響應面法優化雞蛋殼制備乳酸鈣工藝研究

王佳新，張 熙，劉子夜，閆 茜，王曉艷，劉美玉

（1.河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北邯鄲 056038；2.邯鄲市天然產物與功能性食品開發重點實驗室，河北邯鄲 056038）

我國禽蛋的生產和消費總產量從1985 年開始，連續30 多年位居世界第一，2019 年雞蛋總量約3 500 萬t，占世界雞蛋總產量的40%以上。蛋殼占雞蛋質量的12%～13%[1]，往往作為廢棄物被扔掉。據估計，我國每年有廢棄蛋殼約400 萬t，不僅造成環境污染，也是一種資源浪費[2]，目前國內對雞蛋殼的深加工利用開始備受關注。蛋殼的主要成分是CaCO3（含量90%以上），是一種天然綠色生物鈣源，充分利用好這一優質鈣源，變廢為寶，對建設資源節約型、環境友好型社會具有現實意義。

鈣是人體必需的元素之一，是組成骨骼、牙齒、臟器、血液和肌肉組織的重要成分[3]，缺鈣會引起各種生理功能障礙。鈣元素以離子態被人體吸收的被稱為活性鈣[4]。蛋殼的主要成分為碳酸鈣（約占93.0%），不易被機體吸收利用，如把蛋殼中無機鈣轉化成活性鈣，將大大增加蛋殼的利用率。近年國內外研究者采用高溫煅燒法[5]、直接中合法[6]、微生物轉化[7]等把蛋殼鈣轉化成檸檬酸鈣[8]、醋酸鈣[9]、乳酸鈣[10]、葡萄糖酸鈣[11]及氨基酸鈣[12]等產品，取得了一定成效，上述制作方法各有優缺點，產率和有效鈣含量有待于進一步提高。

乳酸鈣（C6H10CaO6） 是具有安全性高、溶解度大、吸收率高等優點的一種有機鈣，在所有鈣鹽中人體對乳酸鈣吸收率最高，可達32%[13]。在食品工業中乳酸鈣用于食品營養強化劑的鈣劑，作為面包、糕點等的緩沖劑、膨松劑等[14]；在醫藥行業作為藥物使用[15]，可治療缺鈣癥，如佝僂病、手足搐搦癥，以及婦女妊娠、哺乳期所需鈣的補充[16]。

響應面法（RSM） 是利用多元二次回歸方程來擬合因素和響應值之間的函數關系，通過分析回歸方程找到最佳工藝參數[17]，具有周期短、試驗次數少等特點，能有效節省時間和成本；還可通過對二次方程模型的擬合與方差分析，評價每個因子及其交互作用對所得去除率的影響，從而可快速有效地預測多因子系統的最佳條件[18]。利用直接中和法把蛋殼鈣轉化成有機乳酸鈣，并用響應面法優化工藝參數，旨在為蛋殼綜合利用提供技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原材料：雞蛋殼，河北省邯鄲市美食林工業園提供。

試劑：鈣羧酸指示劑（含量≥98%） 分析純，天津市河東區紅巖試劑廠提供；氫氧化鈉（含量≥98%，分析純）、乙二胺四乙酸二鈉（99.5%，分析純），天津歐博凱化工有限公司提供；乳酸（＞88%，食品級），天津市歐波凱化工有限公司提供；鹽酸（36%～38%，分析純），煙臺市雙雙化工有限公司提供。

1.2 試驗設備

標準分樣篩（100 目），浙江上虞市道墟張興紗篩廠產品；FD-1 型冷凍干燥機，北京德天佑科技發展有限公司產品；2XZ-2 型旋片真空泵，浙江黃巖求精真空泵廠產品；F-1000 型搖擺式高速中藥粉碎機，新昌縣德科機械有限公司產品；JA1003 型電子分析天平，上海精密科學儀器有限公司產品；HH-6型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產品；DGG-9146A 型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海博珍儀器設備制造廠產品；85-2 型恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司產品；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空泵，河南省予華儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋殼粉制備

挑選干凈、殼色均勻一致的雞蛋殼，洗凈后在清水中浸泡2～3 h，蛋殼膜大部分已經與蛋殼分離，順勢撕下蛋殼膜，再次清洗蛋殼，攤放在30 ℃烘箱中烘干3～4 h；放入粉碎機粉碎，過100 目篩后放入燒杯，加入30 倍蒸餾水，磁力攪拌10 min，靜置20 min，除掉上層懸浮物，再次抽濾，棄濾液，取上層物冷凍干燥，再次過100 目篩，即為制備好的蛋殼粉，備用。

1.3.2 中和反應

稱取適量蛋殼粉置于燒杯中，先加入一定量的乳酸，再緩慢分次加入一定量的蒸餾水，邊加水邊攪拌，以防反應時液體溢出；在一定的水浴溫度下，經過一定時間使其充分反應，至無氣泡產生則為反應完全。反應方程式如下：2CH3CH（OH） COOH+CaCO3=(CH3CH(OH)COO)2Ca+H2O+CO2↑。待反應完全后將水浴鍋升溫至80 ℃，使生成的乳酸鈣溶解，并趁熱抽濾去除雜質，取濾液冷凍干燥，粉碎過篩，即得白色粉末狀乳酸鈣。

1.3.3 單因素試驗設計

在預試驗基礎上，分別選取乳酸用量、料液比、反應時間、反應溫度進行單因素試驗，考查不同因素對乳酸鈣產量的影響。準確稱取制備好的蛋殼粉3 g，精確到0.01 g，置于燒杯中，先固定試驗條件為料液比1∶14，反應溫度45 ℃，反應時間為90 min，設計乳酸用量，其次設計料液比、反應時間、反應溫度。

單因素試驗水平編碼表見表1。

表1 單因素試驗水平編碼表

1.3.4 響應面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，以乳酸用量、料液比、反應時間和反應溫度為考查因素，利用響應面設計進一步優化工藝參數，以乳酸鈣產量為響應值，每個因素選擇3 個水平，采用四因素三水平的Box-behnken 中心組合試驗設計原理進行響應面試驗設計。

響應面分析因素水平編碼見表2。

表2 響應面分析因素水平編碼

1.3.5 乳酸鈣產量的測定方法

（1） 試劑配置。鹽酸溶液（1 份鹽酸+ 4 份水）；氫氧化鈉溶液（100 g/L）；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA） 標準滴定溶液（0.05 mol/L）；鈣試劑羧酸鈉指示劑（稱取0.1 g 鈣試劑羧酸鈉鹽，加10 g 在110 ℃干燥過的氯化鈉，研磨，混勻）。

（2） 乳酸鈣（C6H10CaO6） 含量（以干基計） 的測定步驟：稱取約0.3 g 試樣，溶于已加有2 mL 鹽酸溶液的50 mL 水中，邊攪拌邊滴加乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液15 mL，再加氫氧化鈉溶液5 mL和鈣試劑羧酸鈉指示劑0.1 g，用乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液，滴定溶液至呈現藍色為終點。乳酸鈣（C6H10CaO6） 含量（以干基計） 的質量分數W1，按照公式（1） 計算：

式中：V1——試樣消耗乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液的體積，mL；

1 000——換算因子；

C1——乙二胺四乙酸二鈉標準滴定溶液的濃度，mol/L；

M1——乳酸鈣的摩爾質量，g/mol，[M1(C6H10CaO6)=218.2]；

m1——試樣的質量，g；

W2——干燥減量的質量分數，%。

取2 次平行測定結果的平均值為測定結果。

乳酸鈣（C6H10CaO6） 的實際產量結果，按照公式（2） 計算：

式中：W1——樣品質量分數，%；

W2——蛋殼和乳酸反應后干燥得到的乳酸鈣總質量，g。

1.3.6 數據處理與統計分析

數據表示形式為平均值±標準差，用SPSS20.0統計軟件對數據進行單因素方差分析，Duncan's 法進行差異顯著性檢驗，p＜0.05 表示差異顯著；并進行相關性分析和多重回歸分析，建立回歸方程。

2 結果與分析

2.1 乳酸用量對乳酸鈣產量的影響

在料液比1∶14，反應時間90 min，反應溫度45 ℃的條件下，不同的乳酸用量對乳酸鈣產量的影響。

乳酸用量對乳酸鈣產量的影響見圖1。

圖1 乳酸用量對乳酸鈣產量的影響

由圖1 可知，隨著乳酸用量的增加，乳酸鈣的產量隨之升高，生成的乳酸鈣是一種無異味的白色結晶體。當乳酸用量達到6 mL 時，乳酸鈣產量最高為5.86 g；當乳酸用量繼續增加至7 mL，乳酸鈣產量沒有顯著性增加，這是因為乳酸與蛋殼已反應完全，但過量的乳酸形成具有吸濕性的乳酸酐吸附在乳酸鈣表面，干燥時生成微黃色具有酸味的晶體，使乳酸鈣的品質降低[6]，并且造成材料上的浪費。因此，7 mL 乳酸反應效果比較適宜。

2.2 料液比對乳酸鈣產量的影響

料液比是指蛋殼粉與水的質量之比。在確定乳酸用量為6 mL 條件下，暫定反應時間90 min，反應溫度45 ℃，測定不同料液比對乳酸鈣產量的影響。

料液比對乳酸鈣產量的影響見圖2。

圖2 料液比對乳酸鈣產量的影響

乳酸鈣產量隨著料液比的增大而增大，當增至1∶14 時，產量最高為4.97 g。料液比再增加時，產量又逐漸下降趨勢。因為雞蛋殼與乳酸的反應屬多相反應體系，既有液相又有固相，且生成的產物乳酸鈣易溶于水，進入液相。料液比太小會導致乳酸的濃度大，使反應體系的溶液易達到飽和，不利于乳酸鈣的生成，因此增大料液比有利于反應向生成乳酸鈣的方向進行。但料液比太大會降低乳酸濃度，并且會造成后期蒸發濃縮時間延長，能耗增加。另外，當反應體系中水量較多時，結晶過濾過程中也會使乳酸鈣損失較大，降低乳酸鈣的產量[19]。因此，料液比選1∶14 較合適。

2.3 反應溫度對乳酸鈣產量的影響

在確定乳酸用量6 mL，料液比1∶14 的條件下，暫定反應時間為90 min，測定不同的反應溫度對乳酸鈣產量的影響。

反應溫度對乳酸鈣產量的影響見圖3。

圖3 反應溫度對乳酸鈣產量的影響

在25～45 ℃時，隨著反應溫度的升高，乳酸鈣產量也緩慢增加，當反應溫度為45 ℃，其產量最高為5.32 g；溫度繼續升高，乳酸鈣產量逐漸下降。這是因為溫度升高，加快反應速度，乳酸鈣生成量增加，并有利于CO2氣體的溢出；但溫度過高，會使水和乳酸蒸發加快，導致乳酸損失，不能充分利用，而影響乳酸鈣的產量[20]。因此，制備乳酸鈣的最佳反應溫度為45 ℃。

2.4 反應時間對乳酸鈣產量的影響

在確定乳酸用量6 mL，料液比1∶14，反應溫度45 ℃的條件下，測定不同的反應時間對乳酸鈣產量的影響。

反應時間對乳酸鈣產量的影響見圖4。

圖4 反應時間對乳酸鈣產量的影響

由圖4 可知，乳酸鈣的產量隨著反應時間的增大而增加，反應時間達到90 min 時，產量達到最高5.28 g。由于碳酸鈣與乳酸為弱堿與弱酸反應，反應速度慢，較短的反應時間會導致乳酸與碳酸鈣反應不充分，造成乳酸和蛋殼粉等材料的浪費；反應時間到90 min 時，乳酸和蛋殼粉的反應完全，乳酸鈣產量達到最高；之后再延長反應時間，乳酸鈣產量增加不顯著。為保證乳酸與蛋殼粉充分完全反應，并提高試驗效率。因此，反應時間選90 min 為宜。

2.5 響應面試驗結果分析

根據單因素試驗的結果，選取乳酸用量（A），料液比（B），反應溫度（C），反應時間（D） 作為試驗因素，篩選乳酸鈣的最優制備工藝條件。采用Design Expert V 8.0.6 軟件中的Box-behnken 設計并進行四因素三水平響應面試驗。

響應面試驗結果見表3。

表3 響應面試驗結果

對表3 的試驗數據進行多元回歸擬合，得到各因素與響應值的二次多項回歸模型為：

方差分析見表4。

表4 方差分析

根據p值的大小可以顯示模型及其各個考查因素的顯著水平。當p＜0.05 時，表明該模型或其各因素影響顯著，p＜0.01 時，表明該模型或其各因素影響極顯著。由表4 可知，蛋殼制取乳酸鈣產量為響應值時，該模型p＜0.000 1，表明該二次方程模型極顯著；且失擬項p=0.180 9＞0.05 不顯著，R2=0.945 0，R2Adj=0.889 9 和Adeq.Precision=15.477 表明該二次多項回歸方程的模擬度較好，誤差小，從而可采用此方法對雞蛋殼乳酸鈣制取工藝參數進行預測和分析。

變異系數CV 可以反映模型的可信度，當CV 值越低時，模型的可信度越高。該試驗的CV=2.98%，表明該模型的可信度較高，可以用該模型來分析響應值的變化。

由表4 還可知，因素一次項A、C對乳酸鈣產量指標的影響為極顯著水平（p＜0.01），一次項B、D對試驗結果的影響不顯著（p＞0.05）。根據F值的大小可得知，4 個因素對蛋殼制取乳酸鈣產量的影響大小順序為A＞C＞B＞D，即乳酸用量＞反應溫度＞料液比＞反應時間。二次項A2，C2，D2差異極顯著（p＜0.01）；交互項AC、CD試驗結果對乳酸鈣產量的影響顯著（p＜0.05）。

根據回歸模型得出AB，AC，CD，即乳酸用量與料液比、乳酸用量與反應溫度、反應溫度與反應時間之間交互作用得出的響應面和等高線。

乳酸用量與料液比交互作用對乳酸鈣產量的影響見圖5，乳酸用量與反應溫度交互作用對乳酸鈣產量的影響見圖6，反應溫度與反應時間交互作用對乳酸鈣產量的影響見圖7。

圖5 乳酸用量與料液比交互作用對乳酸鈣產量的影響

圖6 乳酸用量與反應溫度交互作用對乳酸鈣產量的影響

圖7 反應溫度與反應時間交互作用對乳酸鈣產量的影響

圖5 、圖6、圖7 中3D 響應面圖可直觀描繪回歸模型；等高線圖形狀越趨于圓形，表明2 個自變量間的交互效應越弱，若等高線的形狀接近橢圓形，表明2 個自變量間交互作用較強。相對而言，試驗中乳酸用量（A） 與反應溫度（C）、反應溫度（C）與反應時間（D） 的變化坡度較陡峭，乳酸用量（A）與料液比（B） 的變化坡度較為平緩，說明乳酸用量（A） 與反應溫度（C）、反應溫度（C） 與反應時間（D） 對乳酸鈣產量的影響較大， （A） 乳酸用量與（B） 料液比對乳酸鈣產量的影響較小。

由回歸模型預測和分析得出蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝參數為蛋殼粉3 g 時，乳酸用量6.52 mL，料液比1∶14.95，反應溫度46.51 ℃，反應時間94.67 min，乳酸鈣的產量最高可達5.281 62 g。

2.6 驗證試驗

考慮到實際情況，選擇料液比乳酸用量為7 mL，料液比1∶15，反應溫度47 ℃，反應時間95 min，在此條件下，乳酸鈣產量5.35 g 與理論值5.281 62 g接近，相對誤差僅為1.32%（＜5%），說明采用響應面設計得到的工藝參數真實可信，有較好的指導意義。

3 結論

以雞蛋殼為原料，采用直接中和法制備乳酸鈣。在單因素試驗的基礎上采用響應面優化工藝條件，以乳酸鈣產量為指標，得到蛋殼制備乳酸鈣的最佳工藝條件為蛋殼粉3 g 時，乳酸用量7 mL，料液比1∶15，反應溫度47 ℃，反應時間95 min，在最佳制備條件下乳酸鈣的產量最高為5.35 g，為雞蛋殼綜合利用提供技術支撐。