基于pH下降速率的反饋補料策略高密度培養保加利亞乳桿菌NQ2508

陳曉岑,徐巖,劉彥民,李曉軍,穆曉清*

1(釀造微生物學與應用酶學研究室,江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)2(宿遷市江南大學產業技術研究院, 江蘇 宿遷,223800)3(內蒙古雙奇藥業股份有限公司,內蒙古 呼和浩特,010010)

乳酸菌是一類對人體有益的微生物,它常見于傳統發酵產品以及人類和動物的腸道中。近年來,關于乳酸菌功能特性的研究越來越受到重視。PASCUAL等和JAYASHREE等[1-2]在研究中指出,大多數乳酸菌具有抑制腸道中有害菌群和腐敗微生物生長的功能。此外,乳酸菌還能降低人體內膽固醇水平[3],維持腸道微生物平衡,提高免疫力以降低外來致病菌感染的風險[4-5]。保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)作為乳酸菌家族的重要成員之一,具有乳酸菌常見的功能特性,其主要作為酸奶發酵劑和益生菌制劑的菌種。根據國際乳業聯合協會的規定,食品中活性益生菌的最低數量至少為107CFU/g 或107CFU/mL,只有高于這一水平才能保證其對宿主產生有益作用[6]。在實際生產中,營養物質的缺乏及益生菌發酵過程中代謝產物的抑制效應均會降低生產效率,生產上常通過高細胞密度發酵(high cell density fermentation,HCDF)來增加產量[7]。

研究表明,乳桿菌生長主要受到底物供給和代謝產物乳酸抑制的影響[8]。因此,關于乳桿菌的高密度培養研究主要圍繞在發酵過程維持適宜的底物濃度和降低代謝物的抑制效應而展開。為了實現乳桿菌發酵過程底物濃度維持在適當的區間,一般通過恒速補料[9]、指數補料[10]和間歇補料[11]等不同補料方式。隨著發酵過程中環境的變化,乳桿菌菌體生長的葡萄糖轉化系數和速率也會發生變化,因此恒速補料策略無法維持底物濃度在一定范圍,低補料速率導致營養供給不足,而高補料速率則會導致底物濃度過高產生抑制效應[9,12]。指數補料策略雖然能夠克服上述問題,但屬于非反饋補料,不能根據乳桿菌實際發酵過程中代謝產物的積累進行調節,無法克服乳酸等對菌體生長的抑制效應,導致菌體在補料培養階段無法維持指數生長。而間歇補料策略則可以根據發酵過程的相關參數變化進行變速補料,但在工業規模發酵過程中,底物濃度、細胞濃度和代謝產物生成量等的相關參數大多無法在線檢測,無法確定補料時間和補料量,操作難度大。代謝產物乳酸抑制效應是限制乳桿菌生長的另外一個關鍵因子,GON?ALVES等[13]發現,乳桿菌發酵過程中底物逐漸被轉化為細胞和乳酸等代謝產物,對乳桿菌的生長產生明顯的抑制作用。研究者常通過超濾技術[14-15]或膜過濾循環系統[16]等方式移除培養體系內的代謝產物從而解除抑制效應,但生產成本較高,不宜工業化生產。LACOMBE等[17]發現通過添加堿性物質中和發酵體系內的酸類物質可以克服代謝物抑制效應,目前工業生產中使用最廣泛的方法主要是化學中和法。

過高的底物濃度會對菌體生長產生抑制作用,低底物濃度又無法滿足菌體生長對營養的持續需求;即使補料策略能夠滿足營養需求,但代謝產物乳酸和其他鹽離子帶來的脅迫作用又會限制乳桿菌的生長[18]。因此需要將微生物細胞生長與代謝結合考慮,將底物補料策略和代謝產物化學中和相結合[11],控制培養體系內的底物濃度和pH同時處于適宜的區間,從而滿足乳桿菌生長的營養需求,克服代謝產物的抑制作用。本研究考察了培養基組成和培養條件對菌體代謝流影響及pH下降速率-葡萄糖消耗速率關系,建立了基于pH下降速率的反饋補料策略,實現了保加利亞乳桿菌NQ2508的高密度培養,為保加利亞乳桿菌的工業化規模低成本生產奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

保加利亞乳桿菌NQ2508由內蒙古某藥業公司提供,以片劑菌粉的形式保存于-20 ℃以下冰箱。

1.1.2 培養基與緩沖液

液體發酵培養基—改良MRS培養基(g/L):葡萄糖12.0、酪蛋白胨4.0、牛肉粉8.0、無水CH3COONa 4.0、CH3COOK 4.0、無水CaCl22.4、MgSO4·7H2O 0.4、MnSO40.1、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.6,Tween-80 0.8 mL,蒸餾水1 000 mL,調節pH值為7.2～7.4。于121 ℃滅菌15 min。

PBS:A液:0.05 mol/L Na2HPO4溶液,B液:0.05 mol/L KH2PO4溶液。取A液600 mL,緩慢滴入B液,調節pH值至8.5,然后按照總體積加入0.05% Tween-80。于121 ℃滅菌20 min,冷卻后存放于4 ℃冰箱。

1.1.3 儀器與設備

YQX-Ⅱ型厭氧工作站,濟南駿馳生物科技有限公司;SW-CJ-1D型超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;FE 20型pH計,美國梅特勒-托利多公司;A-380型紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;SBA-40型生物傳感分析儀,山東省科學院;DHG-9070A型恒溫干燥箱,黃石市恒豐醫療器械有限公司;GI54DWS型高壓蒸汽滅菌鍋,南京庚辰科學儀器有限公司;CA-1115A型冷卻水循環裝置,上海愛郎儀器有限公司;T J-Btype型雙聯平行發酵系統,迪必爾生物工程有限公司;BIOSFLO 115型平行發酵罐,New Brunswick。

1.2 實驗方法

1.2.1 微生物的培養條件

保加利亞乳桿菌NQ2508的活化和種子液在厭氧箱中進行培養,氣體環境為80% N2, 10% CO2, 10% H2,溫度設定為38 ℃。

1.2.2 種子液的制備

取半片菌粉制劑接種于裝有80 mL液體MRS培養基的三角瓶中,在厭氧箱中于38 ℃的溫度下進行活化培養。隨后按照5%(體積分數)的接種量將活化后的菌液轉接到含有180 mL液體MRS培養基的三角瓶中,并在原代培養條件下培養至對數生長后期(pH值為4.6～4.7)[19]。將經過兩次傳代培養后的菌液作為種子液,用于后續發酵。

1.2.3 不同葡萄糖濃度區間細胞得率系數的測定

在搖瓶中進行單因素實驗。配制具有不同初始葡萄糖濃度的MRS培養基,按照5%的接種量接入種子液,對接種后的培養物進行培養,測定前3 h的OD600,以此反映不同初始葡萄糖濃度下保加利亞乳桿菌NQ2508的起始生長速率。根據不同的葡萄糖濃度區間設置3個實驗組,每組3個平行,當培養體系內的殘留葡萄糖濃度達到葡萄糖濃度區間的下限時,結束發酵過程。在此過程中,每小時取樣測量葡萄糖含量和OD600,并計算保加利亞乳桿菌NQ2508在不同葡萄糖濃度區間下培養的細胞得率系數。

1.2.4 不同pH區間比生長速率和得率系數的測定

在搖瓶中進行單因素試驗。根據不同的pH區間設置6個實驗組,每組3個平行。根據pH區間的上限調整各組培養基的初始pH值。向各組培養基中接入5%的種子液進行培養,當各組的發酵液pH值降低到pH區間的下限時,結束發酵過程。發酵過程中每隔1 h取樣測OD600,計算保加利亞乳桿菌NQ2508在不同pH區間下培養的比生長速率。

在微生物的發酵過程中,培養基中的營養物質被菌體用于合成細胞和生成代謝產物,常用得率系數表征微生物的生長過程。本研究通過菌株NQ2508培養過程的OD600變化量與葡萄糖消耗量表征其細胞得率系數YO/S計算如公式(1)所示:

(1)

式中:YO/S,消耗1 g葡萄糖增加的OD600,g-1;O0,接種后發酵0 h的OD600;O,接種后發酵th的OD600;S0,接種后發酵0 h的葡萄糖濃度,g/L;S,接種后發酵th的葡萄糖濃度,g/L。

保加利亞乳桿菌主要產乳酸,pH值的降低與乳酸含量密切相關。但是在實際發酵過程中,乳酸含量的檢測方法比較復雜費時,對此提出通過pH和H+濃度之間的關系來反映發酵體系中乳酸的變化趨勢,并使用該趨勢的變化量和葡萄糖消耗量來描述產物得率系數YP/S,如公式(2)～公式(4)所示:

pH=-lg[H+]

(2)

[H+]3+Ka[H+]2-(Kw+Ka×CLA)[H+]=Ka×Kw

(3)

(4)

式中:YP/S,消耗1 g葡萄糖乳酸的生成量;[H+],溶液中的H+濃度,mol:/L;Ka,酸的電離平衡常數;Kw,水的離子積常數;CLA,pH計算出的乳酸濃度,mol/L;P0,接種后發酵0 h的乳酸濃度,g/L;P,接種后發酵th酸濃度,g/L。

為了表征保加利亞乳桿菌在發酵過程中葡萄糖的消耗更多用于合成細胞,本研究用葡萄糖分配系數YO/P反映菌株的代謝流向,如公式(5)所示:

(5)

式中:YO/P,發酵過程中葡萄糖消耗用于合成細胞和生成乳酸的比例系數,g-1。

1.2.5 不同階段pH下降速率與葡萄糖消耗速率的測定

以pH下降速率為x軸,葡萄糖消耗速率為y軸作圖。由乳酸菌代謝產酸引起的pH下降速率與葡萄糖消耗速率之間的線性關系式如公式(6)所示:

(6)

式中:k,葡萄糖消耗量和pH降低值之間的比例常數;μ(p),pH下降速率,h-1;μ(s),葡萄糖消耗速率,g/L·h。

1.2.6 基于pH下降速率的反饋補料策略

建立了一條新的補料策略,采用質量分數為10%的氨水控制pH在一定的區間,通過基于pH下降速率的反饋補料策略控制培養體系中的葡萄糖濃度,根據分批補料過程的葡萄糖質量守恒公式預測補料量。葡萄糖質量守恒公式如公式(7)所示:

Sn*Vn+Sf*ΔVn=S′n*(Vn+ΔVn)

(7)

式中:Sn,補料前的葡萄糖濃度,g/L;S′n,補料后的葡萄糖濃度,g/L;Sf,補料培養基的葡萄糖濃度,g/L;Vn,補料前的發酵體系體積,L;ΔVn,補料體積,L。

配制初始葡萄糖質量濃度為12 g/L的MRS培養基1.5 L,裝入3 L發酵罐中,121 ℃滅菌15 min。滅菌結束后,待罐體冷卻至室溫,將其與發酵系統連接。在系統上設置發酵溫度為38 ℃,向發酵罐內持續通N2保持0.1 Pa的正壓維持厭氧環境。當發酵系統顯示培養基的pH和溫度無明顯波動時,向發酵罐中接入10%(體積分數)的種子液,啟動基于pH下降速率的反饋補料策略。在菌株發酵過程每小時取樣測定OD600和葡萄糖濃度。發酵至生長對數后期,取樣測量發酵液的活菌數。

1.2.7 指標測定方法

采用紫外分光光度計測量發酵液的OD600,以蒸餾水為空白對照組。分光光度計對OD600的測量范圍在0.2～0.8更準確,因此對于OD600超出該范圍值的發酵原液,需進行稀釋后測定。使用SBA-40E生物傳感分析儀測定葡萄糖濃度。發酵液最終生物量通過平板培養計數方法進行測定,結果表示為活菌數(CFU/mL)[20]。

1.2.8 數據處理方法

實驗結果用平均值±標準偏差表示,所有實驗重復3次。使用軟件Origin 9.3進行繪圖以及線性回歸分析;使用GraphPad Prism 8.0做單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖濃度對保加利亞乳桿菌NQ2508生長的影響

葡萄糖濃度是保加利亞乳桿菌高密度培養的重要影響因素,濃度過高會對菌體的生長產生抑制作用,過低則無法滿足菌體生長對營養的需求。因此需確定培養過程中葡萄糖濃度的最佳水平,針對葡萄糖濃度對菌株NQ2508生長的影響展開研究?？疾觳煌跏计咸烟菨舛葘闚Q2508起始生長速率的影響,以及不同葡萄糖濃度下菌株NQ2508的細胞得率系數。由圖1中可知,菌株NQ2508在12.0 g/L的初始葡萄糖質量濃度下培養的起始生長速率最快。如圖2所示,NQ2508在葡萄糖質量濃度8.0～12.0 g/L培養時,細胞得率系數最高,達到0.42 g-1。因此,將補料過程中的葡萄糖質量濃度區間確定為8.0～12.0 g/L。

圖1 初始葡萄糖濃度對保加利亞乳桿菌NQ2508生長的影響Fig.1 Effect of the initial glucose concentration on the growth of Lactobacillus bulgaricus NQ2508

圖2 保加利亞乳桿菌NQ2508在不同葡萄糖濃度 區間培養的細胞得率系數Fig.2 Cell yield coefficients of L. bulgaricus NQ2508 cultured in different glucose concentration intervals

2.2 pH對保加利亞乳桿菌NQ2508生長的影響

研究表明,pH在乳酸菌的生長中起著重要作用。目前常見的控pH方式多為恒pH,該方法由于堿液的不斷加入,酸根離子和鹽離子的積累會引起滲透壓增加,從而抑制菌體的生長。為了能夠在控制pH值的同時減少乳酸根的積累,本研究提出使用區間pH對保加利亞乳桿菌NQ2508進行高密度培養。為了闡明pH值在6.0～4.0不同區間時對菌株NQ2508生長的影響,本研究對其在不同pH區間下培養的比生長速率和葡萄糖分配系數展開研究。

如圖3所示,菌株NQ2508在pH 5.0以上培養的比生長速率顯著高于pH 5.0以下,在pH 6.0～5.5和5.5～5.0區間培養的比生長速率分別達到0.62、0.71 h-1;在pH 5.0～4.5和4.5～4.0區間培養的比生長速率分別為0.49、0.12 h-1。圖3顯示了在更寬的pH區間內培養,pH 6.0～5.0的比生長速率為0.81 h-1,而在pH 5.0～4.0只有0.27 h-1。此外,對菌株NQ2508在不同pH區間的葡萄糖分配系數進行了單因素方差分析(ANOVA)。結果表明,當菌株NQ2508在pH 5.0以上培養時,葡萄糖分配系數顯著高于pH 5.0以下,且不同pH區間下的葡萄糖分配系數沒有顯著差異。這表明菌株NQ2508在pH 5.0以上生長的代謝流更多偏向細胞合成,隨著pH值的下降,生物體的代謝流傾向產酸途徑。綜上所述,pH 6.0～5.0是菌株NQ2508增殖培養的最佳選擇。

圖3 保加利亞乳桿菌NQ2508在不同pH區間 培養的比生長速率Fig.3 Specific growth rate of L. bulgaricus NQ2508 cultured at different pH intervals

表1 不同pH區間的葡萄糖分配系數Table 1 Glucose allocation coefficients at different pH intervals

2.3 保加利亞乳桿菌NQ2508發酵過程中pH值下降速率與葡萄糖消耗速率的關系

目前,大多數關于葡萄糖消耗的研究都與酸的產生有關[21]。由于檢測乳酸含量的方法比較復雜費時,可將pH視為代替乳酸的監測指標。在保加利亞乳桿菌NQ2508的發酵過程中,發現pH值的下降速率和葡萄糖消耗速率有類似的變化趨勢。如圖4所示,對pH值的下降速率與葡萄糖消耗速率進行線性擬合,發現兩者呈現出線性正相關,從公式(6)可以得出以下關系式[公式(8)]:

ΔS=k×ΔpH

(8)

式中:ΔS,每個pH循環消耗的葡萄糖質量濃度,g/L;k,葡萄糖消耗量和pH降低值之間的比例常數。

2.4 保加利亞乳桿菌NQ2508補料過程中補料函數的建立

根據保加利亞乳桿菌NQ2508補料過程中的葡萄糖質量守恒定律,可以推導出每個循環補料前葡萄糖濃度的關系式如公式(9)所示:

[Sn]=[S′n]-[ΔS]

(9)

確定整個補料過程中的補料時間和補料量至關重要。在這項研究中,葡萄糖消耗速率通過pH值的下降速率反映,從而確定補料的時間。補料系數R由公式(7)～公式(9)確定,如公式(10)所示:

(10)

式中:R,補料體積與補料前發酵體積之間的比例系數。

根據公式(10),可以確定補料體積,如下所示:

ΔVn=R×Vn

(11)

2.5 保加利亞乳桿菌NQ2508補料過程中葡萄糖消耗模式的擬合

根據前面對葡萄糖濃度和pH區間的研究,本文提出了保加利亞乳桿菌NQ2508的高密度發酵策略:在保加利亞乳桿菌NQ2508的培養過程中,當pH降至5.0時,采用質量分數10%的氨水將pH恢復到6.0;同時,根據補料系數R向發酵體系中進行補料,控制體系內葡萄糖質量濃度為8.0～12.0 g/L。由圖4可知k為3.3,配制補料培養基和發酵培養基的葡萄糖質量濃度分別為45.0、12.0 g/L。

圖4 pH下降速率與葡萄糖消耗速率的線性擬合Fig.4 Linear fit of the pH decrease rate to the glucose consumption rate

通過公式(10)、公式(11)對保加利亞乳桿菌NQ2508的葡萄糖消耗模式進行擬合和實驗驗證。結果顯示,葡萄糖濃度的實驗曲線略低于擬合曲線(圖5),擬合值和實驗值的相關系數達到0.993 3,表明擬合曲線和實驗曲線顯著且強相關(表2)。

表2 擬合值與實驗值之間的相關性分析結果Table 2 Correlation analysis results between the fitted and experimental values

圖5 發酵過程中葡萄糖濃度的擬合曲線和實驗曲線Fig.5 Fitted and experimental curves of the glucose concentration during fermentation

2.6 基于pH下降速率的反饋補料策略在發酵中的應用

為了考察反饋補料策略對保加利亞乳桿菌NQ2508高密度培養微生物生長的促進作用,設置不進行pH控制的批次發酵作為對照組。

如圖6-a、圖6-b所示,處理組在pH 6.0～5.0補料培養,體系中的葡萄糖質量濃度控制在8.0～12.0 g/L。如圖6-c所示,菌株在處理組中培養9 h后達到對數生長后期,OD600為7.17;而對照組在培養了約7 h后達到對數生長后期,OD600為3.42?；趐H下降速率的反饋補料策略的應用有效提高了保加利亞乳桿菌NQ2508的發酵液OD600。目前,關于保加利亞乳桿菌NQ2508高密度培養的方法尚無研究報道。

a-對照組和處理組發酵過程的pH曲線;b-對照組和處理組發酵過程的葡萄糖濃度曲線;c-對照組和處理組發酵過程的OD600曲線

本研究考察了保加利亞乳桿菌NQ2508批次培養與補料發酵的穩定性和生產效率(表3、表4),同時也比較了其他文獻報道的保加利亞乳桿菌亞種的高密度培養水平,結果見表5。從表3中可知,菌株NQ2508在處理組中,活菌數平均可達(3.6×109)CFU/mL,是對照組批次培養的2.4倍。表4結果顯示,處理組的批次產量、菌體得率(單位葡萄糖的菌體產量)以及生產效率(每天的菌體產量)顯著高于對照組;處理組的菌體得率和生產效率分別是對照組的1.3倍和3.6倍。值得注意的是,處理組在增加循環次數繼續發酵后,活菌數達到(3.5×109)CFU/mL,沒有得到進一步提高,這可能與細胞的可培養狀態有關。

表4 NQ2508在3 L發酵罐上發酵效率的比較Table 4 Comparison of fermentation efficiency of NQ2508 in a 3 L fermenter

由表5可知,對于不同來源的保加利亞乳桿菌,基于其生理特性差異,適宜的補料和控制pH方式存在差異。本研究保加利亞乳桿菌NQ2508經構建的高密度發酵策略培養后,相對于分批培養水平,活菌數增長了144.9%,與其他化學法控pH補料方式相比,活細胞數量在同一水平級數,活細胞培養增長率較高。這表明基于pH下降速率的反饋補料策略對保加利亞乳桿菌NQ2508的高密度培養對提高其生產效率是有效的。

表5 保加利亞乳桿菌高密度培養研究進展Table 5 Research progress of high-density culture of L. bulgaricus

3 結論與討論

研究發現,保加利亞乳桿菌NQ2508在發酵過程中pH下降速率與葡萄糖的消耗速率成正比。同時,葡萄糖濃度也會對NQ2508生長過程中的代謝流方向產生影響。為了確定保加利亞乳桿菌NQ2508生長的最佳體系環境,本文研究了不同葡萄糖濃度區間的細胞得率系數以及不同pH區間的比生長速率和葡萄糖分配系數。結果顯示,實驗菌株在8.0～12.0 g/L的葡萄糖濃度區間具有最高的細胞得率系數,在pH 6.0～5.0具有最大的比生長速率和葡萄糖分配系數。

基于pH降低值與葡萄糖消耗量之間模型和質量守恒公式建立了補料函數,確定了補料系數R,提出了基于pH下降速率的反饋補料策略,實現了保加利亞乳桿菌NQ2508高密度培養。補料發酵過程中葡萄糖濃度實驗值與擬合值無明顯差異,表明該模型符合保加利亞乳桿菌NQ2508補料策略發酵過程。該反饋補料策略有效地將培養體系中的葡萄糖濃度保持在最佳水平,確保了培養體系中的營養供應,同時有效緩解了底物的抑制作用,降低了頻繁控制pH的負面影響。應用該策略后,菌株NQ2508發酵液的活菌數達到3.6×109CFU/mL,較批次發酵提高144.9%。與分批培養方式相比,基于pH下降速率的反饋補料策略降低了原料成本和發酵過程中的操作成本,對于提高生產效率、降低生產成本具有重要意義。