阿達木單抗還原肽指紋圖譜鑒別方法的建立與驗證

武 剛,劉 冰,陳全姚,倪永波,郭璐韻,梅玉婷,于傳飛,王 蘭(中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產品室,衛生部生物技術產品檢定及標準化重點實驗室,國家藥品監督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室,北京 069;重慶市食品藥品檢驗檢測研究院生物制品室;煙臺大學藥學院;共同第一作者;通訊作者,E-mail:wanglan@nifdc.org.cn)

阿達木單抗是采用中國倉鼠卵巢細胞系表達制備的首個重組全人源化抗腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的單克隆抗體,其通過與TNF-α特異性結合,阻止TNF-α與細胞表面TNF-α受體結合,從而有效抑制TNF-α誘導的多種病理效應[1,2]。阿達木單抗首先是由艾伯維公司研發并于2002年在美國批準上市,商品名為“修美樂(Humira)”,2010年獲批進入中國,陸續獲批的適應證包括類風濕性關節炎、強直性脊柱炎、銀屑病、克羅恩病等多種自身免疫性疾病[3-5]。自2012年開始,阿達木單抗修美樂連續近10年位居全球藥品銷售額榜首,2021年年銷售額突破200億美元,展現了巨大的市場潛力。目前,美國和歐盟已有10余家公司的阿達木單抗生物類似藥上市,國內也已有7家公司的生物類似藥獲批上市,同時國內還有20余家公司正處于研發階段[6-9]。

肽指紋圖譜是蛋白質表征、結構鑒定和功能研究的基本方法之一。還原肽圖是將蛋白質進行變性還原后利用特異性的酶(蛋白水解)或化學裂解,得到一系列的短肽片段,然后對其進行分離、檢測和鑒定。如果供試品與參考品以同樣的前處理方式制備,酶解后的指紋圖譜一致,那么二者被認為是相同的。肽圖分析已成為驗證單克隆抗體及其他重組蛋白生物制品一級結構完整性及正確性最有效的方法之一[10-12]。肽圖分析方法對氨基酸序列的變化非常敏感,氨基酸一級序列的變化或氨基酸的翻譯后修飾會導致肽指紋圖譜發生變化,可以檢測到治療性單抗中單個氨基酸殘基修飾或突變的細微變化,如絲氨酸變為精氨酸[13],肽圖鑒別也是考察產品批間一致性及穩定性的重要手段,已成為單抗制品常用的質控放行方法之一,對產品的質量控制有非常重要的意義[9,14,15]。

治療性單克隆抗體的互補決定區(complementarity determining region,CDR)是決定抗體特異性和親和力的關鍵部位,不同抗體的CDR序列不同[16,17],酶切后產生相應肽段的色譜保留行為也不同,從而得到抗體的特征肽段色譜圖,達到鑒別抗體的目的。單抗常含有多種翻譯后修飾(post-translational modification,PTM),這些PTMs可能發生在抗體生產、純化和儲存的任何階段[18,19]。位于抗體互補決定區(CDR)的殘基的PTM可能會對抗體與目標抗原的結合產生不利影響,進而影響抗體活性及臨床療效。蛋氨酸和色氨酸側鏈的氧化,已被證明會導致構象變化[20,21],影響抗體與Fc受體和抗原的結合[22,23],并影響mAb的穩定性和半衰期[21,24]。因此,選擇CDR作為肽圖鑒別監測的特征肽段是一種常見策略,對單克隆抗體在藥物開發、生產和儲存過程中的質量控制尤為重要。

本研究首先采用液質聯用技術對所建立的阿達木單抗還原肽指紋圖譜方法的氨基酸序列覆蓋率進行了考察,并對全部CDR肽段進行了鑒別,在此基礎上建立了阿達木單抗液相色譜肽指紋圖譜鑒別方法,按照《中國藥典》2020年版四部通則9101藥品質量標準分析方法驗證指導原則,對該方法進行了專屬性、精密度、耐用性等驗證,并考察了樣品的儲存穩定性,為企業建立抗體肽指紋圖譜鑒別分析方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 單抗及主要試劑

阿達木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗為中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產品室留樣。胰蛋白酶(Trypsin)購自美國Promega公司,胞內蛋白酶(Lys-C)購自日本Wako公司;二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)購自美國Sigma Aldrich公司;8 mol/L鹽酸胍溶液、1 mol/L Tris-HCl溶液(pH 8.0)、ESI陽離子校準液、甲酸(質譜級)、乙腈(質譜級)、水(質譜級)購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 儀器設備

配有紫外檢測器(UV)的Vanquish Flex超高效液相色譜儀、Q Exactive Plus超高分辨質譜儀購自美國Thermo Fisher公司;真空離心濃縮儀購自英國Genevac公司;金屬浴購自德國Eppendorf公司。

1.3 高分辨質譜測定氨基酸序列覆蓋率及CDR特征肽段的確證(Trypsin酶切)

1.3.1 樣品處理 取蛋白800 μg于離心管中,采用真空離心濃縮儀將樣品干燥至透明狀,加蛋白變性液40 μL(由8 mol/L鹽酸胍1 mL、1 mol/L Tris-HCl pH8.0溶液50 μL和1 mol/L DTT溶液10 μL混合制成),充分渦旋震蕩混勻,37 ℃孵育30 min,冷卻至室溫,加入1 mol/L IAM溶液1 μL,室溫避光反應30 min,加入50 mmol/L Tris-HCl pH8.0溶液760 μL,渦旋混勻。取上述溶液100 μL至新離心管中,加0.5 mg/mL Trypsin溶液5 μL,37 ℃孵育4 h,加入甲酸3 μL終止酶解,13 000 r/min離心5 min,取上清液待測。

1.3.2 液相色譜參數 柱溫60 ℃,樣品盤溫度8 ℃,紫外檢測波長214 nm,進樣量10 μL。流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫(0～5 min,2%流動相B;5～120 min,2%→35%流動相B;120.1～128 min,35%→100%流動相B;128.1～135 min,2%流動相B),流速0.3 mL/min,色譜柱為Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C18(2.1 mm×150 mm,1.7 μm)。

1.3.3 高分辨質譜參數 采用ESI離子源,正離子模式,數據依賴型掃描,一級掃描范圍m/z為200～2 000,分辨率為70 000,AGC target 3×e6;二級分辨率為17 500,AGC target 1×e5;Top 10,First Mass:m/z120,四級桿隔離窗口m/z1.8,碎裂能量NCE 28。3～120 min液相六通閥切入質譜采集,其他時間六通閥切入廢液。

1.3.4 肽指紋圖譜鑒別方法覆蓋率分析及CDR特征肽段確證 使用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件處理質譜數據,分析建立方法的氨基酸序列覆蓋率,并確證全部CDR肽段。結合肽指紋圖譜各個肽段的UV強度、分離度、共流出等信息,確定所建立液相方法鑒別分析的特征肽段與參比肽段。

1.4 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學驗證

1.4.1 專屬性分析 將阿達木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗分別按1.3.1項下方法進行制備,以水作為空白對照同樣品處理,所得溶液按1.3.2和1.3.3項下色譜及質譜參數條件進行分析。

1.4.2 精密度分析 將同一樣品溶液連續進樣5次,以特征肽段/參比肽段的相對保留時間(relative retention time,RRT)及相對峰面積(relative peak area,RPA)的相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)考察儀器精密度。由同一實驗人員于不同時間制備樣品以及兩名實驗人員于同一時間分別制備樣品,每份樣品溶液各進樣1次,以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察中間精密度。

1.4.3 耐用性分析 分別考察多個維度的方法耐用性,包括酶:蛋白質量比、酶切時間、酶解后樣品穩定性、色譜柱耐用性。

以不同酶∶蛋白質量比(1∶35,1∶40,1∶45)加入Trypsin,混勻后37 ℃孵育4 h后終止,即得不同酶解比例的樣品溶液。以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察方法耐用性。

以酶∶蛋白質量比為1∶40加入Trypsin,37 ℃孵育不同時間(3.5,4,4.5 h),終止,即得不同酶解時間的樣品溶液。以特征肽段的RRT及RPA的RSD考察方法耐用性。

將制備的樣品溶液于8 ℃樣品盤中放置0,12,24 h各進樣1次;將制備的樣品溶液儲存于-20 ℃,于0,3,7 d溶解后各進樣1次。以特征肽段的RRT及RPA的RSD評價酶解后樣品穩定性。

分別采用不同品牌、型號、柱長和孔徑等的7種色譜柱對樣品溶液進行分析,通過比較特征肽段色譜行為考察色譜柱的適用性。色譜柱信息見表1。

表1 色譜柱的型號及規格Table 1 Information of chromatographic columns

1.5 高分辨質譜測定氨基酸序列覆蓋率、CDR特征肽段確證及方法學驗證(Lys-C酶切)

以0.5 mg/mL胞內蛋白酶(Lys-C)代替Trypsin溶液,其他按1.3項方法進行樣品制備和檢測,并按照1.4項開展方法學驗證。

2 結果

2.1 高分辨質譜測定氨基酸序列覆蓋率及CDR肽段確證結果(Trypsin酶切)

2.1.1 氨基酸序列覆蓋率結果 采用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件對阿達木單抗質譜數據進行分析,總離子流見圖1,采用99%高置信水平卡值,重鏈(heavy chain,HC)覆蓋率為96.0%,輕鏈(light chain,LC)覆蓋率為98.6%,全部CDR肽段均得到確證,未確證的短肽均為親水性肽段,在色譜柱上無保留,前3 min流入廢液,未進入質譜。HC、LC覆蓋率良好(≥95.0%),滿足鑒別需求。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補決定區。圖1 阿達木單抗總離子流圖Figure 1 Total ion chromatogram of adalimumab

2.1.2 CDR肽段確證結果 HC和LC的全部CDR肽段均得到鑒定。各CDR肽段及離子化信息結果見表2,各肽段實測相對分子質量與理論值偏差≤±5×10-6,其中下劃線部分為CDR序列,CDR對應肽段一級質譜圖見圖2。通過MS2高能量碎裂獲得二級碎片b/y離子信息(見圖3,以重鏈CDR1和輕鏈CDR2為例),確證了各肽段的序列。

注:+1,+2,+3,+4代表電荷數。圖2 阿達木單抗CDR對應肽段一級質譜圖Figure 2 First mass spectrum of CDR peptides of adalimumab

注:b/y代表碎片離子類型;數字代表碎片離子質荷比。圖3 阿達木單抗CDR對應肽段MS2譜圖Figure 3 MS2 spectra of CDR peptides of adalimumab

2.1.3 特征肽段的確認 根據質譜鑒定出CDR肽段峰的保留時間確定特征肽段。阿達木單抗LC的CDR1和CDR3序列內存在Trypsin酶切位點,酶切后CDR位于2個肽段,分別標記為CDR1-1、CDR1-2及CDR3-1、CDR3-2。經解析,HC-CDR1和LC-CDR1-2在出峰位置處存在共流出峰,其中HC-CDR1與共流出峰強度相當,而LC-CDR1-2與其共流出峰相比強度僅約為2%。因此,最終鑒別用特征肽段選取HC的CDR1、CDR2、CDR3以及LC的CDR1-1、CDR2、CDR3-1、CDR3-2作為特征肽段,同時選定保留時間約為97 min的肽段(Fc段保守氨基酸序列152-214)作為參比肽段。

2.2 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學驗證結果

2.2.1 專屬性分析結果 空白對照在樣品出峰時間內無干擾峰;阿達木單抗、貝伐珠單抗和利妥昔單抗據質譜數據分析,鑒定出各自的CDR肽段(見圖4)。該方法可對阿達木單抗進行有效的鑒別。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補決定區;紅色區域代表CDR肽段色譜峰。圖4 專屬性UV肽譜圖Figure 4 The UV peptide mapping chromatograms for specificity

2.2.2 精密度分析結果 連續5次進樣測定各特征肽段的RRT的RSD在0.008%～1.097%之間,RPA的RSD在1.212%～7.951%之間(見表3,4),中間精密度考察特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.985%之間,RPA的RSD在2.306%～10.939%之間(見圖5,表5,6),表明該方法精密度良好。

注:6條不同顏色的譜圖代表6次重復實驗的色譜圖。圖5 中間精密度色譜圖Figure 5 Chromatograms for intermediate precision tests

表3 儀器精密度考察結果Table 3 Results of instrument precision tests

表4 儀器精密度考察結果Table 4 Results of instrument precision tests

表5 中間精密度考察結果Table 5 Results of intermediate precision tests

表6 中間精密度考察結果Table 6 Results of intermediate precision tests

2.2.3 耐用性分析結果 實驗結果表明,Trypsin酶切比例為1∶35～1∶45,特征肽段RRT的RSD在0.003%～0.870%之間,RPA的RSD在1.299%～14.584%之間;酶切時間在3.5～4.5 h內變化時,特征肽段RRT的RSD在0.031%～1.066%之間,RPA的RSD在2.518%～4.380%之間,耐用性良好(見表7,8)。

表7 耐用性考察結果Table 7 Results of durability tests

表8 耐用性考察結果Table 8 Results of durability tests

酶解后樣品穩定性結果表明,樣品溶液在8 ℃放置24 h以及-20 ℃放置7 d的穩定性良好(見表9,10)。

表9 酶解后樣品穩定性考察結果Table 9 Results of stability tests of sample solution

表10 酶解后樣品穩定性考察結果Table 10 Results of stability tests of sample solution

對7根不同色譜柱采集的質譜數據進行分析,以99%高置信水平卡值,除色譜柱7的重鏈外,肽段覆蓋率均在95%以上,根據質譜鑒定結果,均在對應的UV譜圖中標記出CDR特征峰(見圖6)。色譜柱1～4為Waters CSH系列色譜柱,對阿達木單抗各肽段保留行為基本一致,其中色譜柱3分離效果稍好,如重鏈CDR1與其共流出峰有分開趨勢但仍未完全分離;色譜柱4為長100 mm的短柱,肽段保留時間整體前移,但對同一肽段的分離效果卻不完全相同,如鑒定到的輕鏈CDR1-2與其共流出峰分開,保留時間約為36 min,因強度較低未能在UV譜圖上標出對應的色譜峰;而鑒定到的重鏈CDR3與其后面的峰由基線分離變為共洗脫峰。色譜柱5～6為Waters BEH系列色譜柱,二者孔徑不同,相比而言,130 ?比300 ?分離效果好,如重鏈CDR2和CDR3在130 ?色譜柱上可以達到基線分離,而在300 ?色譜柱上被同時洗脫下來。與Waters CSH系列色譜柱相比,鑒定出的輕鏈CDR1-2被分在2個肽段即ASQGIR和NYLAWYQQKPGKAPK,保留時間約為3 min和47 min,分別標記為CDR1-2′和CDR1-3′;其他特征肽段洗脫順序大致相同,但峰形整體增寬且峰強度偏低,原因是CSH為表面帶正電的BEH(亞乙基橋雜化)顆粒,可以改善低離子強度流動相中的上樣能力和峰不對稱性。色譜柱7為Agilent色譜柱,其對各肽段保留行為與Waters BEH系列色譜柱類似,但重鏈CDR2未鑒定到(見圖6)。

注:紅色區域代表CDR肽段色譜峰。圖6 不同色譜柱分析CDR肽段的色譜圖Figure 6 The chromatograms of CDR peptide by different columns

2.3 高分辨質譜測定氨基酸序列覆蓋率、CDR特征肽段確證及方法學驗證結果(Lys-C酶切)

2.3.1 氨基酸序列覆蓋率及CDR確證結果 采用Thermo BiopharmaFinder3.2軟件對阿達木單抗質譜數據進行分析,總離子流圖見圖7,HC覆蓋率為95.1%,LC覆蓋率為96.7%,HC、LC覆蓋率良好(≥95.0%)。全部CDR肽段均得到確證,對應肽段及離子化信息結果見表11、一級質譜圖見圖8,通過MS2高能量碎裂獲得二級碎片b/y離子信息(見圖9,以重鏈CDR1和輕鏈CDR1為例),成功確證各CDR肽段。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補決定區;數字代表保留時間。圖7 阿達木單抗CDR對應肽段總離子流圖(Lys-C酶切)Figure 7 Total ion chromatograms of adalimumab (digested by Lys-C)

注:圖中+2,+3,+4,+5,+6,+7代表電荷數;數字代表質荷比。圖8 阿達木單抗CDR對應肽段一級質譜圖(Lys-C酶切)Figure 8 Mass spectrum of CDR peptides of adalimumab (digested by Lys-C)

注:b/y代表碎片離子類型;數字代表碎片離子質荷比。圖9 阿達木單抗CDR對應肽段MS2譜圖(Lys-C酶切)Figure 9 MS2 spectra of CDR peptides of adalimumab (digested by Lys-C)

表11 阿達木單抗CDR對應Lys-C酶切肽段及離子化信息Table 11 Related CDR peptides and ionization information of adalimumab digested by Lys-C

2.3.2 CDR肽段確證結果及鑒定用特征肽段的確定 阿達木單抗LC的CDR2和CDR3位于同一肽段,HC的CDR1和CDR2在色譜圖中體現為共流出峰,且二者強度相當。因此,選擇HC的CDR1&2、CDR3以及LC的CDR1、CDR2&3肽段作為特征肽段,同時選定保留時間約為95 min的峰(Fc段保守氨基酸序列152-214)作為參比峰。

2.3.3 液相色譜法肽指紋圖譜鑒別的方法學驗證結果 空白對照在樣品出峰時間內無干擾峰(見圖10A),且可與其他單抗進行鑒別(見圖10B-D)。5次連續進樣測定特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.017%之間,RPA的RSD在1.617%～6.570%之間;中間精密度考察特征肽段RRT的RSD在0.070%～0.129%之間,RPA的RSD在3.730%～18.280%之間。結果表明,該方法精密度良好。耐用性考察結果表明,Trypsin酶切比例在1∶30～1∶50內變化時,特征肽段RRT的RSD在0.010%～0.038%之間,RPA的RSD在7.576%～16.593%之間;酶切時間在3～5 h內變化時,特征肽段RRT的RSD在0.014%～0.027%之間,RPA的RSD在9.254%～10.999%之間,耐用性良好。酶解后樣品溶液在8 ℃放置24 h以及-20 ℃放置7 d的穩定性良好。

注:HC.重鏈;LC.輕鏈;CDR.互補決定區;紅色區域代表CDR肽段色譜峰。圖10 專屬性UV肽譜圖 (Lys-C酶切)Figure 10 The UV peptide mapping chromatograms for specificity (digested by Lys-C)

3 討論

單克隆抗體類藥物是目前最常見的蛋白質類藥物之一,肽指紋圖譜鑒別是蛋白質類藥物質量控制的重要手段之一。通過反相色譜分析蛋白質酶解后的肽段能夠獲取蛋白質的大量信息,再通過比較供試品蛋白與參比品蛋白的肽指紋圖譜進而判斷蛋白表達的準確性,該方法對于蛋白質類藥物特性鑒別具有重要意義,現已成為鑒別質控分析常用方法之一。相比于非還原肽圖,還原肽圖將鏈內、鏈間二硫鍵打開,酶切得到的肽段(如含二硫鍵的肽段)相對更小,利于保持可溶狀態、離子化,便于MS表征分析及檢測,用于質控放行的肽圖鑒別方法一般使用還原肽指紋圖譜,因此,本研究選擇還原肽圖方法對阿達木單抗進行鑒別。

CDR氨基酸序列是不同單克隆抗體的特異性序列,單抗肽圖鑒別方法常選取CDR肽段作為特征肽段進行鑒別以達到質控目的。單抗輕重鏈各含有3個CDR,酶切后一般產生≥6個含CDR的肽段,但并非所有的CDR肽段峰都適合作為特征峰,如有的CDR肽段雖可由質譜確證,但在UV譜圖上色譜峰強度較低或不可見;有的CDR肽段親水性較強在反相色譜柱上保留較弱,導致保留時間變異較大。本研究中的全部CDR肽段均得到確證,結合質譜鑒定結果以及UV譜圖情況,分別選擇7個CDR肽段(Trypsin酶切)和4個CDR肽段(Lys-C酶切)作為特征肽段用于肽指紋圖譜鑒別。特征肽段應基于對分子特性充分了解,對分析方法充分驗證的基礎上進行規定,合理設定特征肽段是鑒別方法優劣的關鍵。同時,如在方法開發時遇到譜圖中一些峰的洗脫順序、峰強度、目視分離度、峰數目和峰形無論如何優化條件(液相色譜儀、色譜柱、流動相、柱溫、流速等)均無法穩定重現,則可以考慮在結果判定中合理設置可變區段。肽圖一致性判定標準通常要求計算供試品與參比品的特征峰與參比峰的保留時間/相對保留時間、面積/相對峰面積、峰高/相對峰高,規定供試品與參比品相應參數的差值/比值范圍來進行判斷,且供試品的總洗脫概況(如峰保留時間、峰形和峰高等)應與參比品色譜圖一致,本研究采用相對保留時間及相對峰面積作為考察指標對建立的阿達木單抗肽指紋圖譜液相鑒別法開展了方法學驗證,以此評價該方法的可行性。

肽圖樣品處理過程中涉及蛋白變性、二硫鍵還原、烷基化封閉、酶切等步驟,由于變性、還原劑等會影響蛋白酶的活性,常選用脫鹽后酶切的操作流程,可以使樣品處理方法具有較好的重現性。脫鹽方法較多,如透析袋、超濾管、SEC脫鹽柱、液相在線脫鹽等,但存在成本高、時間長、依賴回收率穩定性等缺陷。由于Trypsin、Lys-C對較低濃度的變性劑具有一定的耐受性,本研究嘗試通過稀釋的方式建立了非脫鹽前處理方法,結果顯示蛋白酶可充分對樣品進行酶解,且蛋白回收率穩定性較好。因此,為避免方法重現性不穩定、形成批間差異,應在方法學開發階段充分驗證樣品處理方法的精密度及耐用性。

本研究采用以甲酸作為流動相離子對試劑的反相體系進行分析,甲酸和三氟乙酸是肽圖分析方法的流動相中常用的離子對試劑,三氟乙酸相較于甲酸具有更強的色譜保留,同時還具有改善峰型、降低UV基線噪音等作用,但在質譜上表現出顯著的離子抑制效應,長期使用會污染儀器,降低儀器效能[25]。肽圖分析通常是在基于質譜鑒別的基礎上建立液相方法,如何選擇離子對試劑,需權衡利弊后來確定。本研究耐用性考察發現不同的反相色譜柱對各肽段選擇性、保留強弱、分離效果以及峰強度等具有一定差異,這不僅與肽段的大小、電荷及疏水性有關,還與色譜柱固定相特性,如顆粒類型、孔徑等有關,因此,在方法開發過程中可以通過篩選色譜柱對肽段分離方法進行優化,以獲取更高的分離度和回收率。

Trypsin能識別賴氨酸K和精氨酸R,單抗酶解后得到較多的肽段,可實現較好的全序列覆蓋,CDR肽段數量多便于合理選定特征肽段,是肽指紋圖譜鑒別方法開發最常用的蛋白酶。Trypsin法存在小肽段較多,易形成共流出峰,疊加操作人員差異、色譜柱差異、液相色譜儀工況、批次日間差異等可能導致色譜圖存在細微或顯著差異,不利于一致性判定。Lys-C酶只識別賴氨酸K,單抗酶解后肽段總量較少,CDR分布的肽段較少,不利于特征肽段的選定。但使用該酶建立的鑒別方法譜圖批間差異較小、一致性更好,越來越多的進口及國產上市單抗品種選用Lys-C酶法用于QC放行鑒別。本研究分別采用Trypsin和Lys-C兩種酶進行酶切,通過方法學驗證,均可達到預期的鑒別目的。除Trypsin、Lys-C外的特異性的蛋白酶也可使用,如AspN、Glu-C等。

本實驗分別應用Trypsin、Lys-C對阿達木單抗進行前處理,利用高分辨液質聯用系統對CDR區肽段進行了表征確證,以表征結果為基礎選取部分適宜的CDR肽段作為鑒別用特征肽段建立液相肽指紋圖譜鑒別方法并按照2020年版《中國藥典》(通則9101分析方法驗證指導原則)完成方法學驗證。所建立的肽指紋圖譜鑒別分析方法具有良好的專屬性、精密度和耐用性,可用于阿達木單抗的質量控制及批檢驗放行,對眾多國產阿達木生物類似藥的質量屬性評價和控制具有參考價值,同時也可為其他重組蛋白生物制品的肽指紋圖譜鑒別方法開發提供參考。