間變性淋巴瘤激酶在治療非小細胞肺癌中的作用及潛在醫學應用

陳 波,闞連娣,葉發青,孫艷亭,陳立穎

(1.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院藥學部,浙江 杭州 310016;2.溫州醫科大學藥學院,浙江 溫州 325006;3.浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院護理部,浙江 杭州 310016 )

惡性腫瘤的發病概率及所致死亡率在我國占據首位的是肺癌[1],肺癌根據其病理類型可分為小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其中NSCLC占據肺癌總數的80%～85%[2],NSCLC通常采用綜合治療,如：手術、放療、化療以及生物治療等諸多方式并用,其中,手術切除為治療早期NSCLC的首選;而放療則為治療老年肺癌的重要手段,其對SCLC的療效最佳。對大多數NSCLC的患者,因確診時通常已處于晚期,故而采用手術或放療的治療效果不佳,而傳統的放化療,具有很強的毒副作用,鉑類藥物作為主要的傳統化療藥物,長期與紫杉醇、吉西他濱、長春瑞濱、培美曲塞等腫瘤藥物聯合使用作為一線的治療方式[3-5]。但由于這種治療方式選擇性差且毒副作用大而深受限制。因此靶向治療等新興治療方式便成為了頗具重要意義的治療手段[6]。

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是藥物研發的一個新的靶點,在傳統化療和表皮生長因子受體劑(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶向小分子抑制劑耐藥的基礎上ALK作為一個新興的靶點在NSCLC中具有一定的療效并且有很多獨特的優勢,本文從ALK的結構與生理功能和ALK的小分子抑制劑的研究現狀以及ALK在NSCLC中的治療現狀等方面進行論述,并提出了ALK在NSCLC治療中問題及展望。

1 ALK的結構與生理功能

ALK是酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase,RTK)家族中的一員,它主要在發育的神經系統中表達。受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTKs)是主要存在于細胞表面的一種有內源性蛋白酪氨酸激酶活性的酶聯受體,即其既為受體,同時也是酶,它能夠與配體相結合,并使靶蛋白的酪氨酸殘基發生磷酸化。此類激酶的分子結構特點是：1) 胞外配體結合區：可以與特定配體相結合;2) 跨膜區：由一個疏水的單次α螺旋組成;3) 胞內配體結合區：酪氨酸激酶催化結構域及調控序列,見Fig 1。

Fig 1 Structure of ALK

ALK分子量預計為177 ku[7]。254個氨基酸激酶結構域由1 123至1 376位氨基酸殘基組成,在此之前是一個由氨基酸組成的短跨膜區。在小鼠體內的表達形式提示 其在中樞和以及外周神經系統的發育中起作用。在果蠅中發現,ALK以配體結合的形式促進腸管肌肉組織形成,哺乳動物配體尚未確定,在人類視網膜中檢測到ALK蛋白質。 研究發現ALK在成人中參與能量和體質量調控。表達 ALK 蛋白的基因位于 2 號染色體的短臂上,包含29個外顯子。編碼1 620個氨基酸蛋白表達ALK蛋白的ALK基因主要在胚胎期表達(合成蛋白質),它的作用是促進神經細胞增殖,在腦和外周神經系統的發育過程中起作用,ALK 在神經系統發育完善后即被關閉,因此正常情況下成人體內 ALK 處于休眠狀態,亦不表達蛋白。ALK異常激活是癌癥發生的原因之一,尤其在兒童成神經細胞瘤中,約12%的惡性腫瘤與ALK相關。ALK具有不同于RTK家族其他成員的胞外結構域,其近膜端富含甘氨酸的結構域(glycine-rich domain,GRD),它只在ALK和同家族的LTK(leukocyte tyrosine kinase)中存在,并且是配體結合并誘導ALK/LTK激活的充要條件,見Fig 2。

Fig 2 Downstream signaling pathways of ALK

2 ALK抑制劑的研究狀況

2.1 ALK抑制劑的研究背景ALK抑制劑的研究存在兩個方向：第一個是靶向小分子抑制劑,另外一個是近兩年興起的蛋白降解靶向嵌合體(proteolytic targeting chimera,PROTAC)。

靶向藥物是針對腫瘤基因開發的,它能夠識別腫瘤細胞上由腫瘤細胞特有的基因所決定的特征性位點,通過與之結合(或類似的其他機制),阻斷腫瘤細胞內控制細胞生長、增殖的信號傳導通路,從而殺滅腫瘤細胞、阻止其增殖。由于這樣的特點,靶向藥物不僅效果好,而且副作用要比常規的化療方法小得多。使用靶向藥物的治療方法稱為“靶向治療”,靶向小分子抑制劑的作用是阻斷蛋白的功能。

PROTAC是藥物研發領域的一個新的方向,很多無法用小分子調控或抗體無法達到的靶點可以采用PROTAC技術進行調控。傳統小分子藥物的作用是阻斷蛋白的功能,而該項技術的核心是力圖將小分子化合物設計成為一種新型藥物,通過將蛋白送入蛋白酶體并使其降解。PROTAC作為異雙功能分子,由蛋白配體、E3連接酶配體和linker 3部分組成,linker一端與E3連接酶結合的配體連接,另一端與靶蛋白結合的配體連接。

2.2 靶向ALK小分子抑制劑現狀目前ALK抑制劑有：2011 年上市的克唑替尼(crizotinib),它是治療 ALK陽性 NSCLC的第一個 ALK抑制劑,隨后開發了抑制能力更強的二代 ALK抑制劑色瑞替尼(ceritinib)、阿來替尼(alectinib)和布加替尼(brigatinib),這4個ALK抑制劑已被FDA批準上市。勞拉替尼(lorlatinib)是一種新型的第三代ALK抑制劑,2018 年相繼在日本和美國獲批上市,2019年在歐盟獲批,2020 年 2 月在中國香港獲批上市。

布加替尼(brigatinib)：布加替尼是另一種第二代ALK抑制劑,與其他抑制劑不同,它對具有耐藥性相關突變的腫瘤具有廣泛的抑制特性。在Huang等[8]的一項研究中,利用工程細胞系和癌源細胞系比較了酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)的細胞和體內活性。這項研究證明了布加替尼在體外和體內的效力優于克唑替尼(比克唑替尼強12倍)。且對所有已知的17個ALK次生突變具有優越的抑制特性(包括G1202R)。細胞實驗的結果表明,布加替尼與克唑替尼、阿來替尼和艾樂替尼相比具有更高的抑制特性。

勞拉替尼(lorlatinib)：勞拉替尼作為三代ALK-TKI,臨床前研究顯示,勞拉替尼可以克服包括G1202R在內的多種ALK耐藥突變,是一、二代ALK-TKI耐藥后的有效選擇[9]。CROWN研究將勞拉替尼和克唑替尼作為一線治療方法進行比較,結果顯示二者的中位隨訪時間分別為18.3個月以及14.8個月,可以考慮將其用作ALK陽性患者的一線治療[10-11]。

臨床前研究顯示,TPX-0131對已獲批準的ALK-TKI的耐藥突變有效,特別是G1202R、L1196M和復合突變(如G1202R/L1196M和G1202R/L1198F),在抑制EML4-ALK磷酸化方面與勞拉替尼的效力相似,在G1202R、復合突變方面的抑制效力明顯高于勞拉替尼。

同樣作為第四代ALK-TKI的NUV-655,臨床前研究表明,NUV-655對已獲批準的ALK-TKI的耐藥突變高度敏感,包括G1202R、G1202R/L1196M、G1202R/G1269A和G1202R/L1198F復合突變。恩曲替尼作為ALK、TrkA-C和ROS1-TKI,現有研究顯示,與其他TKIs相比,恩曲替尼似乎并沒有優勢。瑞波替尼[12]作為ALK、TrkA-C和ROS1-TKI,它可以克服ALK、TrkA-C和ROS1獲得性突變而產生的耐藥性。目前,瑞波替尼的臨床活性還需進一步驗證。

CT-707是國產新型的二代ALK-TKI,可用于初治或克唑替尼耐藥后的患者。NCT02695550[13]研究初步證明CT-707對ALK陽性的中國患者有效,目前該研究還在進行當中。WX-0593[14]是國內自主研發的新型ALK、ROS1-TKI,目前已經完成I期臨床研究,WX-0593顯示出較大的發展潛力。

PLB1003[15]是基于EML4-ALK融合基因抗藥性增強而開發的高效二代ALK-TKI。臨床前數據顯示,PLB1003是安全有效的,對克唑替尼耐藥的患者有潛在的臨床獲益。

2.3 關于ALK 相關PROTAC的研究現狀酪氨酸激酶受體ALK首先在與間變性大細胞淋巴瘤有關的染色體異位中被發現。致癌性ALK對多種癌癥的發生和進展具有重要影響,例如NSCLC、彌漫性大B細胞淋巴瘤、腎細胞癌和神經母細胞瘤。因此,ALK已成為重要的抗癌靶標。近年來,人們開發了許多小分子蛋白降解靶向嵌合體PROTAC,例如：TL13-12、TL13-112、TL13-33、MS4077、MS4078、TL13-110,見Fig 3。

Fig 3 Chemical structure of ALK PROTAC

這些降解產物是通過結合已知的嘧啶類ALK抑制劑TAE684或LDK378,以及小腦配體泊馬度胺而開發的。經過證明,在某些細胞類型中,藥物轉運蛋白ABCB1的表達降低了降解效價。此外,蛋白質組學分析表明,這些化合物還能促進其他激酶的降解,包括PTK2 (FAK)、Aurora A、FER和RPS6KA1 (RSK1)。

ALK的激活與許多類型的人類癌癥有關。然而,在使用這些抑制劑治療的大多數患者中觀察到耐藥性。因此,需要新的治療策略(例如具有新的作用機制的化合物)來解決耐藥性問題。新興的PROTAC技術已成功應用于多種蛋白質靶標的選擇性降解,但尚未應用于ALK。由于ALK蛋白水平對哺乳動物的生存能力的影響不大,ALK PROTAC可能成為具有最小毒性的新治療方法。MS4077和MS4078在淋巴瘤細胞SU-DHL-1和肺癌細胞NCI-H2228中以濃度和時間依賴的方式有效地降低了致癌活性ALK融合蛋白的細胞水平?；衔颩S4077和MS4078誘導ALK蛋白降解具有腦和蛋白酶體依賴性。此外,化合物MS4077和MS4078對增殖有較強的抑制作用[16]。在ALK陽性的NSCLC細胞系H3122中,TL13-12、TL13-112、TL13-110[17],顯示出改善其親本抑制劑的藥效學特性的能力,特別是對下游ALK信號的持續抑制,表明降解物是一個有希望的靶向ALK治療的新途徑。它們是研究ALK藥理降解作用的重要化學工具。我們的研究為開發下一代ALK PROTAC奠定了基礎[18]。

3 ALK在NSCLC中的治療現狀

3.1 ALK與NSCLC的關系近年來,伴隨著細胞生物學的發展,人們對NSCLC靶向治療的研究推進到了一個新的階段,一些新型的藥物作用靶點的發現,為癌癥治療提供了新的治療策略,如：EGFR抑制劑、抗VEGF/VEGFR單克隆抗體、多靶點治療藥物等。目前,探究高效、低毒且高選擇性的靶向抗NSCLC藥物已成為了研發的主攻方向,其中表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKIs)為目前研究的熱點之一[19]。但是隨著第一代EGFR抑制劑的使用,不少患者出現了耐藥突變和旁路激活,其中就有ALK通路的激活。

在NSCLC患者中發現了ALK調節異常,它通常以EML4-ALK基因融合的形式來發生。ALK是繼EGFR之后在NSCLC中發現新的靶向治療的靶點。大約有3%～7%的NSCLC患者發生ALK融合基因[20]。ALK在我國NSCLC中的發生率約5.6%,男女患者比例相近,且常與其他驅動基因突變如EGFR、KRAS、ROS1等互斥,其中腺癌的發生率為6.6%～9.6%,鱗癌的發生率為3.7%,最初被確定為融合蛋白的NPM-ALK造成的再生障礙性大細胞淋巴瘤(ALCL) 2號和5號染色體相互易位的結果。而后,ALK篩選融合基因被發現作為炎性肌成纖維細胞腫瘤和彌漫性大B細胞淋巴瘤驅動因素。雖然這些早期發現ALK作為一種有效的致瘤藥物靶點,但是一直到2007年前這個觀點尚未被充分認可。直到發現EML4-篩選融合蛋白大約在NSCLC中占據5%,考慮到NSCLC患者數量龐大,在美國估計每年ALK+肺癌患者超過8 000人,這表明存在著一個重要的未被滿足的醫療需求。到目前為止,已被報道的存在擴增或激活ALK基因的點突變的癌癥有成神經性細胞瘤、卵巢癌、退行性的甲狀腺癌癥等[21]。ALK突變雖然在NSCLC中突變頻率不高,但是ALK突變一般會發生腦轉移,發生腦轉移后,普通的藥物無法穿透血腦屏障,這個時候體現了ALK抑制劑的優越性。

3.2 ALK在NSCLC中的基因融合形式ALK的基因融合在漸變性大細胞淋巴瘤中主要有NPM-ALK以及X-ALK,在多數研究中發現抗NPM-ALK以及X-ALK的抗體都對ALK+的漸變性大細胞淋巴瘤有效。ALK的基因融合在NSCLC中主要有EML4-ALK,可以發現抗EML4-ALK的抗體在NSCLC中對EML4-ALK基因融合有效[22]。目前NSCLC中存在多種ALK融合變異類型,除最常見與EML4融合外,也可以與TFG、KLC1、SOCS5、H1P1、TPR、BIRC6等基因融合。

3.3 ALK抑制劑在NSCLC中的CAR-T治療細胞治療主要集中在CAR-T方面,目前CAR-T治療主要集中在血液腫瘤,對實體腫瘤的治療并沒有明確的突破。2021年,中國批準了藥明巨諾靶向CD19的CAR-T產品銳基奧侖賽注射液。越來越多的臨床試驗開始嘗試將CAR-T療法用于治療實體瘤,關鍵點就是實體瘤靶點的選擇,目前研究還處于早期階段。美國的臨床數據顯式,已有200多項關于CAR-T的研究,但只有9項涉及CAR-NK。在中國,大多數的企業產品都是針對CD19這一個靶點的。

CAR-T療法已在ALK中已取得了良好的應用,可以適用到NSCLC中來,CAR-T細胞(嵌合抗原受體T細胞)領域在過去的5年里已經發展起來,對B細胞惡性腫瘤有較好的效果,但在開發這些治療PTCL的療法方面存在挑戰。這些問題包括PTCL(外周T細胞淋巴瘤)中缺乏特異性的腫瘤靶點,注入的CARs能殺死正常的T細胞,自體T細胞產品被腫瘤細胞污染,以及對正常T細胞免疫功能消融的擔憂,這些都阻礙了該領域的發展。然而,最近在克服這些挑戰和臨床試驗方面取得了進展。

3.4 ALK與免疫治療的關系及相關治療方式為了識別在腫瘤發生過程中調節Hippo通路的新型激酶,還成功地使用這種NanoLuc 生物傳感器進行了激酶類抑制劑篩選,并識別了幾種調節Hippo通路的激酶。最重要的是,我們驗證了RTK,在這項研究中明確了ALK通過介導JAK-STAT3-LATS-YAP/TAZ-PD-L1信號通路引起免疫逃逸增強和腫瘤發生。對免疫反應和腫瘤發生過程中這一新發現的信號軸的進一步表征將有助于闡明ALK-Hippo通路參與癌癥進展和治療的分子機制。

大腫瘤抑制因子NanoLuc 生物傳感器具有極高的靈敏度和穩定性。因此,它在監測LATS激酶和Hippo通路的動力學和活性方面具有廣泛的應用前景。此外,確認YAP/TAZ-PD-L1作為一種新型的下游信號轉導軸,介導免疫逃逸中的ALK功能。發現為其他科學家和臨床醫生提供了一種針對Hippo成分YAP/TAZ單獨或聯合ALK的新策略,以獲得更有效的治療RIK家族ALK作為Hippo通路調節腫瘤發生和免疫逃逸的新調節因子[23]。

生物療法在腫瘤的聯合治療中越來越重要,腫瘤疫苗作為生物療法的重要手段,是近年來的研究熱點,研究進展非常迅速。臨床應用方面,腫瘤疫苗主要作為手術、放療和化療后的輔助治療,幫助預防癌癥的復發和轉移,另外,已有作用較好的預防性腫瘤疫苗投入了大規模使用,如人乳頭瘤狀病毒(HPV)疫苗的應用已經非常廣泛。臨床研究方面,已開展大量關于腫瘤疫苗或與其它生物療法聯用的臨床試驗,美國臨床試驗數據庫中與疫苗相關的臨床試驗約1/3與腫瘤疫苗相關。腫瘤疫苗作為近年新興的一種免疫療法,臨床應用頻率落后于其它幾類免疫治療的方法,但具有廣泛的應用前景,雖然就目前的研究發現腫瘤疫苗的發展具有一定的局限。但總體而言,目前已有的絕大多數腫瘤免疫疫苗安全性和反應性良好,隨著臨床標準的不斷完善和技術層面的突破,有望在未來成為腫瘤精準醫療大趨勢下的一類重要的腫瘤治療方式[24]。

用于治療NSCLC的 CIMAVAX-EGF 疫苗在古巴已進行臨床試驗,并已獲中國國家食品藥品管理局的批準在中國醫學科學院進行臨床試驗。CIMAVAX-EGF肺癌疫苗是世界上唯一注冊的此類藥品。ALK作為酪氨酸激酶家族中的一員,有望繼CIMAVAX-EGF的基礎上開發出新的疫苗。

古巴分子免疫中心主任說,新疫苗 Racotumomab( 雷妥莫單抗)使用方便,在臨床試驗中顯示出 "激動人心 "的效果,并在歐洲腫瘤內科學會大會上獲得廣泛認可。

Racotumomab今年將開始批量生產,這將使更多的古巴肺癌患者獲得及時的干預和治療,它在海外的注冊也已進入日程。Racotumomab的研發使古巴繼續在世界范圍內的肺癌治療領域保持領先地位。古巴是目前世界上唯一一個研究開發出兩種肺癌疫苗的國家。

全球腫瘤“治療性疫苗”研發遍地開花,并取得了相當不錯的臨床數據。2020年4月1日,國外有公司宣布其新型抗癌疫苗 Tedopi在NSCLC的三期臨床試驗耐藥或失敗后,二線或三線使用Tedopi疫苗,一年總體生存率達到46%,遠超預設的25%[25]。

目前,在研的腫瘤疫苗臨床試驗有200多項,其中個體化的腫瘤疫苗也是重要的方向,具有巨大的潛力。

4 未來展望和結論

小分子靶向ALK抑制劑在目前的使用中存在耐藥問題,在將來的研究中,如何解決耐藥問題,設計出更高效的ALK抑制劑。目前在免疫治療中都存在皮疹等一系列的副作用,后期在抗腫瘤藥物的設計中如何避免這一副作用。在傳統的靶向治療中存在著一系列的耐藥突變的副作用,目前PROTAC小分子的設計中,有很多進入了臨床試驗階段,但是到目前為止都沒有PROTAC小分子進入臨床,PROTAC是否具有臨床應用價值仍值得商榷。雖然ALK在間變性淋巴瘤中已有廣泛的應用,在NSCLC中雖然已報道有多種技術可以用來靶向降解EGFR蛋白,但目前仍以基于蛋白降解系統的PROTAC技術的特異性最好。因為PROTAC技術在應用中可以采用針對肺癌中激酶區突變特異有效的小分子來進行蛋白降解藥物的設計,而其他已報道的EGFR降解技術理論上均不能很好地區分野生型和激酶區突變的EGFR,這些技術對EGFR的選擇性降解有待進一步研究,在后期應用中的毒副作用也有待評估。近年來,多個免疫檢查點抑制劑的獲批上市以及多個腫瘤免疫臨床試驗獲得的成功,帶動了腫瘤免疫治療的發展,然而腫瘤免疫治療領域還存在很多未解決的問題,如只針對某些特定的腫瘤有作用、總體臨床應答率低、腫瘤免疫治療后的復發等問題,有待進一步的解決。

本文從ALK的結構和生理功能,ALK的小分子抑制劑,ALK的生物學功能及其與NSCLC相關的應用現狀進行綜述,并展望了未來的發展方向。全面、系統地闡述 ALK相關的發展和目前存在不足之處,將為ALK機制研究和新的臨床治療手段的發現提供重要理論依據和實驗依據,將推動本領域的發展從而使ALK更好地應用于NSCLC的治療并為NSCLC患者帶來福音。