復合菌劑的構建及其在沼液廢水處理中的應用＊

李國光 郜晉楠 任靜 楊麗華 韓文彪

（1.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特 010018；2.中國科學院生態環境研究中心，鄂爾多斯固體廢棄物資源化工程技術研究所，內蒙古鄂爾多斯 017000）

0 引言

利用沼氣工程處理城市日益增長的有機廢棄物是一種行之有效的途徑［1］，但是沼氣工程也會產生大量的沼液副產物。據統計，我國沼氣工程每年產生的沼液數量達8 ～10 億t［2］。城市有機廢棄物厭氧發酵后的沼液因其濁度、色度、鹽度較大，有機物、重金屬、氮和磷等污染物含量較高，通常被視為高濃度污水［3］，必須經過合適的處理才能用作農肥或者達標排放。

生物處理方法是一種有效降低沼液中污染物質的方法之一。通過人工選育和基因重組等生物技術手段，得到一種或多種以目標污染物為營養源的高效微生物菌種，經擴大培養后吸附在載體上，投加至沼液處理系統中，從而降低其中大量的有機物，同時還能降低內部重金屬、氮和磷等污染物，使沼液成為液態肥合理利用［4］。在實際應用中，單一菌株對沼液中污染物的去除效果有限，而將多種目標微生物單獨培養后，再按一定比例進行復配，制備成復合微生物菌劑，對沼液中目標污染物可取得最佳的處理效果［5］。

本實驗研究了污水處理中常見的7 株功能微生物對城市有機廢棄物厭氧發酵沼液廢水處理效果，并將其中4 株處理效果較好的單一菌株構建為復合菌劑用于處理沼液，同時考察了高效降解菌在硅藻土、麩皮、玉米粉、秸稈粉等復合載體上的生物活性，為處理沼液廢水高效復合菌劑的開發和應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 沼液來源

供試沼液取自鄂爾多斯市沙圪堵鎮沼氣示范工程項目現場，該廠沼液發酵原料為城市生活垃圾、畜禽糞便和餐廚垃圾。沼液經充分腐熟、靜置沉降后，取上清液并進行過濾備用。所得沼液的理化性質見表1，因原始沼液污染物濃度太高，影響菌種活性和測定結果，故將原始沼液稀釋5 倍后進行后續試驗。

表1 原始沼液理化性質 單位：mg/L（pH 值除外）

1.2 供試菌種

本試驗所用7 株具有降解水體中污染物能力的功能菌分別為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus Meyer and Gottheil）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、裂解亞氯酸假單胞菌（Pseudomonas chloritidismutans）、產氣克雷伯氏菌（Klebsiella aerogenes）、華仙腸桿菌（Enterobacter huaxiensis）、帚石南棒桿菌（Corynebacterium callunae）和副球菌（Paracoccus denitrifications），這些菌種均從自然界中通過富集培養、分離純化得到，并保藏于內蒙古農業大學微生物與發酵工程實驗室。在前期預試驗中已測得各菌種在LB 培養基中生長曲線，并以沼液COD為去除率為目標，確定了各菌種最適接種量，為后期菌劑復配比例提供依據。7 株菌種生物學特性見表2。

表2 菌種生物學特性

1.3 載體來源

本試驗所使用的載體為玉米秸稈粉、玉米粉、麩皮及硅藻土，其中硅藻土為市售，其他3 種取自周邊農戶，經粉碎后過20 目篩備用。

1.4 試驗方法

1.4.1 單一菌株處理沼液廢水試驗

利用LB 液體培養基將上述7 株菌培養至對數生長期，將各菌的培養液以最適接種量（見表2）分別接入100 mL已滅菌的沼液中，然后將搖瓶置于30 ℃、150 r/min 的搖床中振蕩培養7 d。培養結束后，將各處理沼液以8 000 r/min 離心10 min，取上清液并檢測其中氨氮、COD、總磷濃度，并計算其去除率。每個處理設置3 個平行，并以不接菌的滅菌沼液為空白對照。

1.4.2 復合菌的構建及處理沼液廢水試驗

將1.4.1 節試驗效果較好的短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產氣克雷伯氏菌4株菌進行平板對峙培養試驗，確定彼此沒有拮抗作用后，分別在LB 液體培養基上培養至對數生長期，然后按照其最適接種量比例進行復配，制得由4 種菌株組成的復合菌液，將復合菌液以2%的接種量接入100 mL滅菌沼液中，以相同體積的無菌水代替復合菌液接入沼液作為對照，然后將搖瓶置于30 ℃、150 r/min 的搖床中振蕩培養7 d，離心處理后，取上清液檢測其中氨氮、COD、總磷濃度，并計算其去除率。

1.4.3 復合菌吸附載體選擇試驗

采用玉米秸稈粉、玉米粉、麩皮及硅藻土作為復合菌劑吸附載體，將前3 種載體進行等比例隨機復配，設置玉米秸稈粉+玉米粉、玉米秸稈粉+麩皮、玉米粉+麩皮、玉米秸稈粉+玉米粉+麩皮4 個處理，每個處理總重為1 kg。為防止復合載體結塊，在每個處理中加入300 g的硅藻土作為分散吸附劑，同時加入20 g發酵引物紅糖，均勻攪拌后，用無菌水將各處理組的濕度調節到50%左右后進行高溫滅菌，然后分別接入200 mL 復合菌液，在30 ℃下恒溫保濕培養7 d后，置于35℃恒溫烘箱中，進行鼓風干燥處理，制得固體復合菌劑。分別取10 g 樣品并加入100 mL無菌水，在150 r/min 下振蕩2 h 后，用稀釋平板計數法，測定各處理的活菌數。

1.5 主要分析項目和計算方法

采用重鉻酸鉀法測定COD［6］，納氏試劑分光光度法測定氨氮（GB 7479—1987），鉬酸銨分光光度法測定總磷（GB 11893—1989），血球計數法測定復合菌劑中有效活菌數。

氨氮、COD、總磷去除率Q的計算公式如下：

式中，Q為去除率，%；X為原始沼液的氨氮、COD 或總磷含量，mg/L；Y為處理后沼液氨氮、COD 或總磷含量，mg/L。

2 結果與分析

2.1 氨氮去除效果與分析

圖1 為7 株菌在各自最適接種量下對城市有機廢棄物厭氧發酵沼液廢水中氨氮的處理效果。從圖中可知，7 株菌種都具有降解沼液中氨氮的能力，除了副球菌外，其他各菌株去除率均在60%以上。其中對沼液氨氮去除率最高的是裂解亞氯酸假單胞菌，去除率可達85.1%，其次是產氣克雷伯氏菌、短小芽孢桿菌和帚石南棒桿菌，三者對沼液氨氮的去除率相差不大，分別為78.7%、77.1%和72.0%。對沼液氨氮去除率最低的是副球菌，僅有54.0%。

圖1 不同菌株對沼液氨氮去除率

假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和副球菌屬中的多株細菌已經被證實有較好的去除污水中氨氮的能力，如尹紅梅等［7］在養豬場篩選到的地衣芽孢桿菌，對養豬廢水氨氮的去除率可達80.0%以上；楊繼偉等［8］在污泥中篩選的假單胞菌，對人工模擬污水中氨氮的去除率可達84.7%，這與本試驗研究的沼液中氨氮去除率結果相近；劉勝格［9］從城市排污口淤泥中分離的副球菌對廢水中的氨氮去除率達70.0%以上，而本試驗中副球菌對沼液中氨氮的去除率僅有54.0%，這可能是沼液復雜的成分組成對副球菌的生長代謝造成了一定的影響?？死撞暇鷮僭趶U水脫氮的應用也有報道，趙迪［10］從硝基苯污水處理池中篩選分離得到一株具有高效降解硝態氮的克雷伯氏菌，而本試驗所用產氣克雷伯氏菌對氨氮也具有較高去除率，說明該菌既可降解硝態氮，又可降解氨態氮。

2.2 COD 去除效果與分析

城市有機廢棄物厭氧發酵沼液廢水中的COD值較大，處理較困難，本試驗所用的7 株菌對其均有較好的去除效果，如圖2 所示，7 株菌對沼液中COD的去除率相差不大，均在65.0%以上，其中去除率最高的是帚石南棒桿菌，去除率可達82.7%。短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、副球菌和華仙腸桿菌也有較高的去除率，均在70.0%以上。解淀粉芽孢桿菌對沼液中COD 的去除率相對較低，只有66.3%。

圖2 不同菌株對沼液COD 去除率

芽孢桿菌屬中的許多菌株具有降解廢水中COD的能力，惠治兵等［11］從馬鈴薯淀粉廢水中分離出一株解淀粉芽孢桿菌，對COD 的去除率達71.7%；伍華雯等［12］利用固體化菌種枯草芽孢桿菌和彎曲芽孢桿菌處理養殖廢水，廢水中的COD 去除率也非常明顯。本試驗使用的解淀粉芽孢桿菌同樣具有去除沼液中COD 的效果，只是處理效果不及惠治兵等人分離的菌株，這也說明不同來源的同種菌株對不同處理對象可能存在著效果差異。

2.3 總磷去除效果與分析

總磷去除效果如圖3 所示。從圖中可看出，供試7 株菌對城市有機廢棄物厭氧發酵沼液廢水中總磷的去除效果不及氨氮和COD，各菌去除率均不高。除了產氣克雷伯氏菌達到30.5%之外，其余各菌均在30.0%以下。這可能與微生物脫氮和除磷機制相關，生物除磷法主要是聚磷微生物在交替的厭氧和好氧條件下，吸收系統中的PO43-并形成含poly-P污泥，從而通過排放含poly-P 富磷污泥將磷從污水中去除；而生物脫氮主要包括硝化反硝化、厭氧氨氧化、異養硝化-好氧反硝化等作用將氮素進行轉化利用。在微生物脫氮除磷系統中，可能積累了過量的NO2-，從而抑制了各菌缺氧吸磷的過程，這可能是氨氮去除效果優于總磷的原因之一。裂解亞氯酸假單胞菌和帚石南棒桿菌對沼液總磷的去除率僅次于產氣克雷伯氏菌，為28.5%和24.5%，去除率最低的是副球菌，僅有15.4%。

圖3 不同菌種對沼液總磷去除率

在污水系統中，除磷菌降解性能除了與自身特性有關外，也與所處環境有著密切關系。城市有機廢棄物厭氧發酵后的沼液中，濁度、色度、鹽度較大，懸浮物、重金屬等污染物含量較高，這些物質成分較為復雜，可能影響了各菌種對總磷的去除效果［13］。有研究表明，將多種特定功能的單一菌種進行復配，構建為復合菌劑，能夠極大地提升廢水中污染物的去除率，這為沼液中總磷的高效去除提供了研究思路。

2.4 復合菌去除效果分析

從以上試驗結果發現，短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產氣克雷伯氏菌對沼液中污染物去除效果較好，故將這4 株菌按照最適接種量進行復配，并構建為復合菌，考察其對沼液廢水的處理效果，結果見圖4。圖中表明，復合菌對沼液中3 種污染物的去除效果與單一菌相比均有提升，氨氮的去除率達87.5%，較單一菌最高值增加了2.4%，COD去除率達86.4%，較單一菌最高值增加了3.7%，二者提升幅度較小。但是總磷的去除率有較大提升，去除率達63.2%，較單一菌最高值增加了32.7%，充分發揮了菌群互作的優勢。

圖4 復合菌對沼液廢水處理效果

之所以有這樣的結果可能原因是4 株菌之間產生了某種協同作用，從而促進了某些功能基因的表達，但具體機制有待確定［5］。王亞軍等［14］就將一株克雷伯氏菌與一株銅綠假單胞菌進行復配，發現二者能協同增強除磷，在最適比例下，生活污水中總磷降解率能達到99.4%。樊婷婷等［15］將惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、地衣芽孢桿菌和土生克雷伯氏菌組成的復合菌劑用于處理河道污水，對總氮、氨氮、總磷、COD 有最高的去除率，分別達到78.3%、82.8%、86.6%、83.9%，極大地發揮了復合菌的功能優勢。

復合微生物菌劑在廢水處理實際應用中也存在一些問題，如各菌種間的相互作用不都為協同作用，也可能存在拮抗作用；菌種在不同吸附載體上，因生長速率不同可能會造成混合菌群各菌種比例失調，從而影響菌劑應用效果。因此，需要進一步研究復合微生物菌劑在不同載體上的生長情況，優化其培養條件。

2.5 復合菌劑載體選擇及活菌數分析

從實際應用角度考慮，復合菌劑中有效活菌數越多，高效降解菌種類越多，該菌劑處理效果會越好，而吸附載體是菌劑構建能否成功的關鍵。良好的吸附載體不僅能吸附污水中的污染物，其表面的微孔更有利于微生物的附著，同時也可以為微生物提供豐富的食物來源和適宜的生長環境，從而將載體的吸附和生物降解2 個過程充分耦合起來，具有極強的污水處理累加效應［16］。因此本試驗選擇了秸稈粉、玉米粉、麩皮等常用的生物質吸附載體對復合菌劑中微生物的生物活性進行了研究。不同載體構建的菌劑中有效活菌數見表3?？梢钥闯?，秸稈粉+玉米粉+硅藻土的載體組合有效活菌數最高，達到了2.91×108CFU/g，說明復合菌在該載體上吸附量更高，生長繁殖更好；最低的是秸稈粉+麩皮+硅藻土組合，僅有4.8×107CFU/g，可能是該載體組合的營養成分不足，不能滿足復合菌株的正常生長，從而使菌劑中活菌數降低。

表3 不同載體菌劑中有效活菌數

單一載體對菌劑中生物活性的保護有限，而將多種友好型載體以一定比例進行復合，可提高復合菌劑穩定性和有效活菌數。而在載體的選擇上，最常用的就是植物源載體與非金屬礦物質載體進行復配組合。馬曉亮［17］將玉米粉、蠶蛹粉、鋸末、麥麩、硅藻土等5 種載體進行復合制作固化菌劑，發現5 種載體以不同的比例進行復合時，可使菌劑中有效活菌數最大。本試驗中使用的植物源載體秸稈粉、玉米粉和非金屬礦物質載體硅藻土組合同樣具有最高生物活性。

圖5 是試驗制備的不同載體構建的復合菌劑，可以看出不同載體組合構建的復合菌劑粒徑不同，顏色各異，總體為土黃色粉末狀固體，具有發酵物特有的氣味，使用時只需直接投加，且便于保藏和運輸，大大提高了應用范圍。

圖5 不同載體組合構建的復合菌劑

3 結論

通過單菌對比及復合菌劑構建試驗發現，生物處理法對城市有機廢棄物厭氧發酵沼液降解效果明顯，試驗表明：

（1）7 株菌種都具備降解沼液中氨氮、COD和總磷的能力，其中氨氮去除率最高的是裂解亞氯酸假單胞菌和產氣克雷伯氏菌，去除率分別達85.1%和78.7%；COD 去除率最高的是帚石南棒桿菌和短小芽孢桿菌，去除率可達82.7%和76.1%；總磷去除率相對最高的是產氣克雷伯氏菌，去除率達到30.5%，而其余均在30%以下。

（2）將短小芽孢桿菌、裂解亞氯酸假單胞菌、帚石南棒桿菌和產氣克雷伯氏菌按照最適接種量進行復配構建為復合菌后，對沼液中氨氮的去除率達87.5%，COD 去除率達86.4%，總磷的去除率達63.2%，3 種物質的去除率較單一菌最高值均有提升，但是總磷去除率效果最好，充分發揮了菌群互作的優勢。

（3）秸稈粉+玉米粉+硅藻土更適合做吸附載體，復合菌在該載體上吸附量更大，生長繁殖更好，有效活菌數最高，達到了2.91×108CFU/g，為復合菌劑的應用提供理論基礎。