生態脆弱煤礦區水體中微生物群落特征及礦井充水指示

范立民 ，李 濤 ，高 穎 ，白如鴻 ，孫 強

（1.中國礦業大學 礦業工程學院, 江蘇 徐州 221116；2.六盤水師范學院 礦業與機械工程學院, 貴州 六盤水 553004；3.陜西榆林能源集團有限公司, 陜西 榆林 719000）

0 引 言

煤炭資源開采必然發生礦井充水，有效識別礦井充水水源是礦井水害防治及水資源保護的重要一環[1-4]。特別在我國生態脆弱的西北地區，煤炭資源豐富，水資源卻普遍缺少，但局部地區礦井涌水量大，對這些區域充水水源的精準識別，對于區域水資源保護和利用意義重大[5-7]?，F有煤炭開采礦井充水水源識別的方法主要包括2 種類型。第一類為通過礦井充水的表觀特征進行識別，包括水文常觀孔水位、礦井水的水溫、水壓及涌水量等方面。曾一凡等[8]研究了我國礦井不同充水水源的主要特征，并提出了相關的防治措施。顧愛民[9]基于水動力學和水化學聯合開展了突水水源識別的研究，有效提升了突水水源識別準確率。第二類為通過礦井充水水質的特征進行識別，又包括2 個方面的研究，一方面關注礦井水中的各種化學組成[10-13]，即常規水化學、微量元素水化學、同位素水化學、有機元素水化學等；另一方面關注水源識別算法的研究，即各類統計學方法[14-17]。大量的研究發現，以上方法對于水質比較相近的含水層識別成功率相對較低，算法的研究雖然可以提升，但仍需要更多的礦井水相關數據對水源識別進行有效支持。

近年來，微生物高通量測序技術取得了突破，一個水樣或者土樣就可以獲取其中大量的微生物信息，彌補了化學成分相似的含水層礦井充水水源識別度的不足。礦業相關的研究者開始將該技術應用到礦井水污染機制方面的研究。李濤等[18]提出了一種基于微生物場特征突水水源判別方法，得到了突水水源微生物判別模式。張莉等[19]采用高通量測序技術研究了鄂爾多斯某煤礦不同功能區微生物群落特征，分析了采礦對微生物群落的影響，揭示了采礦對微生物群落的影響規律。朱璐璐[20]研究了門克慶礦微生物群落對礦井水水質的影響，獲取了影響礦井水水質形成與演化的微生物群落特征及環境影響因素。孫亞軍等[21]研究了微生物場、水化學場、水動力場對礦井水水質的綜合作用，闡釋了礦井水水質形成的多場耦合作用機制。李文博等[22]研究了700 m礦井中各類巷道微生物分布特征，發現了煤礦各類巷道擁有豐富的微生物多樣性?？敌”萚23]研究了微生物數量識別閉坑礦井充水水源方法，提出了4種閉坑礦井充水模式。陳家玉等[24]研究了淮北煤田微生物群落特征，為礦井充水水源分析提供了新方法，發現了不同充水水源擁有不同的微生物群落特征。

高通量測序技術帶來了大量微生物場數據，但已有的研究認為pH、離子種類、數量、含氧量及生物活動等均會影響水中微生物群落結構[18-24]，單一方法識別礦井水源存在局限性。為此，以榆樹灣煤礦涌水量異常巨大為研究背景，開展了含水層和礦井水微生物場特征統計分析，結合礦井充水水文地質條件，綜合研究了榆樹灣礦井充水模式。

1 研究區概況

1.1 研究區范圍

研究區選擇處于大規模開采階段的陜北侏羅紀煤田榆神礦區一期規劃區水文地質類型復雜的榆樹灣煤礦。研究區屬于生態脆弱區，地處毛烏素沙漠與陜北黃土高原接壤地帶，以風沙灘地地貌為主，淺表水資源相對豐富，煤炭開采水資源保護意義重大。

1.2 研究區采礦地質條件

1）研究區水文地質條件概況。榆神一區綜合地層如圖1 所示，其中煤層主要賦存延安組，上覆直接充水含水層為直羅組（榆樹灣煤礦非古河道區[25]，弱富水），直羅組上為100 m 以上巨厚的保德組和離石組土層（無天窗，整體相對隔水層，但離石組弱富水），風積沙和薩拉烏蘇組構成了潛水含水層（中等富水）。此外，區內民井統一揭露離石組、薩拉烏蘇組和風積沙含水層，稱之為松散含水層。

圖1 研究區綜合柱狀圖Fig.1 Comprehensive column chart of strata in study area

2）研究區采礦概況。榆樹灣煤礦首采2-2號煤，采用分層開采方法，目前開采上分層采厚為5 m。煤礦生產規模1 000 萬t/a，已經開采了15 a。榆樹灣煤礦礦井涌水量近3 a 保持在1 000 m3/h 左右，其中老采空區（一盤區已經開采的10 余個工作面）的涌水量約占總涌水量70%。本礦導水裂隙帶發育高度實測發現：已開采區域導水裂隙帶僅發育到離石組黃土的底部（圖2，按照28 倍裂采比計算），未波及薩拉烏蘇組（距離薩拉烏蘇組50 m 以上）。如圖3 所示，布置在薩拉烏蘇組的常觀孔顯示：3 a 潛水位隨著降雨有所波動，同期未發現明顯的水位下降（最大幅度下降約1 m）。

圖2 榆樹灣煤礦2-2 號煤開采導水裂隙發育預測Fig.2 Prediction of development of water conducting fractures during mining of coal seams 2-2 in Yushuwan Coal Mine

圖3 榆樹灣煤礦薩拉烏蘇組水位動態觀測曲線Fig.3 Dynamic observation curve of water level in Sarawusu Formation of Yushuwan Coal Mine

由于榆樹灣煤礦未發現其他特殊導水通道（斷層、天窗等），現有技術發現直接充水含水層為弱富水直羅組基巖含水層[26]，但礦井涌水量異常巨大。因此本次研究采用高通量測序技術對榆樹灣礦井充水水源進行進一步識別。

2 研究方法

2.1 水樣采集

對研究區范圍設置了10 個取樣點，每個取樣點采集水樣3 個，共計采取30 個樣品，各水樣的取樣來源見表1。水樣原位獲取存儲在無菌瓶，在榆林水文實驗室進行初步過濾處理，初步處理后的樣品送西安生物實驗室開展水樣微生物高通量測序。

表1 研究區水樣點Table 1 Water sampling points in research area

2.2 高通量微生物測序原理及方法

2.2.1 高通量測序技術

高通量測序技術區別于傳統Sanger（雙脫氧法）測序，是能夠一次并行對大量核酸分子進行平行序列測定的技術，通常一次測序反應能產出不低于100 MB 的測序數據。

2.2.2 高通量測序方法

高通量測試流程如圖4 所示，主要包括樣品采集（本次采集30 個樣品）、微生物DNA 提?。ú捎肗anodrop 對DNA 進行定量）、目的片段擴增、擴增產物鈍化回收、測序文庫的制備（采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫）、上機高通量測序（圖5）、拼接質控、序列聚類及數據分析。其中數據分析又包括常規分析、高級分析和個性化分析（圖4），研究主要采用常規分析。

圖4 高通量擴增子測序流程Fig.4 High throughput amplicon sequencing process

圖5 高通量測試數據分析Fig.5 High flux test data analysis

3 結果及分析

3.1 微生物多樣性分析

微生物多樣性分析以Alpha 多樣性分析和Beta多樣性分析為主，兩者分別表征物種在生境內和生境間的多樣性。

3.1.1 Alpha 多樣性分析

本次測定的結果如圖6 所示，包括了7 種多樣性指數，其中不同指數表征信息主要包括豐富度、多樣性、均勻度和覆蓋度，合并敘述如下：

圖6 Alpha 多樣性分析結果Fig.6 Alpha diversity analysis results

1）細菌Chao1 和Observed species 指數分析（豐富度）。①S2 樣品（松散層）微生物豐度最高，S10 和S5（直羅組）水樣微生物豐富度最低。說明松散層微生物較直羅組中微生物更豐富。②礦井水微生物豐度（S1、S3、S8、S9）位于中線附近，與礦井充水最為接近的水樣為S6（松散層+直羅組），表明礦井充水中微生物多樣性與松散層混合直羅組含水層微生物多樣性相似。③對比S2（松散層）和S7（離石組），可以看出S7 更為接近榆樹灣礦井充水，因此可見礦井水中松散層中的水樣主要來源為松散層中的離石組黃土。

2）細菌Simpson、Shannon 和Faith 指數分析（多樣性）。①Simpson 指數總體規律明顯與Chao1 指數有差異，說明微生物豐富性和多樣性存在差異。②所有水樣的Simpson 指數集中在0.73～0.97，說明礦區水中微生物多樣性較高。③S1 樣品來自榆樹灣煤礦最大的礦井涌水點，該水樣微生物多樣性與S2水樣最為接近，其次接近S7、S5，說明現有榆樹灣礦井涌水主要受到松散層和直羅組的影響。

3）細菌Pielou 指數分析（均勻度）。Pielou 指數僅反映均勻度，數值越大，越均勻。圖6 可以看出S5（鉆孔取出的天然地下水）的Pielou 指數最大，即其最為均勻。S3（正在開采人為擾動的工作面涌出水）的Pielou 指數最小，即其最不均勻。由此可見，人類活動對礦井水的微生物群落影響很大，這與前人研究結果相似[21]。

4）細菌Coverage 指數分析（覆蓋度）。所有水樣的細菌Coverage 指數普遍大于0.988，說明覆蓋度很大，說明本次測序結果代表了微生物的真實情況。

5）Alpha 多樣性綜合分析。①測試的結果通過了Coverage 指數檢驗，總體可信。②豐富度分析表明：松散含水層水樣中微生物種類最多，直羅組水樣中微生物種類最少，榆樹灣礦井涌水介于兩者之間，即榆樹灣煤礦充水水源除直羅組外還有松散層中的離石組黃土含水層參與。③測試的多樣性分析表明：S3 水樣（榆樹灣煤礦20113 工作面涌水）多樣性指數最大，受人類活動影響最為顯著，因此表現出復雜的微生物多樣性。S5 水樣（直羅組含水層）的Shannon指數最小，微生物類型最少。榆樹灣煤礦S1（最大礦井涌水點）的微生物多樣性與S2、S7 和S5 接近，也說明榆樹灣礦井涌水主要由松散層和直羅組組成。

3.1.2 Beta 多樣性分析

通過主坐標分析(Principal Coordinate Analysis，PCoA)，非度量多維尺度分析(Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS)等非約束排序手段對多維微生物數據進行降維，并通過對樣本在連續排序軸的分布，展示數據變化的主要趨勢；同時也可通過聚類分析的手段識別環境中不連續對象的子集，對數據進行分類。采用以上3 個分析方法分別分析如下：

1） PCoA 分析。對10 個點30 個樣品進行了PCoA分析，結果如圖7 所示，可以得到以下結果：①同一取樣點測試的3 個樣品距離很近，說明重復性很強。②同一含水層的不同地點取樣測試結果顯示，黃土層、松散層有較好的重復性，但直羅組和礦井水重復性較差，即水中微生物群落影響因素較多。③礦井涌出水與直羅組和離石組有交叉區域，說明礦井水中有一定的直羅組和離石組水，研究區礦井水充水表現出多水源特征。④礦井涌出水中S1 與松散層最為接近，說明直羅組靜儲量釋放后，礦井涌出水中松散層（薩拉烏蘇組+離石組黃土）有所增加。

圖7 PCoA 分析的樣本二維排序Fig.7 Sample two-dimensional sorting chart for PCoA analysis

2） NMDS 分析。NMDS 結果的Stress 值越小越好（小于0.2），NMDS 分析的結果較可靠。本次分析結果如圖8 所示，其Stress 值為0.058 9，可見分析結果可靠。對NMDS 結果分析，可以得到以下結果：①榆樹灣煤礦松散層S2 水樣同一地點的取樣測試有一定距離，說明重復性不強。這可能與S2 人類活動密集有一定的相關性（風井建設中大量工程作業）。②礦井水與直羅組和離石組有明顯的交集，說明礦井水構成中有直羅組和離石組水源，研究區礦井水充水表現出多水源特征。③礦井水中S1 與松散層最為接近，說明直羅組靜儲量釋放后，礦井涌出水中松散層（包括黃土層）有所增加。

圖8 NMDS 二維排序Fig.8 NMDS 2D sorting diagram

3）聚類分析。對10 個點30 個樣品進行了聚類分析，結果如圖9 所示，可以得到以下結果：①整體上聚類分析對各類水源有較好的區分，但松散層中的S2 較為離群，這與前面的Alpha 多樣性分析結果一致。結合取樣點分析，該點受人類活動擾動有所變化。②聚類分析對礦井水和天然含水層有較好的區分，而礦井水沒有跟某一類水源有較好的聚類關系，說明礦井水的水源是多種天然地下水的集合。③礦井水短期內與天然含水層更為接近，而在采空區內相對封閉環境和基巖含水層的疏干，微生物菌落發生了進一步的變化。

圖9 基于樣本距離矩陣的聚類樹Fig.9 Cluster tree based on sample distance matrix

3.2 微生物構成差異分析

微生物構成差異分析包括多種類型，本次開展分類單元數統計分析、分類學組分分析和物種熱成像圖分析。

3.2.1 分類單元數統計分析

計算不同樣本在各分類水平所含有的分類單元的數目，并繪制成柱狀圖，結果如圖10 所示，可以看出：

圖10 各水平微生物分類單元數統計Fig.10 Statistical of number of microbial classification units at different levels

1）分類單元數目最少的是S5 和S10，說明受人類活動擾動影響較小。分類單元數目最多的是S2，該水樣前面已經提及受人類活動擾動影響顯著。

發展微電網的目的主要有三個：一是通過柴油機、小風電、分布式光伏等獨立發電系統，解決與大電網聯系薄弱的農村和偏遠地區用電問題；二是在可再生能源高滲透率地區，通過微電網這一穩定的電力供應平臺，實現分布式可再生能源的消納和多種能源的高效利用；三是作為大電網的備用和補充，滿足對電能質量和供電可靠性有特殊要求的用戶需要和特殊時期的應急供電。

2）榆樹灣最大涌水點S1 平均由30 個門、78 個綱、136 個目、158 個科、180 個屬、41 個種的微生物群落構成。這與直羅組天然含水層微生物分類單元數目相差較大。由此可見，榆樹灣煤礦礦井充水由多種水源共同構成。

3.2.2 分類學組分分析

使用去除singleton 后的特征表，實現各樣本在門分類水平上的組成分布的可視化，分析結果如圖11所示，可知以下3 點結論：

圖11 門分類水平物種組成柱狀圖Fig.11 Bar chart of species composition at the phylum classification level

1）所有水樣中最為優勢的門類為變形菌門，占比達到35.5%～89.7%，這類微生物最少出現在離石組中。榆樹灣礦井最大涌水點S1 中的變形菌門介于離石組和直羅組之間。

2）放線菌門在直羅組中占比較高，達到29.0%～29.1%。這與正在開采的工作面涌出水中的含量占比最為接近，其占14.7%～15.9%。

3）基巖含水層靜儲量疏干后的S1 水樣，除最為優勢的變形菌門以外，還有厚壁菌門占比最高，達到14.1%～15.2%。這與松散含水層S2 該類菌門的含量最為接近。

3.2.3 物種組成熱圖分析

一般常使用屬水平的分類單元組成作為分析對象，因此默認使用平均豐度前50 位的屬的豐度數據繪制熱圖，結果如圖12 所示，可以看出：

圖12 雙聚類的屬水平物種組成熱圖Fig.12 Genus level species composition heatmap of biclusters

2）正在開采的采煤工作面涌出水S3 與采空區穩定后的涌出水較為接近（橫向聚類為統一類型），以不動桿菌屬（Acinetobacter）、動性桿菌屬（Planomicrobium）等微生物豐度最高。

3）松散層S2 和S4 距離礦井充水水樣最遠，以新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、梭桿菌屬（Fusobacterium）、硫屬（Sulfuricum）等微生物豐度最高。

4）直羅組S5 水樣最接近最新涌出的礦井涌水樣，以叢毛單胞菌屬（Comamonas）、蟯蟲屬（Vermiphilaceae）、巴氏桿菌（Paeniglutamicibacter）等微生物豐度最高。

3.3 榆樹灣煤礦充水特征綜合分析

1）榆樹灣煤礦充水微生物特征分析。榆樹灣煤礦最大的礦井涌水點S1 水樣的Shannon 指數、Faith指數、Simpson 指數和Pielou 指數與S2、S7 和S5 水樣相近，說明現有榆樹灣礦井涌水主要來自松散含水層和直羅組含水層，PCoA 和NSDM 分析佐證了這一結論。Beta 多樣性分析顯示榆樹灣煤礦老采空區涌出水與松散層最為接近，說明直羅組含水層靜儲量釋放后，榆樹灣礦井充水水源構成中離石組黃土層的水有所增加。為進一步剖析充水水源，結合礦井充水因素分析如下。

2）榆樹灣煤礦充水通道分析。榆樹灣煤礦充水水源主要受充水通道影響，充水通道主要包括采煤導水裂隙帶和其他導水構造或天窗。

關于導水裂隙帶：榆樹灣煤礦已有的導水裂隙帶高度實測結果顯示裂采比最大為28 倍，以28 倍裂采比計算的導水裂隙帶發育結果如圖2 所示?？梢钥闯?，目前已采區導水裂隙帶直接溝通延安組含水層、直羅組含水層及部分離石組含水層，富水性中等薩拉烏蘇組含水層未導通。

關于其他導水通道：根據目前榆樹灣煤礦鉆孔、地震及采掘工程揭露可知井田范圍內無斷距大于5 m 的斷層。此外，榆樹灣煤礦土層厚度十分穩定，為榆神府礦區已經開采范圍內厚度最大的礦井，其厚度普遍超過100 m，且礦井未發現天窗存在。分析榆樹灣2015—2022 年開采面積與礦井涌水量關系（表2），兩者有較好的線性關系（式（1），R2=0.93），而榆神礦區另一個典型天窗充水礦井（錦界煤礦，涌水量巨大）開采面積和礦井涌水量的相關性較差[27]，這與錦界煤礦天窗區和非天窗區充水條件差異較大有關。綜合說明了榆樹灣礦井充水條件相對穩定，未受突變性較大的構造或天窗影響。

表2 榆樹灣煤礦礦井涌水量與采空區面積關系Table 2 Relationship between water inflow and goaf area in Yushuwan Coal Mine

式中，Q為礦井涌水量，m3/h；F為累計采空區面積，km2。

3）榆樹灣礦井充水模式。綜合榆樹灣充水水文地質和微生物群落特征分析，可以看出：榆樹灣煤礦的充水模式為基巖含水層快速釋水+離石組含水層持續釋水模式。其中主要論據有2 個方面。

一方面，通過礦井各涌水點的統計如圖13 所示，可以看出：礦井正在回采的工作面涌水量僅占總礦井涌水量的4.13%，掘進過程產生涌水量占總礦井涌水量的3.16%，井筒涌水量占總礦井涌水量的16.31%，而老空水量則占總礦井涌水量的76.40%。說明榆樹灣礦井總的涌水量主要來自持續釋放的離石組松散含水層，而榆樹灣煤礦“三帶”探查鉆孔揭露到采空區上方直羅組基巖含水層水消失即為佐證。

圖13 礦井涌水量構成Fig.13 Composition of mine water inflow

結合圖7 PCoA 分析結果，S1（老采空區涌水點水樣）與S7（離石組黃土含水層）接近，說明目前榆樹灣煤礦總的礦井涌水與離石組含水層持續釋水密切相關。水樣微生物群落分析驗證了這一結論。

另一方面，對開采工作面的涌水量的持續觀測結果如圖14 所示，可以看出：煤炭開采過程中以直羅組等基巖含水層快速衰減的含水層為主。采煤工作面推進約800 m 位置時，工作面涌水量開始快速衰減，最終工作面涌水量衰減到巔峰時期涌水量的41.86%。說明榆樹灣礦井總的涌水量中僅有回采的工作面中有明顯的基巖快速釋水。結合圖8 NSDM分析結果，S3（正在開采工作面涌水點水樣）與S5（直羅含水層）最為接近，證明了這一結論。

圖14 礦井工作面涌水量動態觀測Fig.14 Dynamic observation of water inflow in mining face

綜合以上兩點，榆樹灣煤礦充水模式可以概括為基巖含水層快速釋水+離石組含水層持續釋水模式。其中松散層持續充水原理與我國東部礦區土層持續釋水相似（土層發生了持續固結釋水）[28]。

4 結 論

1）關于高通量測序用于礦井充水識別的研究方面：將含水層和礦井涌水水樣進行高通量測試，測試結果通過了Coverage 指數檢驗，相關識別結果被礦山水文監測和導水裂隙帶觀測結果佐證，說明高通量測序可用于礦井充水分析。但人類活動密切接觸的水樣顯示出被污染特性，需要在取樣中有效規避。

2）關于礦井水中微生物群落特征方面：榆樹灣煤礦淺表松散含水層中微生物豐富度和多樣性都較高，以新鞘脂菌屬（Novosphingobium）、梭桿菌屬（Fusobacterium）和硫屬（Sulfuricum）等微生物豐度最高；直羅組為代表的基巖含水層微生物豐富度較低，但微生物多樣性較高，以叢毛單胞菌屬（Comamonas）、蟯蟲屬（Vermiphilaceae）和巴氏桿菌（Paeniglutamicibacter）等微生物豐度最高。所有水樣中最為優勢的門類為變形菌門，占比達到35.5%～89.7%。

3）關于榆樹灣煤礦礦井充水模式方面：Alpha 多樣性分析顯示，榆樹灣礦井涌水主要主要來自松散含水層和直羅組含水層，PCoA 和NSDM 分析佐證了這一結論。Beta 多樣性分析顯示，榆樹灣煤礦老采空區涌出水與松散層最為接近，直羅組含水層靜儲量釋放后，榆樹灣礦井充水水源構成中離石組黃土層的水有所增加。因此，榆樹灣煤礦為基巖含水層快速釋水+離石組含水層持續釋水的充水模式，這一結論得到了礦井涌水規律的證實。