紙基法血液基因組DNA的提取與應用

劉 壯,何茹月,胡圣偉

(石河子大學生命科學學院,新疆石河子 832003)

DNA分子擴增與基因測序已成為遺傳學和分子診斷領域的重要手段[1]。分子診斷應用于轉基因檢測和分子標記檢測[2],比酶或抗體檢測靈敏度高、靈活性強,通過PCR擴增用微量DNA即可達到試驗目的,而樣品基因組DNA的獲取和純化則決定檢測結果的完整度和準確性。目前,基因組樣本DNA提取方法主要包括苯酚-氯仿抽提法[3]、試劑盒法[4]、煮沸法[5]、磁珠法[6]等。以大鼠和小鼠的鼠尾及腳趾為試驗材料[7],用苯酚-氯仿抽提法萃取得到鼠尾組織的基因組DNA,但此方法耗時較長且有毒性,長時間威脅人體健康。用試劑盒提取法從所有毛絨干樣本中獲得了高質量的DNA[8],但此法成本偏高[9]。煮沸法可以避免耗時和成本高的缺點,但在一定程度上影響DNA純度、濃度和完整度。磁珠法利用磁珠粒子表面化學物質的差異性捕獲和純化核酸,可大批量進行樣本檢測,但依賴大型儀器設備,受試驗區域的影響[10]。因此,基于已有的核酸提取方法,開發一種簡易快速基因組DNA提取方法很重要。

Whatman No.1纖維素濾紙價格低廉、便攜且易于修飾,可以在堿性溶液中幾秒內吸附帶負電荷的DNA,經過簡單的洗滌就可直接釋放到擴增反應液中[11]。用Whatman No.1濾紙片在30 s內可從擬南芥葉片和豬肺中提取并純化出DNA[12]。用常規定性濾紙作為核酸吸附的載體提取出中藥DNA[13],而對于下游的核酸擴增驗證則與傳統核酸提取法一致。隨著基因工程技術的不斷發展和完善,基因編輯在生物學研究中越來越重要[14]。目前對于基因編輯小鼠后代的基因型快速檢測的方法仍存在耗時長、高成本等限制[15]。因此,基于基因編輯型小鼠穩定遺傳理論和WhatmanNo.1纖維素濾紙的吸附特性,尋求一種對子代小鼠高效、穩定、低創傷的DNA提取方法,為大量基因編輯小鼠后代基因分型提供可行方案。

本文用Whatman No.1纖維素濾紙制備出特定結構的試紙條,以基因野生型和編輯型C57BL/6J小鼠為試驗材料建立紙基法。對比試劑盒提取法和煮沸法,用PCR擴增和測序分析以驗證基因分型結果的準確性。此研究為快速檢測和基因分型提供了重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6只5～6周齡GDF11基因敲除雜合型(GDF 11+/-;2雄4雌)和9只雄性野生型(GDF 11+/+)C57BL/6J小鼠。飼養條件滿足光照/黑暗12 h交替,自由攝食飲水。所有小鼠由石河子大學動物基因工程實驗室飼養與繁殖,試驗均在石河子大學動物護理委員會批準的方案下進行。

1.1.2 主要試劑與儀器 Tris-HCL、氯化鈉(NaCl)、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸鈉(SDS),北京索萊寶科技有限公司產品;天根血液基因組提取試劑盒(TIANmp Blood DNA Kit)、Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒、2X SanTaqFast PCR Mix、蛋白酶K,上海生工生物工程股份有限公司產品。DNA Marker 2 000,上海天根生化科技有限公司和北京索萊寶科技有限公司產品;Whatman No.1濾紙,上海金畔生物科技公司產品。Mastercycler pro梯度PCR儀、高速離心機,Eppendorf公司產品;瓊脂糖凝膠核酸電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;凝膠成像儀,Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 紙基法的構建 基于文獻[12],改進Whatman No.1纖維素濾紙結構。將Whatman No.1纖維素濾紙裁剪成55 mm×2 mm的長方形紙條,用鑷子夾取紙條一側,將紙條的52 mm浸入液體石蠟中(手柄區),未浸蠟區域形成一個6 mm×2 mm的長方形(結合區),制備標準試紙條(圖1)。

圖1 紙基法流程圖

通過斷尾采血法收集3只野生型小鼠a、b、c的血液各50 μL,加入200 μL A液(10 mmol/L Tris pH 8.0;15 mmol/L NaCl;10 mmol/L EDTA pH8.0;0.4% SDS;200 μg/mL蛋白酶K)中,放入2顆直徑5 mm的無菌鋼珠,充分劇烈搖晃30 s形成血液裂解液。將試紙條DNA結合區反復浸入血液裂解液3次后放入B液(10 mmol/L Tris pH 8.0;0.1% Tween 20)中洗滌5次,隨后將吸附有小鼠核酸DNA的試紙條放入PCR反應體系混合液中,靜置3 s,隨后進行PCR擴增反應。用天根血液基因組提取試劑盒,按說明書從上述3只野生型小鼠全血中提取總 DNA,作為紙基法的對照。根據C57BL/6J小鼠特有的GDF11(GenBank登錄號:NC-000076.7)和MSTN(GenBank登錄號:NC-000067.7)核苷酸序列設計得到3種引物Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2測試3只野生型小鼠的基因型,以驗證該引物的特異性;用以上3種引物,驗證紙基法的穩定性和特異性。。

表1 引物序列信息

1.2.2 基因敲除小鼠的繁殖 用F0代1雄(GDF 11+/-)和2雌(GDF 11+/-)的配種模式,對C57BL/6J小鼠進行配種,自然受孕21日后,將F1代小鼠飼養至斷奶4周后,隨機抽取10只F1代小鼠編號為1～10號作為小鼠基因型鑒定的材料來源。

1.2.3 3種DNA提取方法的比較應用 試劑盒提取法:將隨機選取的基因敲除型小鼠后代中的10只小鼠,剪取0.2～0.5 cm尾尖組織,剪碎后放于2 mL離心管內。用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒說明書提取得到小鼠基因組DNA。

煮沸法:取上述10只小鼠的0.2～0.5 cm尾尖組織,加入200 μL DNA抽提緩沖液(50 mmol/L Tris·HCl pH8.0;10 mmol/L EDTA;0.1% SDS;100 mmol/L NaCl)和10 μL 20 mg/mL 蛋白酶K,混合均勻后在55℃恒溫水浴鍋中消化20 min,100℃煮沸10 min,靜置20 min得到含有小鼠基因組DNA的裂解液。

紙基法:取上述10只小鼠的樣本,根據1.2.1的方法得到PCR擴增反應的模板。

1.2.4 PCR擴增和電泳檢測 根據NCBI上已公布的C57BL/6J小鼠序列信息和GDF11基因編輯型小鼠構建方案(圖2)得到基因型鑒定標準,基因片段只有一條大小491 bp或404 bp片段,基因型為純合子(GDF 11-/-)或野生型(GDF 11+/+);基因片段一條大小491 bp,另一條大小404 bp,基因型為(GDF 11+/-)。設計鑒定基因敲除型小鼠的引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2(表1)。

圖2 基因編輯型小鼠構建方案圖

PCR擴增體系:ddH2O 9 μL,5×PCR Mix 10 μL,DNA模板0.5 μL,上、下游引物(10 mmol/L)0.5 μL。PCR擴增條件為:95℃ 3 min;95℃ 20 s,60℃ 20 s,72℃ 40 s,循環35次;終延伸72℃ 2 min;4℃保溫。PCR擴增反應結束后,使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對5 μL反應體系進行電泳,利用凝膠成像儀分析電泳結果。

1.2.5 測序結果驗證 用上述10個樣本的瓊脂糖電泳結果,根據每個樣本擴增出的大小不同的DNA片段預測基因敲除型小鼠后代的基因型,隨機選取2個樣本的PCR擴增產物,由上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析,驗證依據電泳條帶大小判斷基因敲除型小鼠后代基因型結果的準確性。

2 結果

2.1 試紙條檢測方法的構建

用試劑盒法作為對照,用紙基法提取a、b、c野生型小鼠血液中的基因組DNA作為模板﹐用Gdf11-PMT、Gdf11-KI和MSTN 3種引物進行特異性PCR進行擴增(圖3)。PCR結果顯示,用引物Gdf11-PMT穩定克隆出315 bp符合預期的DNA片段(圖3A);用引物Gdf11-KI穩定克隆出567 bp符合預期的DNA片段(圖3B);用引物MSTN穩定克隆出671 bp符合預期的DNA片段(圖3C)?；诩埢?驗證用于編輯型小鼠基因分型的特異性引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2的PCR擴增,結果顯示a、b、c樣本未被Gdf11-KO1引物特異性誘導擴增,由Gdf11-KO2引物擴增出404 bp左右的條帶,說明紙基法為PCR擴增提供了基因組DNA模板(圖3D)。

M.DNA標準DL 2 000;NC.陰性對照;1～3.用紙基法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)對3個樣本的PCR擴增結果;4～6.用試劑盒提取法和引物Gdf11-PMT(A)、Gdf11-KI(B)、MSTN(C)、Gdf11-KO1(D)對3個樣本的PCR擴增結果

2.2 3種DNA提取方法的比較應用

通過試劑盒提取法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增鑒定基因型(圖4A),根據克隆片段的有無和大小表明1、4、6、9號為野生型小鼠,2、3、5、7、8號為基因敲除雜合型小鼠,而10號小鼠為基因敲除純合型小鼠。通過煮沸法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增進行基因型鑒定(圖4B),根據PCR結果說明1、4、6、9號小鼠為野生型小鼠,3、7、8號為基因敲除雜合子小鼠。

A.試劑盒提取法;B.煮沸法;C.紙基法。M.DNA標準DL 2 000;NC.陰性對照;1～10.用引物Gdf11-KO1分別對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號小鼠的基因組DNA PCR擴增結果,11～20:用引物Gdf11-KO2分別對1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號小鼠的基因組DNA PCR擴增結果

通過紙基法得到1～10號10只基因敲除型小鼠后代基因組DNA,利用引物Gdf11-KO1和Gdf11-KO2分別對小鼠的基因組DNA進行PCR擴增進行基因型鑒定(圖4C),根據PCR結果說明1、4、6、9號為野生型小鼠,2、3、5、7、8號小鼠為基因敲除雜合子小鼠,而10號小鼠為基因敲除純合子小鼠。與試劑盒提取法鑒定結果一致,與利用煮沸法鑒定結果存在差異。

2.3 測序驗證結果

根據以上3種DNA提取方法的比較應用,隨機選取10號小鼠和6號小鼠基因組DNA的PCR擴增產物測序分析,結果顯示10號小鼠為基因敲除純合子小鼠(GDF 11-/-)(圖5A),6號小鼠為野生型小鼠(GDF 11+/+)(圖5B),試劑盒提取法與紙基法對于基因分型的檢測結果與測序結果一致。

圖5 測序峰圖結果展示

3 討論

DNA提取是用現代生物技術解析分子檢測和基因分型的關鍵。用酚/氯仿法提取DNA時[16],用PCR對綿羊血液布魯氏菌的檢測下限僅為1×106CFU/mL,其影響因素主要是無法有效去除血液中的血紅蛋白等PCR抑制劑。有研究通過Whatman FTA卡片存儲基因組DNA,用低鹽溶液的洗脫后,穩定了PCR擴增反應[17]。

用紙基法進行HPV DNA的提取極大簡化了臨床宮頸脫落細胞樣本中HPV DNA的提取步驟[18]。用全自動紙基微流控裝置,通過堿裂解法以及Fusion 5紙片成功提取到血液DNA。本研究用Whatman No.1纖維素試紙條進行小鼠全血內基因組DNA的提取,用4種特異性引物,PCR擴增反應驗證了該方法的穩定性和特異性。對于紙基法中DNA結合量和洗滌質量后期可以通過改變試紙中DNA結合區域的大小和洗滌液的體積來微調提取系統,從而達到核酸定量轉移的目的。

根據基因編輯生物在實驗室中廣泛應用的現狀,對于該生物后代基因分型檢測也成為實驗室常備的檢測手段[19]。本文用3種DNA提取法對隨機的10只基因編輯小鼠進行基因分型檢測,紙基法與煮沸法和試劑盒提取法對基因組DNA提取具有更多優勢。紙基法和試劑盒提取法鑒定結果基本完全一致,評判出4只野生型小鼠、5只基因敲除雜合型小鼠和1只基因敲除純合型小鼠。試劑盒提取法保障了動物組織DNA提取的準確性,滿足分子基因檢測的需求,但其檢測成本大以及試驗條件都阻礙了該方法的大規模應用。煮沸法鑒定結果存在偏差的原因可能由于煮沸法獲得的DNA不純,存在污染物和抑制劑,提取的DNA質量較差,影響PCR擴增反應的進行,導致基因型判定出現誤差。測序結果輔助驗證了紙基法對PCR分型結果的準確性?？傊?紙基法表明了該基因組DNA提取系統可以輕松地將基因組DNA從污染物和抑制劑中分離和洗脫出來,為大規模的對基因編輯小鼠后代進行基因型分類提供了技術基礎。

本文用Whatman No.1纖維素濾紙制備得到的試紙條,進行基因組DNA的提取和PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳驗證了該紙基法的穩定性和特異性。橫向比較紙基法、試劑盒提取法和煮沸法3種DNA提取法,最后對隨機選取的樣本DNA進行測序分析,驗證了紙基法對與基因敲除小鼠后代基因型測定的準確性。以上研究表明了一種簡易快速基因組DNA提取方法的建立為分子鑒定和基因分型提供了一種更為快速、便捷、準確、有效的檢測方法。