松杉靈芝孢子油超聲波輔助提取響應面優化

楊金鵬，臺雪月，2，李應華，鐘 寶

（1.吉林農業科技學院食品工程學院，吉林吉林 132101；2.長春大學食品科學與工程學院，吉林長春 130022；3.漯河職業技術學院，河南漯河 462002）

0 引言

松杉靈芝（Ganoderma tsugaeMurr.），別名鐵杉靈芝，是非褶菌目靈芝科靈芝屬真菌，生長在落葉松的樹干基部，分布于我國長白山地區，具有一定的藥用價值?，F代研究表明，松杉靈芝營養成分豐富，含有人體必需的氨基酸、核苷、微量元素、維生素及生物活性多糖、三萜類化合物、生物堿等，是維護人體健康所必需的膳食纖維的良好來源。醫學研究證明，松杉靈芝除了對肝炎、關節炎、糖尿病、高血壓、高血脂、神經衰弱等疾病有效外，還對人類三大致死性疾病冠心病、癌癥、腦溢血有顯著療效[1-3]。

靈芝孢子油（Ganoderma lucidum spore oil） 是靈芝孢子的脂質提取物，富含三萜類靈芝酸、多不飽和脂肪酸，具有抗腫瘤、免疫調節、保護調節神經系統、降血脂、保肝護肝等生理活性[4-5]。超聲提取是目前揮發油提取常采用的方法，超聲提取技術的基本原理主要是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，具有提取時間短、溫度低、產率高等優點，目前只有少量關于超聲波提取靈芝孢子油的報道[6]。以松杉靈芝孢子粉為原料，利用超聲波輔助提取技術，以靈芝孢子油得率為評價指標，通過響應面法對孢子油的提取工藝進行優化。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

松杉靈芝，產自吉林省敦化市；石油醚（沸程60～90 ℃）、無水硫酸鈉，購自吉林市珠光經貿有限責任公司。

1.1.2 儀器與設備

博迅BXH-65 型電熱鼓風干燥箱，金博仕（蘇州） 生物技術有限公司產品；JA1003 型電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產品；KQ-100DE 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產品；HH-4型水浴鍋，鄭州生化儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程原料選擇→烘干→稱質量→混合有機溶劑→超聲→離心→蒸餾→干燥→成品→成分測定。

1.2.2 操作要點

（1） 原料選擇。選用無雜質、無腐敗的破壁松杉靈芝孢子粉。

（2） 烘干。將破壁靈芝孢子粉鋪平，2～3 mm厚，于50 ℃條件下烘干2.5 h。

（3） 稱質量、混合有機溶劑。稱取10 g 烘干的靈芝孢子粉，置于具塞三角燒瓶，置于通風櫥內，按照1∶10 的比例加入石油醚，混勻，蓋緊瓶塞。

（4） 超聲。將三角燒瓶置于超聲波處理器中進行超聲處理。

（5） 離心。超聲處理的混合液置于離心試管中，以轉速4 000 r/min 離心5 min。

（6） 蒸餾、干燥。取上清液，進行減壓蒸餾，濃縮液加入無水Na2SO4干燥20 h，收集樣油。

1.2.3 松杉靈芝孢子油提取的單因素試驗設計[7-8]

（1） 超聲功率對靈芝孢子油得率的影響。取10 g靈芝孢子粉，加入100 mL石油醚，在超聲時間25 min，超聲溫度30 ℃的條件下，分別設置超聲功率為200，250，300，350，400 W，考查不同超聲功率對靈芝孢子油得率的影響。

（2） 超聲時間對靈芝孢子油得率的影響。取10 g靈芝孢子粉，加入100 mL 石油醚，在超聲功率300 W，超聲溫度30 ℃的條件下，分別設置超聲時間為20，25，30，35，40 min，考查不同超聲時間對靈芝孢子油得率的影響。

（3） 超聲溫度對靈芝孢子油得率的影響。取10 g靈芝孢子粉，加入100 mL 石油醚，在超聲功率300 W，超聲時間25 min 的條件下，分別設置超聲溫度為15，20，25，30，35 ℃，考查不同超聲溫度對靈芝孢子油得率的影響。

1.2.4 靈芝孢子油提取的響應面法試驗設計

根據Box-behnken 試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，選取對試驗結果有顯著影響的3 個因素，超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C） 為自變量，以靈芝孢子油得率為響應值（Y），進行響應面分析。

響應面分析因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析因素與水平設計

1.2.5 數據處理

采用輔助軟件Design Expert 8.0.6 進行隨機試驗。

1.2.6 靈芝孢子油得率計算[9]

2 結果與分析

2.1 超聲功率對靈芝孢子油得率的影響

超聲功率對靈芝孢子油得率的影響見圖1。

由圖1 可知，在提取過程中隨著超聲功率的升高，靈芝孢子油得率出現先升高后下降的趨勢，在超聲功率為300 W 時得率最高，可能是因為空化作用和機械作用隨著超聲功率的增加而增加，從而提高提取率，隨著超聲功率的繼續升高，靈芝孢子油得率呈現下降趨勢，可能是因為超聲功率加大，空化作用變強，伴隨大量空化泡的產生，導致非目標產物含量的增加，進而影響了提取效果。因此，選擇超聲功率為250～350 W 時進行響應面優化試驗。

2.2 超聲時間對靈芝孢子油得率的影響

超聲時間對靈芝孢子油得率的影響見圖2。

圖2 超聲時間對靈芝孢子油得率的影響

由圖2 可知，在提取過程中隨著超聲時間的增加，靈芝孢子油得率出現先升高后下降的趨勢，當超聲時間為30 min 時，靈芝孢子油得率最高，可能是因為隨著提取時間的延長，提取液內部的振蕩適中，目標物得率較高，但時間繼續延長，會導致提取液溫度的上升，有機溶劑揮發速度加快，目標產物的結構產生了變化，進而使得率降低。因此，選擇超聲時間為15～25 min 時進行響應面優化試驗。

2.3 超聲溫度對靈芝孢子油得率的影響

超聲溫度對靈芝孢子油得率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對靈芝孢子油得率的影響

由圖3 可知，在提取過程中隨著超聲溫度的增加，靈芝孢子油得率出現先升高后下降的趨勢，當超聲溫度為25 ℃時，靈芝孢子油得率最高，可能是因為隨著溫度的升高，液體分子熱運動開始活躍，溶劑與原料反應充分，但溫度繼續升高，會導致溶劑揮發速度加快，同時由于溫度過高導致有效成分遭到破壞，進而使得率降低。因此，選擇超聲時間為20～40 ℃時進行響應面優化試驗。

2.4 響應面法工藝優化結果

2.4.1 響應面分析試驗設計

根據單因素試驗結果，進行響應面優化試驗，分別考查超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C） 對靈芝孢子油得率（Y） 的影響。

響應面試驗設計與結果見表2。

表2 響應面試驗設計與結果

2.4.2 回歸模型方差分析及顯著性檢驗

采用Design Expert 8.0.6 軟件對多元回歸模型擬合、方差分析及顯著性檢驗，得到回歸方程模型為：

回歸方程ANOVA 分析見表3，回歸模型的可信度分析見表4。

表3 回歸方程ANOVA 分析

表4 回歸模型的可信度分析

由表3、表4 可知，模型的p＜0.000 1，說明該模型極顯著，回歸模型設計與實際測定值能夠最大限度擬合，試驗誤差較小。因此，可以用該回歸方程代替試驗真實值對試驗結果進行分析，得到R2=98.66%，預測值與實際值之間存在高度相關性，說明該方程具有較高的可靠性?；貧w模型中，二次項C，A2，B2，C2表現出極顯著水平（p＜0.01），一次項B表現出顯著水平（p＜0.05）。3 個因素對靈芝孢子油得率的影響主次順序為C＞B＞A，即超聲溫度＞超聲時間＞超聲功率。

2.4.3 各因素間交互作用對靈芝孢子油得率的影響分析

在回歸模型方差分析結果的基礎上，利用軟件做超聲功率、超聲時間、超聲溫度對靈芝孢子油得率的等高線圖和響應面圖。

超聲功率、超聲時間交互作用對靈芝孢子油得率的影響見圖4，超聲功率、超聲溫度交互作用對靈芝孢子油得率的影響見圖5，超聲時間、超聲溫度交互作用對靈芝孢子油得率的影響見圖6。

圖4 超聲功率、超聲時間交互作用對靈芝孢子油得率的影響

圖5 超聲功率、超聲溫度交互作用對靈芝孢子油得率的影響

圖6 超聲時間、超聲溫度交互作用對靈芝孢子油得率的影響

通過Design Expert 8.0.6 軟件求解回歸方程得到靈芝孢子油最佳提取條件為超聲功率300 W，超聲時間30 min，超聲溫度25 ℃，在此工藝條件下靈芝孢子油的得率為28.5%，與理論預測值比較接近，表明響應面得到的數學模型是可靠的，具有實用價值。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，以超聲功率、超聲時間、超聲溫度為自變量，以靈芝孢子油得率為響應值對松杉靈芝孢子油提取工藝進行優化，得到最佳工藝參數為超聲功率300 W，超聲時間30 min，超聲溫度25 ℃，在此工藝條件下靈芝孢子油的得率為28.5%。在試驗過程中，超聲功率過大，會使空化作用變強，產生大量空化泡，導致非目標產物含量的增加；超聲時間延長，提取液內部振蕩加劇，導致提取液溫度上升和有機溶劑揮發速度加快，目標產物的結構產生了變化；超聲溫度的升高，導致溶劑揮發速度加快和有效成分遭到破壞，進而使松杉靈芝孢子油的得率降低。