陶瓷超濾膜在5-羥基-L-色氨酸發酵產物提取中的應用

張怡君,田俊波,楊志彬,郝晉博,胡江林,呂志堂

(1.河北大學 生命科學學院,河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室,河北 保定 071002 2.河北維達康生物科技有限公司 技術研發中心,河北 保定 072152;3.保定保利瑞合生物科技有限公司 技術研發中心,河北 保定 072152)

5-羥基-L-色氨酸(5-hydroxy-L-tryptophan, 5-HTP)是神經遞質5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)的直接生物合成前體,并繼而作為褪黑素(melatonin)合成的前體物質,5-HTP及其衍生物已被證明對抑郁癥、失眠、慢性頭痛和肥胖等多種疾病的治療有效[1-3],并可以減少癲癇發作引起的呼吸驟停[4],具有調節腸道免疫功能[5]、提高免疫力和細胞抗氧化能力以及預防和治療癌癥等保健功能[6-7].長期以來,5-HTP依賴以非洲加納籽(Griffoniasimplifolia)為原料通過植物提取法生產[8].近年來,由于生物技術特別是合成生物學的飛速發展,微生物發酵合成5-HTP的技術也取得了極大的進步,并率先由保定保利瑞合生物科技有限公司實現產業化[9-11].該方法具有原料成本低、來源廣泛、產品純度高、反應條件溫和等優點,易于工業化生產,已經占居超過70%全球市場份額.但是,微生物發酵液中往往存在著大量的菌體、雜蛋白和膠體顆粒等物質,這些物質的存在使產物收率和結晶質量下降,必須在結晶前將其去除.現有技術工藝是先將發酵液進行絮凝和壓濾去除菌體,然后通過離子交換后再進行活性炭脫色,進而通過蒸發、結晶獲得產品.在此過程中由于離子交換法使用大量的堿液進行洗脫,致使廢水中有大量鹽的產生,處理不當易造成嚴重的環境污染.因此,亟需研究開發出一條從發酵液中提取純化5-HTP的環保工藝,應用于大規模生產中.

膜分離技術因其無相變、高效率、低能耗和無二次污染等特點,已得到廣泛應用,在發酵產物分離提取中既可以用于菌液分離,又可以去除蛋白質,兼具分離、濃縮、精制等作用[12-14].由于5-HTP發酵液中主要含有菌體發酵產生的胞外多糖和蛋白質及培養基中未利用的蛋白質等大分子物質,選擇合適的超濾膜可以選擇性將其去除而保留小分子的5-HTP.近年來,無機陶瓷超濾膜已經廣泛應用于有機酸、氨基酸、醇類和抗生素等發酵產品生產[14-18],與傳統過濾分離技術相比,無機陶瓷超濾膜具有化學穩定性佳、耐強酸堿、耐有機溶劑、抗污染性好、機械強度高、孔徑分布窄、分離精度高和膜易清洗等特點,正在逐漸取代傳統的聚醚砜(polyethersulfone, PES)超濾膜[15-17].本文選擇陶瓷超濾膜應用于從發酵液中提取5-HTP的工藝,篩選出孔徑最適合的陶瓷超濾膜,對此膜的過濾條件進行了實驗,優化出最佳工藝條件,為陶瓷超濾膜應用于5-HTP的工業化生產提供了可靠依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用發酵液(保定保利瑞合生物科技有限公司),系大腸桿菌(Escherichiacoli)工程菌GHTP以葡萄糖為原料發酵得到.

錯流膜過濾系統(CLMB-6-2S型,紹興海納膜技術有限公司),采用 4、10、20 nm ZrO219通道內壓管式陶瓷超濾膜(合肥世杰膜工程有限責任公司),管膜外徑30 mm,通道內徑4 mm,管長1 016 mm,膜面積 0.24 m2;高效液相色譜儀(Agilent LC1200,美國安捷倫公司),可變波長紫外檢測器(G1314B/C);超純水系統 (Milli-Q,美國密理博);電子分析天平(Sartorius BL4100,德國 Sartorius).

5-HTP對照品(Sigma 公司);甲醇(色譜純);其他試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

1.2.1 單因素實驗條件

為建立適合發酵液中5-HTP分離提取的陶瓷超濾膜工藝,對4個指標進行單因素實驗,分別為陶瓷超濾膜孔徑(4、10、20 nm),發酵液預調pH 值(3.0、3.5、4.0),過膜料液溫度(25、35、45 ℃), 跨膜壓差(0.5、0.75、1.0 MPa).綜合考慮放大生產后公司實際產能及發酵提取周期需求,以連續3 h膜通量(permeate flux,F)、5-HTP透過率(permeate ratio,P)和對游離蛋白質截留率(rejection ratio,R) 的平均值為考察指標,確定各因素的最優條件.

各考察指標計算公式為

1)膜通量

F=V/(S·t),

其中:V為陶瓷超濾膜透過液體積(L),t為收集陶瓷超濾膜透過液所需時間(min),S為陶瓷超濾膜膜面積(m2).

2)5-HTP透過率

P=(c1×V1)/(c2×V2)×100%,

其中:c1為超濾膜透過液 5-HTP濃度,V1為超濾膜透過液體積,c2為發酵液5-HTP濃度,V2為發酵液體積.

3)對游離蛋白質截留率

R= (V2×c3-V1×c4)/(V2×c3)×100%,

其中:c3為發酵液中游離的蛋白質含量,c4為超濾膜透過液中游離的蛋白質含量.

1.2.2 檢測方法

取經滅活處理后的5-HTP發酵液并調節pH值,通過循環泵進入錯流膜過濾系統進行過濾,得到超濾清液;HPLC檢測5-HTP和色氨酸的含量(圖1).檢測條件:色譜柱為Hypersil ODS C18 250 mm×4.6 mm ID,5 μm(Thermo Fisher);檢測器為UV檢測器;流動相為體積比92∶8的質量分數1.0% (pH 3.00±0.04) 磷酸二氫鉀與甲醇混合液;流速為1.0 mL/min;檢測波長為275 nm;進樣量為10 μL;柱溫箱溫度為35 ℃;運行時間為20 min.

圖1 5-HTP和色氨酸對照品HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of reference substarce 5-HTP and tryptophan

采用Bradford 法[19]以標準牛血清白蛋白(百克賽斯生物科技有限公司)繪制標準曲線測定游離蛋白質含量.

2 結果與分析

2.1 超濾膜最優孔徑的優選

根據不同孔徑超濾膜與截留分子質量(molecular weight cut-off, MWCO)對應關系[20],要想使分子直徑5 nm的蛋白質截留率大于90%,超濾膜最大孔徑約為10 nm;另根據蛋白質分子半徑(stokes-einstein radius)與分子質量關系r=8.8M1/3nm[21],分子質量10 ku的蛋白質的分子直徑約4 nm,而本研究底盤細胞大腸桿菌蛋白質分子質量多數大于10 ku[22].考慮到調節發酵液pH值后蛋白質可能出現的變性聚集等效應,本研究選擇4、10、20 nm 3種孔徑的陶瓷超濾膜,將發酵液調為pH3.5、進膜壓力設為0.75 MPa,進料溫度設為35 ℃的條件下進行超濾,考察3種膜的膜通量(F)、5-HTP透過率(P)和對游離蛋白質截留率(R),結果見圖2.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.陶瓷膜孔徑對F的影響;B.陶瓷膜孔徑對P的影響;C.陶瓷膜孔徑對R的影響

從圖2可看出,4、10、20 nm孔徑濾膜的膜通量分別為65.21、86.28、89.62 L/(m2·h),對5-HTP的透過率分別為62.21%、92.25%和95.69%,超濾膜的孔徑對過濾時的膜通量、5-HTP的透過率有極顯著影響(P<0.01),孔徑大的膜通量和5-HTP透過率也更大,但對游離蛋白質截留率隨濾膜孔徑增大而顯著降低(P<0.01),4、10、20 nm孔徑濾膜對游離蛋白的截留率分別為96.51%、90.25%和74.62%.20 nm孔徑濾膜對游離蛋白截留率達不到后續5-HTP結晶要求,而4 nm孔徑濾膜的膜通量太低,超濾處理周期長、能耗高.綜合膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質截留率3個指標進行考察,故選擇超濾膜的孔徑為10 nm 更為合適.

2.2 發酵液pH值對膜分離效果的影響

pH會影響到發酵液中5-HTP和蛋白質的溶解性.由于5-HTP在酸性條件下穩定,且在生產中酸性條件下不容易污染雜菌[23],而堿性條件下5-HTP易氧化變質,不利于產品質量控制,故只考察酸性條件下對5-HTP膜分離效果的影響.超濾前分別將發酵液調至pH 3.0、3.5、4.0,在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、跨膜壓差0.75 MPa和過膜料液溫度35 ℃的條件下進行超濾,考察膜的膜通量、超濾后 5-HTP透過率和對游離蛋白質截留率,結果見圖3.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.發酵液pH值對F的影響;B.發酵液pH值對P的影響;C.發酵液pH值對R的影響

由圖3可看出,發酵液調不同pH值時對膜的通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質截留率影響極大(P<0.01).實驗條件下(pH 3.0～4.0),隨發酵液預調pH值升高陶瓷膜的通量增大,但對游離蛋白質截留率的影響則隨pH升高而降低.孔徑10 nm的陶瓷膜對5-HTP的透過率在pH3.5時(92.35%)遠遠高于pH3.0(63.21%)和pH4.0時(84.12%)(P<0.01),雖然pH3.5時膜通量較pH4.0時低(86.58% vs. 88.79%),對蛋白質截留率也較pH3.0時低(90.36% vs. 90.89%),但2項指標也均達到了一般膜分離時技術指標要求,為盡可能保證5-HTP提取收率,綜合膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質截留率3個指標進行考察,故選擇調發酵液的 pH3.5更為合適.

2.3 跨膜壓差對膜分離效果的影響

綜合考慮本次實驗所用陶瓷超濾膜設備和管道連續工作承受最高壓力1.0 MPa,為提高膜通量,選擇0.5、0.75和1.0 MPa 3種跨膜壓差(transmembrane pressure, TMP),在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、pH3.5和過膜料液溫度35 ℃的條件下進行超濾,考察膜的膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質截留率,結果見圖4.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.跨膜壓差對F的影響;B.跨膜壓差對P的影響;C.跨膜壓差對R的影響

由圖4可知,實驗條件下跨膜壓差對膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質截留率影響極大(P<0.01).跨膜壓差是超濾膜過濾過程的動力,對膜通量具有重要影響.跨膜壓差過小會使發酵液的流速慢,在膜表面容易積累,超濾過程中受到傳質控制,導致膜通量下降.跨膜壓差過大會使5-HTP(或蛋白質)等溶質被迅速地壓實在膜面上,在膜表面形成極化層,超濾過程中也受到傳質控制,從而導致膜通量下降.無論使用PES超濾膜還是陶瓷超濾膜,大多數文獻中都采用了較低(0.5 MPa以下)的跨膜壓差進行超濾分離[14-16],而本研究發現在較高的跨膜壓差0.75 MPa時不僅可以極大地提高膜通量(0.75 MPa時86.38 L/(m2·h) vs. 0.5 MPa時65.99 L/(m2·h)),而且可以極大地提高5-HTP的通過率(0.75 MPa時92.15% vs. 0.5 MPa時63.21%),但對可溶蛋白質截留率(90.45%)依然滿足工藝要求,因此為使錯流膜過濾系統在較高的通量下運行,綜合膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質截留率 3個指標進行考察,選擇發酵液過膜壓力0.75 MPa更為合適.

2.4 料液過膜溫度對膜分離效果的影響

借鑒傳統PES超濾膜的經驗[22]及保定保利瑞合生物科技有限公司以往生產經驗,選擇3種溫度(25、35、45 ℃)的發酵液,在陶瓷超濾膜孔徑10 nm、跨膜壓差0.75 MPa和pH3.5 的條件下進行超濾,考察膜的膜通量、5-HTP透過率和對游離蛋白質截留率,結果見圖5.

a、b、c表示不同處理在0.01水平顯著差異A.料液過膜溫度對F的影響;B.料液過膜溫度對P的影響;C.料液過膜溫度對R的影響

傳統PES超濾膜通量隨溫度的增加而增加,但當溫度達到 35 ℃以后,膜通量增幅變弱[24],因此料液過膜溫度選用35 ℃.雖然45 ℃時陶瓷超濾膜通量較35 ℃時要高(88.79 L/(m2·h) vs. 85.98 L/(m2·h),P<0.01),但45 ℃時5-HTP透過率(81.14% vs. 92.38%)及對可溶蛋白質截留率(73.27% vs. 89.25%)下降更為顯著.綜合膜通量、5-HTP的透過率和對游離蛋白質截留率3個指標進行考察,故選擇發酵液過膜溫度35 ℃更為合適.

3 討論與結論

綜上所述,本研究建立了適于從發酵液中工業化提取5-HTP的陶瓷膜超濾分離工藝條件,將大腸桿菌工程菌GHTP發酵液酸化調 pH 值3.5,采用10 nm孔徑的陶瓷超濾膜,跨膜壓差0.75 MPa、料液過膜溫度35 ℃條件下5-HTP的透過率在92%以上,對游離蛋白質截留率達 90%以上,完全滿足工業化生產要求,且較傳統工藝更加節能、環保.