developmental stages

2.4 干旱和鹽脅迫下旺長期煙葉的NtHPL1基因相對表達量

檢測干旱脅迫處理0、2、4、6 d 旺長期煙葉的NtHPL1 基因相對表達量，結果如圖8A 所示。干旱脅迫處理后煙葉中NtHPL1基因相對表達量升高，處理6 d 的基因相對表達量最高，是處理0 d 基因相對表達量的3.19 倍。為分析鹽脅迫對NtHPL1 基因相對表達量的影響，對普通煙草K326 分別進行0、100和200 mmol/L NaCl 處理（圖8B），發現100 和200 mmol/L NaCl 處理后的煙葉中NtHPL1 基因相對表達量顯著高于0 mmol/L NaCl 處理后的煙葉，分別是0 mmol/L NaCl 處理后煙葉的1.94 倍和2.63 倍?？梢?，NtHPL1基因表達受干旱和鹽脅迫的誘導。

圖8 干旱和鹽脅迫下煙葉的NtHPL1基因相對表達量Fig.8 Relative expression levels of NtHPL1 gene in tobacco leaves under drought and salt stress

2.5 NtHPL1基因過表達煙草的抗鹽和抗旱性

通過轉基因技術獲得NtHPL1過表達株系，采用qPCR方法從中篩選出NtHPL1基因相對表達量最高的植株（NtHPL1-OE）（圖9）。NtHPL1-OE 株系的NtHPL1 基因相對表達量顯著高于K326，是K326 NtHPL1基因相對表達量的22.46倍。

圖9 NtHPL1轉基因煙草的鑒定Fig.9 Identification of NtHPL1 transgenic tobacco

觀察NaCl 和CK1 處理下NtHPL1-OE 和WT 的生長狀況（圖10），發現CK1處理的NtHPL1-OE和WT的生長狀況無明顯差異；NaCl 處理的NtHPL1-OE 能夠正常生長，而WT 葉片發黃萎蔫、根莖矮小，表明過表達NtHPL1 基因能夠增強煙草對鹽脅迫的抗性。檢測鹽脅迫處理下NtHPL1-OE和WT的種子發芽率及煙葉中的葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量，結果如圖11 所示。將種子培養于含NaCl 的固體培養基上，培養7 d 后NtHPL1-OE 的種子發芽率為78.75%，WT 的種子發芽率為66.67%；NaCl 處理0～20 d NtHPL1-OE的葉綠素含量高于WT，且處理15 d NtHPL1-OE的葉綠素含量最高，是處理15 dWT葉綠素含量的6.31 倍；NaCl 處理下NtHPL1-OE 的脯氨酸含量逐漸升高，處理20 d NtHPL1-OE 的脯氨酸含量是處理20 d WT脯氨酸含量的2.41倍；NaCl處理0～20 d NtHPL1-OE 的丙二醛含量均低于WT。以上結果表明，過表達NtHPL1基因能夠提高鹽脅迫處理下煙草種子的發芽率，調控煙葉中的葉綠素、脯氨酸和丙二醛含量，增強煙草對鹽脅迫的抗性。

圖10 鹽脅迫下NtHPL1過表達煙草的生長情況Fig.10 Growth of NtHPL1-overexpressed tobacco under salt stress

圖11 鹽脅迫對煙草發芽率及煙葉葉綠素、脯氨酸、丙二醛含量的影響Fig.11 Effects of salt stress on germination rate of tobacco and contents of chlorophyll, proline and malondialdehyde in tobacco leaves

觀察干旱脅迫處理下NtHPL1-OE 和WT 的生長狀況（圖12），發現處理4和6 d的NtHPL1-OE生長正常，與CK2 相比無明顯差異，而WT 葉片萎蔫，生長被抑制；處理10 d 的WT 和NtHPL1-OE 均有植株矮小、葉片發黃的癥狀，但NtHPL1-OE比WT的葉片更大，葉片數量更多。檢測干旱脅迫處理下NtHPL1-OE 和WT 葉片中的可溶性糖、葉綠素、脯氨酸和丙二醛含量，結果如圖13 所示。干旱處理0～10 d NtHPL1-OE 的可溶性糖含量和葉綠素含量均高于WT。相比處理0 d，處理10 d NtHPL1-OE 的可溶性糖含量降低46.98%，而WT 的可溶性糖含量降低31.81%；處理10 d WT的葉綠素含量降低38.06%，而NtHPL1-OE的葉綠素含量升高4.51%；處理10 d WT和NtHPL1-OE的脯氨酸含量分別增加1.79倍和3.39倍；處理0～10 dNtHPL1-OE的丙二醛含量均低于WT。以上結果表明，NtHPL1-OE受干旱脅迫的影響低于WT，NtHPL1-OE過表達煙草抵御干旱脅迫的能力更強。

圖12 干旱脅迫下NtHPL1過表達煙草生長情況Fig.12 Growth of NtHPL1-overexpressed tobacco under drought stress

圖13 干旱脅迫對煙葉可溶性糖、葉綠素、脯氨酸及丙二醛含量的影響Fig.13 Effects of drought stress on contents of soluble sugar, chlorophyll, proline, and malondialdehyde in tobacco leaves

3 討論

本研究中發現煙草NtHPL1 蛋白與同為茄科植物的馬鈴薯、番茄和擬南芥親緣關系最近。由于馬鈴薯［16］、番茄［17］和擬南芥的HPL 蛋白均被定位于葉綠體中［18-20］，推測煙草NtHPL1蛋白可能也位于葉綠體中，但仍需進一步驗證。本研究中發現鹽和干旱脅迫處理下煙葉的NtHPL1基因相對表達量升高，表明NtHPL1基因可能參與煙草抗逆過程，這與對葡萄VvHPL1 基因的研究結果［21］相似。在鹽和干旱脅迫下，NtHPL1過表達煙草葉片的脯氨酸含量比野生型煙草高，丙二醛含量比野生型煙草低，說明NtHPL1過表達煙草的細胞損害程度更小，抗鹽性和抗旱性更強，這與Lim 等［22］的研究結果一致。NtHPL1基因是否響應除鹽和干旱以外的其他非生物脅迫仍需進一步研究。

4 結論

在普通煙草K326 中同源克隆NtHPL1 基因，該基因編碼含454 個氨基酸的蛋白。蛋白結構和發育進化分析結果表明煙草NtHPL1 蛋白屬于13-HPL 家族。在煙草根、莖、葉片、花和腋芽中均檢測到NtHPL1 基因的表達，在花中NtHPL1 基因相對表達量最高；煙草不同發育時期煙葉的NtHPL1基因相對表達量不同，盛花期最低，成熟期最高；鹽和干旱脅迫均能誘導NtHPL1 基因表達，表明該基因可能參與煙草的抗鹽、抗旱過程。創制NtHPL1-OE 過表達遺傳材料，對野生型煙草和NtHPL1 過表達煙草同時進行鹽和干旱脅迫處理，發現處理后的NtHPL1 過表達煙草能夠正常生長，而野生型煙草葉片發黃萎蔫；與野生型煙草相比，處理后的NtHPL1 過表達煙草葉片中的葉綠素和脯氨酸含量更高，丙二醛含量更低，具有更強的鹽和干旱脅迫耐受性，表明過表達NtHPL1 基因可提高煙草的抗鹽性和抗旱性。