基于全長轉錄組的蠶豆WRKY基因家族分析及耐鹽脅迫相關候選基因挖掘

周恩強, 周 瑤, 姚夢楠, 王學軍, 趙 娜, 繆亞梅, 王永強, 薛 冬, 李 波,汪凱華, 顧春燕, 魏利斌

(江蘇沿江地區農業科學研究所,江蘇 南通 226012)

非生物脅迫,包括鹽脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫等,限制了作物的生產力,并影響了植物中許多基因的表達[1],其中鹽脅迫是制約全球農業發展和作物生產的最重要因素之一[2]。鹽脅迫使植物遭受離子毒性、滲透脅迫和氧化脅迫,從而破壞各種細胞和生理過程。為了適應或抵抗鹽脅迫,植物進化出幾種策略,包括滲透調節(如滲透保護劑積累)、離子平衡 (Na+/K+平衡)和抗氧化(抗氧化酶的積累和活性的增強)[3]。植物對鹽脅迫的適應性也可以通過復雜的信號通路改變許多基因的表達來實現,研究發現bZIP、WRKY、MYB等家族的轉錄因子通過結合特定的順式作用元件形成一個復雜的調控網絡,對植物的鹽脅迫反應至關重要[4-6],這些轉錄因子過表達通常會增加植物對鹽脅迫的適應性。

WRKY轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一,通過與保守的 DNA 結合位點W-box結合來調控基因的轉錄,在植物的生長發育、生物與非生物脅迫響應中發揮著多種作用[7]。所有的WRKY蛋白由1個或2個約60個氨基酸的WRKY保守結構域組成,其 N 端具有高度保守的WRKYGQK七肽序列,C 端具有 C2H2基序或 C2HC基序的鋅指結構[8]。根據WRKY結構域的數量和類鋅指基序的特征可將WRKY基因家族分為3組(I、II和III),第I組具有2個WRKY結構域,第II組具有1個WRKY結構域和C2H2基序,第III組具有1個WRKY結構域和C2HC基序[9]。目前WRKY基因家族已在多種植物中被鑒定出,其中擬南芥鑒定出72個WRKY基因[8],水稻中包含102個WRKY基因[10],大豆基因組中鑒定出197個WRKY基因[11],油茶中鑒定出89個WRKY基因[12],綠豆中鑒定出79個WRKY基因[13]。同時研究結果表明,WRKY轉錄因子基因在多種植物的鹽脅迫響應中發揮著重要作用,例如,在擬南芥中過表達陸地棉GhWRKY34增強了擬南芥轉基因植株的耐鹽性[14];在煙草中過表達NbWRKY79增強了植株鹽脅迫耐受性;在玉米中抑制ZmbZIP111的表達提高了玉米幼苗對鹽脅迫的敏感性[15]。

WRKY轉錄因子基因參與植物生長發育的多個方面,在鹽脅迫的多種不同響應途徑中發揮重要作用,在模式植物擬南芥中,已發現多個受鹽脅迫調控的WRKY基因。Babitha等[16]研究發現共表達AtbHLH17和AtWRKY28能夠增強擬南芥對氯化鈉、甘露醇脅迫和氧化脅迫的耐受性。在鹽脅迫和脫落酸(ABA)處理下,相比于野生型,Atwrky66突變體表現出對ABA和鹽脅迫更高的敏感性[17]。Atwrky25突變體與Atwrky33突變體的鹽脅迫敏感性與野生型沒有太大差異,但過表達AtWRKY25或AtWRKY33增加了擬南芥對氯化鈉脅迫的耐受性[18]。研究發現JMJ15通過調控AtWRKY46和AtWRKY70的表達水平來增強其耐鹽性,并證明AtWRKY46和AtWRKY70在鹽脅迫中起負調控作用[19]。在鹽脅迫下,AtWRKY1的表達被誘導,且AtWRKY1功能缺失導致了突變體擬南芥的鹽敏感性增加[20]。Li等[21]利用基因編輯技術(CRISPR/Cas9)對AtWRKY3和AtWRKY4進行了編輯,發現突變體對鹽和茉莉酸甲酯(MeJA)脅迫的耐受性降低。與野生型相比,過表達AtWRKY30的擬南芥植株對氧化脅迫和鹽脅迫表現出更強的耐受性[22]。AtWRKY9通過調控AtCYP94B3和AtCYP86B1來控制軟木脂的沉積,從而增加擬南芥的耐鹽性[23]。Chen等[24]通過對AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60進行單突、雙突、三突和過表達分析發現,AtWRKY18和AtWRKY60對抑制種子萌發和根系生長有積極作用,同時2個WRKY基因也提高了擬南芥對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性。擬南芥AtWRKY8主要在根中表達,并在鹽處理后顯著上調表達,AtWRKY8的功能缺失使擬南芥在鹽脅迫環境下受到抑制作用,表現出萌發延遲,并且抑制萌發后的生長發育[25]。在鹽脅迫條件下,與野生型相比,Atwrky11和Atwrky17突變體的萌發速度較慢,根系生長受損,表現出鹽脅迫敏感性[26]。

蠶豆(ViciafabaL.)屬于豆科野豌豆屬一年生或越年生草本植物[27],因其較高的營養價值和有效的生物固氮作用在作物生產中占據著重要地位。隨著人們生活質量的不斷提高,市場對蠶豆的需求呈增加和多樣化趨勢[28],由于中國耕地資源有限,糧、菜、油爭地矛盾突出,現有的蠶豆種植面積已無法滿足蠶豆生產發展的需求,可以通過挖掘基因資源、培育適宜鹽堿地種植的蠶豆新品種,從而擴大蠶豆種植面積來滿足市場需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的蠶豆品種啟豆2號種植于江蘇沿江地區農業科學研究所種植基地。采集根(盛花期)、莖葉(盛花期)、花(盛花期)、種子(開花后20 d、30 d、40 d)、果皮(開花后20 d、30 d、40 d)等樣本保存于液氮中備用。委托北京百邁客生物科技有限公司進行二代轉錄組(9個樣本,3次重復,27個樣品)和全長轉錄組(9個樣本RNA等量混合)測序、檢測、分析等。

1.2 全長轉錄組數據處理

根據條件fullpasses(全票)≥3且序列準確性大于0.9從原始序列提取CCS(Circular consensus sequencing read)序列,并對CCS序列進行校正。檢測CCS序列中是否包含5′引物、3′引物及poly A尾,3個都包含的為全長非嵌合序列(Full-length no chimera, FLNC)。使用SMRTLink軟件中的IsoSeq模塊將全長非嵌合序列中相似的序列聚類到一簇(Cluster),每個Cluster得到一個一致序列(Consensus isoform),通過minimap2將得到的校正后的一致序列與蠶豆Tiffany參考基因組(https://projects.au.dk/fabagenome/genomics-data)進行序列比對(設置參數-ax splice -uf --secondary=no -C5),使用cDNA Cupcake軟件對比對結果去冗余,過濾Identity(一致性)小于0.9、Coverage(優勢度)小于0.85的序列,合并僅5′端外顯子有差異的比對,最終得到非冗余轉錄本。

1.3 VfWRKY基因家族成員的鑒定

本研究以蠶豆全長轉錄組為研究對象。在 pfam 蛋白質家族數據庫(http//pfam. xfam. org/)中查找獲取WRKY基因家族保守結構域的序列號(PF03106),并下載其對應的隱馬爾可夫模型文件[29],利用TBtools軟件在蠶豆全長轉錄組蛋白質序列中初步檢索具有WRKY保守結構域的WRKY轉錄因子。分別從擬南芥(https://www.arabidopsis.org/index.jsp)和PlantTFDB v5.0(http://planttfdb.gao-lab.org/index.php)網站下載擬南芥和蒺藜苜蓿的WRKY家族基因序列,并將其比對到蠶豆全長轉錄組中獲取序列相似性最高的基因。將獲取的WRKY蛋白質序列提交到NCBI CDD(https://www. ncbi. nlm. nih. gov/cdd)數據庫,明確是否含WRKY保守結構域,并剔除重復、冗余和注釋不完整的序列,保留下來的轉錄因子即為蠶豆WRKY家族成員。

1.4 VfWRKY基因家族成員理化性質及亞細胞定位分析

利用TBtools軟件計算蠶豆WRKY家族成員編碼蛋白質的氨基酸大小、相對分子質量、等電點、不穩定指數、脂肪系數和親疏水性。利用在線網站Cell-PLoc 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)對WRKY家族成員進行亞細胞定位預測。

1.5 VfWRKY基因家族成員保守結構域及系統進化分析

提交擬南芥和蠶豆WRKY家族基因蛋白質序列到MEGA 7. 0軟件中進行多重比對,將比對結果使用最大似然法(Maximum likelihood,ML)構建進化樹。提交進化樹參數到網站Evolview(https://evolgenius.info//evolview-v2/#login)上美化進化樹[30],并根據擬南芥WRKY基因家族分類方法進行分組[8]。單獨提交蠶豆WRKY家族基因蛋白質序列到MEGA 7. 0軟件中進行多重比對,使用最大似然法構建進化樹,將進化樹參數和WRKY家族基因保守結構域信息輸入到TBtools軟件中進行數據可視化分析[31]。

1.6 VfWRKY基因家族成員染色體分布及Motif鑒定

將113個WRKY基因家族成員的基因編號提交到TBtools軟件中,即可將每個基因定位到相應的染色體上。使用在線軟件MEME(https://meme-suite. org/meme/tools/meme)預測蠶豆WRKY基因的保守基序[32],Motif最大值設置為10。下載Motif分析文件與蠶豆進化樹參數共同提交到TBtools軟件中進行數據可視化分析。

1.7 VfWRKY基因家族成員GO富集和KEGG通路分析

利用BLAST比對工具,將蠶豆WRKY家族轉錄本與基因本體(Gene Ontology,GO)(http://www.geneontology.org/)和KEGG(https://www.kegg.jp/)公共數據庫進行比對,從而得到WRKY蛋白功能注釋信息,并將該注釋信息提交到百邁客云在線分析平臺(https://international.biocloud.net/zh/software/tools/)進行可視化分析。

除了現有研究已經涉及的高唐神女、觀音、阿尼瑪、魚、力、死亡與再生、大地母親與智慧老人等原型，沈從文的小說中還存在許多值得探究的原型。比如，《媚金·豹子與那羊》《月下小景》等小說是沈從文根據湘西神話故事改編而來的，其中涉及“難題求婚”的文學母題。又如，沈從文筆下有許多雄健俊美的男子，《漁》中的孿生兄弟、《邊城》中的天保、儺送兄弟等，這類反復出現的男子形象，也可能蘊藏著某種原型。所有這些都有待學者們的深入探討。

1.8 蠶豆鹽脅迫候選WRKY基因的挖掘

通過文獻查找模式植物擬南芥中與鹽脅迫相關的WRKY基因,下載其蛋白質序列與蠶豆WRKY蛋白序列進行同源比對,從而獲得蠶豆鹽脅迫相關候選WRKY基因。利用全長轉錄組表達量數據對鹽脅迫相關候選WRKY基因進行表達模式分析。

2 結果與分析

2.1 全長轉錄組數據統計

通過 PacBio高通量測序技術對啟豆2號的根、莖葉、花、種子、果皮等組織進行全長轉錄組測序,共獲得53.84 Gb原始數據。全長轉錄組測序獲得474 220條環形一致性序列 (CCS),平均長度1 936 bp,分布于1 000～1 499 bp的CCS數量最多,為121 790條(圖1a);全長非嵌合序列(FLNC)有390 912條,平均長度1 646 bp,分布于500～999 bp的FLNC數量最多,為100 818條(圖1b)。對全長非嵌合序列進行聚類和去冗余分析,最終得到58 885條轉錄本序列,其中新轉錄本數量為42 019個,平均長度為2 209 bp,分布于81～9 800 bp,主要集中在500～2 499 bp區間內,1 000～1 499 bp數量最多,為6 696個轉錄本(圖1c);我們對新發現的42 019個轉錄本進行序列結構分析,預測出26 438條完整開放閱讀框(Open reading frame,ORF)序列,平均長度為1 038 bp,分布于500 bp以下的ORF數量最多,為9 257條(圖1d)。

a:環形一致性序列(CCS)長度分布;b:全長非嵌合序列(FLNC)長度分布;c:新轉錄本長度分布;d:開放閱讀框(ORF)長度分布。a1:<500;a2:500～999;a3:1 000～1 499;a4:1 500～1 999;a5:2 000～2 499;a6:2 500～2 999;a7:≥3 000;b1:<500;b2:500～999;b3:1 000～1 499;b4:1 500～1 999;b5:2 000～2 499;b6:2 500～2 999;b7:≥3 000;c1:<500;c2:500～999;c3:1 000～1 499;c4:1 500～1 999;c5:2 000～2 499;c6:2 500～2 999;c7:3 000～3 499;c8:≥3 500;d1:<500;d2:500～999;d3:1 000～1 499;d4:1 500～1 999;d5:2 000～2 499;d6:≥2 500。

2.2 VfWRKY轉錄因子家族的鑒定及理化性質分析

基于蠶豆全長轉錄組數據,在TBtools軟件中使用pfam程序搜索出121個WRKY轉錄本,經數據庫比對以及去除冗余和缺失序列的轉錄因子,最終鑒定篩選出113個WRKY轉錄本,并重新命名為VfWRKY1～VfWRKY113,其中相對蠶豆Tiffany參考基因組新發現WRKY轉錄本31個(以PB命名)。VfWRKY轉錄因子基因家族編碼的蛋白質的理化性質見表1,蠶豆113個WRKY轉錄因子編碼的氨基酸數目最小為VfWRKY61(153 aa),最大為VfWRKY36(737 aa);相對分子質量為17 729.49～81 727.72;等電點為4.84～9.87,76個蛋白質等電點小于7.00,為酸性蛋白質,37個蛋白質等電點大于7.00,為堿性蛋白質;不穩定指數為29.87～67.85,7個蛋白質不穩定指數小于40.00,為穩定蛋白質,106個蛋白質不穩定指數大于40.00,為不穩定蛋白質;脂肪系數為45.60～81.99;平均親疏水性為-1.42～-0.40,均小于 0,表明蠶豆113個WRKY家族蛋白質均屬于疏水性蛋白質。亞細胞定位預測發現113個WRKY家族蛋白質均定位于細胞核中,間接證明113個WRKY基因作為轉錄因子調控下游基因的表達。

表1 蠶豆WRKY 轉錄因子家族成員信息

續表1 Continued 1

續表1 Continued 1

2.3 VfWRKY家族成員染色體分布及系統進化分析

為更好地了解蠶豆WRKY基因家族系統發育關系,我們利用最大似然法構建了71個擬南芥WRKY蛋白和113個蠶豆WRKY蛋白的系統發育樹,并根據Eulgem等[8]的分類方法將蠶豆WRKY家族成員分為group 1～group 3,group 1具有2個WRKY結構域,group 2具有1個WRKY結構域和C2H2基序,group 3具有1個WRKY結構域和C2HC基序。系統發育樹分析結果顯示,group 1、group 2、group 3分別包含38個(VfWRKY1～VfWRKY38)、61個(VfWRKY39～VfWRKY99)和14個(VfWRKY100～VfWRKY113)VfWRKY基因,group 3包含的基因數目最少,且與擬南芥13個WRKY基因聚在同一亞家族中。同時我們發現除group 1中VfWRKY16～VfWRKY19與group 2中VfWRKY基因聚在同一分支上外,其他group 1和group 2WRKY家族成員與擬南芥該亞家族成員都能夠很好地聚在同一分支上(圖2)。

圖2 蠶豆和擬南芥WRKY基因系統發育分析

我們將VfWRKY16～VfWRKY19與VfWRKY29(5個基因同為Vfaba.Tiffany.R1.2g038280的轉錄本)進行多序列比對發現5個基因的第一個WRKY結構域都為WRKYGQK-C2-HDH(完整),但VfWRKY16、VfWRKY17、VfWRKY18和VfWRKY19的第二個WRKY結構域只有WRKYGQK-(VfWRKY29的第二個WRKY結構域具有完整的WRKYGQK-C2-H2結構),所以這4個基因聚集在group 2分支是由于第二個結構域缺少C2-H2序列(圖3)。

標記處表示WRKY結構域氨基酸序列。

由于所使用的軟件或數據本身具有局限性,導致所選參考基因組注釋往往不夠精確,這樣就有必要對原有注釋的基因結構進行優化。我們通過gffcompare軟件與蠶豆Tiffany參考基因組注釋進行比較,將已知基因和轉錄本保留原身份標識號(ID),將新基因和新轉錄本保留PB格式的ID添加到注釋中,最終我們得到包含新基因和新轉錄本的優化參考基因組注釋文件。利用優化參考基因組注釋文件提取位置信息繪制WRKY家族成員在染色體上的物理分布(圖4)。蠶豆由12條染色體組成,每兩條染色體為1對,共6對,其中染色體1包含染色體1L和染色體1S。113個WRKY轉錄本不均勻地分布在7條染色體上,染色體1擁有的WRKY家族成員最多,為38個,其中染色體1L有29個,染色體1S有9個; 染色體2擁有WRKY家族成員 24個,染色體5擁有WRKY家族成員19個,染色體4擁有WRKY家族成員13個,染色體6 擁有WRKY家族成員11個,染色體3擁有WRKY家族成員數量最少,為8個。

2.4 VfWRKY家族保守結構域和保守基序鑒定

113個VfWRKY蛋白包含3種保守結構域,分別為WRKY、Plant_zn_clust、PTZ00265。其中VfWRKY54、VfWRKY64、VfWRKY67、VfWRKY72、VfWRKY77、VfWRKY78和VfWRKY82含有WRKY和Plant_zn_clust結構域,并且7個基因聚在同一分支上;VfWRKY14、VfWRKY15、VfWRKY27和VfWRKY28含有WRKY和PTZ00265結構域,其余102WRKY基因都只包含WRKY結構域(圖5)。同時我們發現group 2和group 3中的61個和14個WRKY轉錄本都只含有1個WRKY保守結構域,并且分別聚集在同一分支上;group 1的38個WRKY轉錄本都含有2個WRKY保守結構域,但VfWRKY16、VfWRKY17、VfWRKY18和VfWRKY19的第二個WRKY結構域長度不完整(圖5)。

在一個基因家族中,基因的保守基序可以反映該基因家族成員之間的進化關系和功能。我們利用在線網站MEME分析了VfWRKY基因家族的保守基序,并使用TBtools進行了可視化分析(圖6)。VfWRKY基因家族共含有10個Motif,其中不同的WRKY基因含有Motif的數量為2～10個,VfWRKY39和VfWRKY44只含有2個Motif,VfWRKY12、VfWRKY13、VfWRKY22、VfWRKY29、VfWRKY30和VfWRKY31含有的Motif最多,為10個。通過序列查詢發現Motif 1和Motif 3與WRKY結構域相對應,group 2和group 3中有71個WRKY轉錄本含有Motif 1,只有VfWRKY39、VfWRKY43、VfWRKY44和VfWRKY46含有Motif 3;group 1中37個基因同時含有Motif 1和Motif 3,只有VfWRKY34含有2個Motif 1。每個WRKY亞家族都具有相對穩定的Motif,其中group 1亞家族有33個基因(在group 1中占比86.8%)同時含有Motif 3、Motif 6、Motif 7、Motif 1、Motif 4、Motif 2和Motif 5;group 2亞家族被分為2個分支,分支1有29個基因(在group 2中占比47.5%)同時含有Motif 1、Motif 4、Motif 2和Motif 5,分支2有27個基因(在group 2中占比44.3%)同時含有Motif 7、Motif 1、Motif 4、Motif 2和Motif 5;group 3亞家族所有基因都含有Motif 1、Motif 4和Motif 2。VfWRKY16、VfWRKY17、VfWRKY18和VfWRKY19的Motif數量與保守結構域長度相對應,相對group 1亞家族成員缺少了Motif 4、Motif 2和Motif 5(圖6)。

圖4 蠶豆WRKY基因在染色體上的分布

圖5 蠶豆WRKY家族成員保守結構域分析

圖中色塊上1～10表示motif序號。

2.5 VfWRKY家族成員GO功能注釋及KEGG通路分析

將VfWRKY家族的113個WRKY轉錄本與GO 數據庫進行比對分析,結果顯示,113個WRKY轉錄本都得到了注釋(圖7a)。按照GO功能分類方式,將113個WRKY轉錄本分為生物過程(Biological process)、細胞組分(Cellular component)和分子功能(Molecular function)3大類。3個大類可細分為20個二級分類,其中生物過程包含的二級分類最多,為16個不同的亞類,主要包括轉錄調控(DNA和RNA模板轉錄)、代謝過程的調控(大分子、細胞、化合物和RNA等)、生物合成過程的調控(細胞、大分子和RNA等);分子功能注釋基因占比最多,為112個WRKY轉錄本,主要包括DNA結合轉錄因子活性和序列特異性DNA結合2個功能;細胞組分包含的二級分類最少,主要為細胞核(29個轉錄本)。

在KEGG 數據庫對VfWRKY家族的113個WRKY轉錄本進行通路富集分析,結果顯示有98個VfWRKY轉錄本得到KEGG通路富集(圖7b)。VfWRKY基因主要富集在植物MAPK信號通路、植物與病原菌相互作用和剪接體3個通路中,其中植物與病原菌相互作用通路WRKY基因最多,為84個(占比85.71%),其次是植物MAPK信號通路,為40個(占比40.82%),剪接體通路最少,為13個(占比13.27%)。

P值、Q值表示差異顯著性檢驗指標。圖a中,柱長度對應P值的對數,柱后的數字表示基因數。

為了探究蠶豆WRKY家族成員表達模式,我們利用WRKY基因在根、莖葉、花、種子(開花后20 d、30 d、40 d)、果皮(開花后20 d、30 d、40 d)中的表達信息,構建了WRKY基因表達圖譜(圖8)。分析表達圖譜可知,WRKY基因家族在9個樣本中的表達模式可分為5組(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ):Ⅰ組主要在果皮中高表達;Ⅱ組主要在種子中高表達;Ⅲ組在9個樣本中低表達或不表達;Ⅳ組主要在根中表達且在其他組織中低表達或不表達,并且在根中高表達的WRKY基因占比較高(46.0%);Ⅴ組在多個組織中均有表達。

R:根;L:莖葉;F:花;S20、S30、S40表示開花后20 d、30 d、40 d的種子;P20、P30、P40表示開花后20 d、30 d、40 d的果皮。

2.6 蠶豆鹽脅迫候選WRKY基因的挖掘

通過查閱已有的擬南芥WRKY基因家族報道,我們發現AtWRKY1、AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY8、AtWRKY9等16個基因與鹽脅迫相關,其中12個基因為耐鹽基因,AtWRKY18、AtWRKY46、AtWRKY60、AtWRKY70為鹽敏感基因(表2)。將擬南芥中與鹽脅迫相關的16個WRKY基因比對到蠶豆WRKY基因家族中,在蠶豆中發現了14個候選同源基因,分別為Vfaba.Tiffany.R1.1g183400、Vfaba.Tiffany.R1.2g038280、Vfaba.Tiffany.R1.3g164760、Vfaba.Tiffany.R1.2g048240、Vfaba.Tiffany.R1.4g037840、Vfaba.Tiffany.R1.6g074800、Vfaba.Tiffany.R1.3g078920、Vfaba.Tiffany.R1.1g060200、Vfaba.Tiffany.R1.2g211440、Vfaba.Tiffany.R1.5g003240、Vfaba.Tiffany.R1.1g006440、Vfaba.Tiffany.R1.2g102760、Vfaba.Tiffany.R1.6g076880和Vfaba.Tiffany.R1.5g049280,其中AtWRKY3和AtWRKY4共同比對到Vfaba.Tiffany.R1.1g006440,AtWRKY11和AtWRKY17共同比對到Vfaba.Tiffany.R1.3g164760,且AtWRKY3、AtWRKY4、AtWRKY11和AtWRKY17都為耐鹽基因。

表2 蠶豆鹽脅迫候選WRKY基因

我們對啟豆2號的根、莖葉、花、種子(開花后20 d、30 d、40 d)、果皮(開花后20 d、30 d、40 d)的27個樣品進行了轉錄組分析,利用轉錄組數據對蠶豆14個鹽脅迫相關候選WRKY基因進行了表達模式分析(圖9)。Vfaba.Tiffany.R1.1g183400、Vfaba.Tiffany.R1.3g164760、Vfaba.Tiffany.R1.2g048240、Vfaba.Tiffany.R1.4g037840、Vfaba.Tiffany.R1.6g074800、Vfaba.Tiffany.R1.2g211440、Vfaba.Tiffany.R1.5g003240、Vfaba.Tiffany.R1.2g102760、Vfaba.Tiffany.R1.6g076880主要在根中高表達,在其他組織的表達量較低或不表達。Vfaba.Tiffany.R1.1g006440在多個組織中均有表達,并在開花后40 d果皮中表達量最高;Vfaba.Tiffany.R1.1g060200在多個組織中表達量較低或不表達;Vfaba.Tiffany.R1.5g049280在開花后20 d果皮中表達量最高。Vfaba.Tiffany.R1.1g183400、Vfaba.Tiffany.R1.2g038280、Vfaba.Tiffany.R1.2g048240、Vfaba.Tiffany.R1.2g102760、Vfaba.Tiffany.R1.2g211440、Vfaba.Tiffany.R1.3g078920、Vfaba.Tiffany.R1.3g164760、Vfaba.Tiffany.R1.4g037840和Vfaba.Tiffany.R1.5g003240在果皮中的表達量均先升高后下降(圖9)。

R:根;L:莖葉;F:花;S20、S30、S40表示開花后20 d、30 d、40 d的種子;P20、P30、P40表示開花后20 d、30 d、40 d的果皮。

3 討 論

蠶豆是具有較高營養價值和生物固氮作用的食用豆類,由于缺乏參考基因組序列,使得蠶豆的基礎研究進展緩慢。2023年Jayakodi等[33]通過高通量測序,組裝了第一個蠶豆高質量、染色體規模的基因組,并公布了37 065個基因的序列信息。全長轉錄組測序(三代高通量測序技術)能夠直接獲得高質量全長轉錄本,高質量全長轉錄本既可以為無參基因組的二代測序數據拼接提供參考,也可以完善基因組的基因數量。本研究首次對蠶豆的根、莖葉、花、種子(開花后20 d、30 d、40 d)、果皮(開花后20 d、30 d、40 d)等9個樣本進行了三代轉錄組測序,獲得58 885 條轉錄本序列,與蠶豆基因組相比,發現新轉錄本42 019個。本研究構建的全長轉錄組為后續進一步開展蠶豆遺傳研究提供了豐富的數據基礎。

WRKY轉錄因子基因是植物特有的轉錄因子基因,已有研究結果表明,WRKY轉錄因子基因能夠調控植物生長發育,例如,調控種子休眠、萌發[34],調控幼苗的形態發生[35],以及調節植物的開花時間等[36]。除了這些功能外,WRKY基因在響應非生物脅迫(干旱、高溫、高鹽等)[37]和生物脅迫(病原菌[38]和昆蟲[39]等)方面也具有非常重要的作用。本研究首次利用全長轉錄組測序對蠶豆WRKY家族進行研究,并鑒定出113個VfWRKY基因。不同物種間系統進化樹的建立,有助于更加準確地研究物種中未知家族成員的功能,我們根據進化關系,將蠶豆113個WRKY基因分成3組,其中group 2成員最多,為61個。同時我們對VfWRKY家族進行保守結構域和保守基序分析發現,group 1中的4個基因(VfWRKY16、VfWRKY17、VfWRKY18、VfWRKY19)具有2個WRKY保守結構域,但卻與group 2亞家族聚集在同一分支,通過序列比對,發現是由于第二個WRKY結構域缺少C2-H2序列造成的,需要通過優化蠶豆參考基因組后來完善其序列。

VfWRKY基因家族主要富集在植物MAPK信號通路、植物與病原菌相互作用和剪接體3個通路中。劉晨等[40]通過分析前人的研究發現MAPK信號通路能夠響應干旱脅迫、鹽脅迫、極端溫度及營養匱乏等非生物脅迫,并在植物抗逆過程中扮演重要角色,這與本研究的結果相符。同時WRKY基因在植物與病原菌相互作用通路中也具有多種功能,研究發現AtWRKY25和AtWRKY33既能調控植物與病原菌的相互作用[41-42],也能增強植物抵抗鹽脅迫的能力[24]。根據擬南芥WRKY基因家族已知基因功能,通過同源比對,在VfWRKY基因家族中發現14個候選基因可能與鹽脅迫相關,其中部分基因同時富集在植物與病原菌相互作用和植物MAPK信號通路中。本研究的下一步工作將對14個候選基因進行功能驗證,探索其與鹽脅迫的相關性。