HPLC-MS法同時測定大鼠血漿中那格列奈及其主要代謝物M1

卞樂樂 潘靜 鄭永克

那格列奈（Nateglinide），化學名N-（反-4-異丙基環己基羰基）-D-苯丙氨酸，是一種高效降糖藥，2001 年被FDA 批準單獨或與二甲雙胍合用治療2 型糖尿?。?］。該藥可以阻滯胰島細胞ATP 敏感鉀通道，引起細胞膜去極化，從而促進胰島素釋放。餐前服用可快速起效且作用時間短，可有效控制餐時血糖水平，低血糖發生率低［2］。日本學者已在動物尿液和膽汁中分離并鑒定出那格列奈的12 種代謝產物［2-3］，其主要代謝物為N-［反-4-（1-羥基-1-甲基乙基）-環己基羰基］-D-苯丙氨酸，簡稱M1，占全部代謝物的62%～66%，其活性為那格列奈的1/5［4］?；诖?，單一測定那格列奈的藥時曲線無法完全反映該藥物在體內的藥代與藥效過程。因此，尋找合適的方法測定那格列奈及其主要代謝物M1的血藥濃度是臨床前及臨床研究必不可少的重要技術手段。本實驗擬建立一種簡單、快速、靈敏度高的HPLC-MS 法，同時測定大鼠血漿中那格列奈及其代謝物M1 的濃度。

1 材料與方法

1.1 儀器 高效液相色譜串聯質譜HPLC-MS 2020 系統（日本Shimadzu 公司），配備電噴霧離子源（ESI）及Labsolution 工作站（日本Shimadzu 公司）；Milli-Q Gradient A10 超純水機（美國Millipore 公司）；Thermo Sorvall Stratos 臺式高速冷凍離心機（美國Thermo 公司）；SpeedVac 濃縮揮干儀（美國Thermo 公司）；十萬分之一天平（美國梅特勒-托利多公司）。

1.2 試劑 那格列奈標準品（純度99.9%，大連美侖生物技術有限公司）；代謝物M1（純度99%，美國ChemShuttle 公司），結構如圖1 所示；非那西?。兌?8%，大連美侖生物技術有限公司）；乙腈為質譜級（美國Merck 公司），其他試劑均為分析級。

圖1 那格列奈與代謝物M1的化學結構

1.3 動物 健康雄性Sprague-Dawley 大鼠6 只，體質量（200±20）g，由南京集萃藥康生物科技有限公司提供，合格證編號：SCXK（蘇）2018-0008；No.2021081426。

1.4 方法 （1）溶液配制：精密稱取那格列奈10.0 mg與M1 5.0 mg 置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻即得1 mg/mL 那格列奈與0.5 mg/mL M1 混合儲備液，再依次稀釋成含有那格列奈0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μg/mL 和M1 0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 μg/mL 的混合標準系列溶液；精密稱取非那西丁5.0 mg 置于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容，搖勻即得0.5 mg/mL 非那西丁儲備液，再稀釋成0.5 μg/mL 的內標溶液。（2）血漿樣品處理：取血漿樣品100 μL 于離心管中，依次加入非那西丁內標溶液10 μL 和1 mL 乙酸乙酯。渦旋5 min，10,000 r/min離心5 min。轉移上清液至另一離心管中，濃縮揮干后，殘留物加100 μL 流動相復溶，18000 r/min 離心5 min 后，2 μL 進行分析。（3）色譜條件：色譜柱：島津C18 柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相：0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min，40%B；8～8.5 min，40%→70% B；8.5～14.5 min，70% B；14.5～15 min，70%→40% B；15～18 min，40% B）；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃。（4）質譜條件：采用電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）以及選擇性離子監測（Selected Ion Monitoring，SIM）陽離子模式；檢測對象［M+H］+：那格列奈m/z 318.2，代謝物M1 m/z 334.1，內標非那西丁m/z 180.1；霧化氣3 L/min；干燥氣15 L/min；DL 管溫度250 ℃；Heat Block 溫度300 ℃。

2 結果

2.1 專屬性 取6 份來源不同的大鼠空白血漿、混合標準溶液、空白血漿加標準品以及大鼠含藥血漿，按照“1.4 項”測定，得到空白血漿色譜圖并與相應的混合標準溶液、血漿加標準品及大鼠含藥血漿色譜圖進行比較。結果表明，在實驗條件下，那格列奈、M1 和非那西丁的保留時間分別約在15.4 min、7.9 min 和7.0min，峰形良好，無雜峰干擾（圖2）。本方法具有優秀的專屬性，可在復雜樣品中識別目標物質。

圖2 專屬性考察（分別檢測下列樣品中的那格列奈及其代謝物M1，以考察該方法的專屬性）。A.空白血漿；B.定量下限LLOQ標準溶液；C.空白血漿+標準溶液；D.大鼠口服10 mg/kg那格列奈30 min后的含藥血漿

2.2 標準曲線與線性范圍 取混合標準系列溶液各10 μL，分別加入100 μL 空白大鼠血漿，按照“1.4 項”測定，記錄那格列奈峰面積（As1）、M1 峰面積（As2）及內標峰面積（Ai），以比值f=As/Ai 的平均值對血藥濃度（C）作回歸計算，得回歸方程（圖3）；那格列奈與M1 的定量下限分別為62.5、31.25 ng/mL；線性范圍為0.0625～8 μg/mL（那格列奈），0.0313～4 μg/mL（M1）。

圖3 那格列奈與其代謝物M1的標準曲線

2.3 準確度與精密度 使用混合標準溶液配置不同濃度的那格列奈和M1 質控樣品。其中，那格列奈和M1濃度分別為定量下限（0.0625、0.0313 μg/mL）、低濃度（0.125、0.0625 μg/mL）、中濃度（0.5、0.25 μg/mL）、高濃度（6.4、3.2 μg/mL），每份樣品平行做5 份。按照“1.4 項”測定，并配備隨行標準曲線，連續測定3 d，得到日內和日間準確度與精密度。結果所示，那格列奈的準確度為94.1%～107.2%，精密度變異＜9.9%；M1 準確度為94.7%～107.4%，精密度變異＜7.7%。

2.4 基質效應 取6 份不同來源的大鼠空白血漿100 μL，按照“1.4 項”處理，并在揮干后分別加入10 μL低、中、高三個濃度的混合標準溶液，用100 μL 流動相復溶進樣，得各峰面積（那格列奈As1、M1 As2、內標Ai）。樣品中那格列奈和M1 濃度分別為低濃度（0.125、0.0625μg/mL）、中濃度（0.5、0.25 μg/mL）、高濃度（6.4、3.2 μg/mL）。另取10 μL 低、中、高三個濃度的混合標準溶液分別加入10 μL 內標溶液，再加入100 μL 流動相復溶進樣并計算得各峰面積均值（那格列奈as1、M1 as2、內標ai）。以公式e=（As/as）/（Ai/ai）計算內標歸一化基質因子。結果顯示，低、中、高三個濃度那格列奈基質效應＜4.7%，M1 基質效應＜5.0%。

2.5 回收率 按照“2.3 項”制備低、中、高三個濃度的質控樣品（不加內標溶液），并在復溶時加入10 μL非那西丁內標，測定得各峰面積（那格列奈As1、M1 As2、內標Ai）。另取10 μL 低、中、高三個濃度的混合標準溶液分別加入10 μL 內標溶液揮干，再加入100 μL 流動相復溶測定并計算得各峰面積（那格列奈bs1、M1 bs2、內標bi）。以公式h=（As/Ai）/（bs/bi）計算，得那格列奈回收率為97.6%～99.5%，M1 回收率為96.9%～98.4%。

2.6 穩定性試驗 按照“2.3 項”制備低、中、高三個濃度的質控樣品，分別考察室溫放置12 h、反復凍融3 次、進樣瓶4 ℃放置72 h 的樣品穩定性。結果表明，樣品內的待測物具有良好的穩定性。

2.7 大鼠體內那格列奈藥物代謝動力學試驗 大鼠（n=6）過夜禁食后，灌胃給予10 mg/kg 那格列奈（混懸于0.25% CMC-Na），分別于2、5、10、15、20、30、45、60、90、120、240 和480 min 自眼底靜脈叢取血，肝素抗凝。靜置15 min 后，8,000 rpm 離心5 min 得血漿，按照“1.4 項”測定，分別繪制那格列奈和M1 的血藥濃度-時間曲線（圖4），并利用Phoenix Winnolin8.0軟件計算藥代動力學參數（表1）。結果顯示，那格列奈口服吸收迅速，原形藥物與代謝物M1 分別在15 min 與42.5 min 達到峰濃度。血漿藥物峰濃度分別為3.25 μg/mL 與1.63 μg/mL。那格列奈與M1的半衰期分別為81.2 min 與98.4 min。

表1 大鼠口服10 mg/kg那格列奈后，那格列奈與M1的藥物代謝動力學參數（±s）

表1 大鼠口服10 mg/kg那格列奈后，那格列奈與M1的藥物代謝動力學參數（±s）

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圖4 大鼠體內那格列奈與代謝物M1的藥時曲線

3 討論

2型糖尿病是常見的內分泌科疾病，在糖尿病中占了90%以上，且是終身性、慢性疾病，至今無根治療法，需長期堅持治療，有效控制血糖指標，才不會導致病情加重［5］。近年來隨著我國社會老齡化加劇，老年人口不斷增多，加上各種不健康生活習慣，導致糖尿病發病率不斷升高，嚴重影響了患者的正常生活、工作，且會嚴重影響老年人的晚年生存質量［6-7］。故根據老年患者身體特征對其進行胰島素分泌的調節和血糖水平控制是臨床治療的關鍵［8-9］。那格列奈是口服降糖藥中唯一的苯丙氨酸衍生物，藥物口服吸收迅速，其代謝產物幾乎無降糖活性，口服給藥后6 h 內那格列奈及其代謝產物即完全清除［10］，低血糖發生率低。在老年人中使用無需調整劑量［11］，因此，對于老年2 型糖尿病患者，那格列奈單藥或聯合治療是推薦的治療方案。

那格列奈的測定方法多采用固相萃取后HPLCUV 法［12］，流動相多用磷酸緩沖鹽，樣品采用固相萃取法處理后進樣，這些方法樣本處理步驟相對復雜繁瑣，成本比較高，柱平衡時間長，每個樣本分析時間也較長（均＞10 min），靈敏度低、誤差大且無法同時測定其代謝物M1，無法全面揭示那格列奈的體內藥代動力學行為。為了獲得較高的質譜響應以及較好的峰形和比較短的分析時間，在本實驗過程中，利用乙酸乙酯萃取血漿樣品，并且以非那西丁作為標準品進行測試。利用島津C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）分離，流動相為0.1%甲酸溶液與乙腈，梯度洗脫，流速0.2 mL/min，最后獲得那格列奈標準曲線線性范圍為0.0625～8.0000 μg/mL，M1 為0.0313～4.0000 μg/mL。這種方法既能達到生物樣本測定對靈敏度和精確度的要求，而且又簡便快速。

本法采用鹽酸酸化的液體萃取相比于固相萃取后的HPLC-UV 法，極大地增加了那格列那及M1 的提取回收率，方法穩定、測定快速、靈敏度高、成本低、重現性好且減少儀器損耗。該法適用于血漿、尿液、組織及細胞等各類生物樣品測定。