不同級別宮頸病變女性陰道微生物分布特征和群落結構變化

田麗君,石繼海,余艷琴,姚茹楠,米淑宏,賈喜梅(內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院婦產科,包頭 0400;內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院流行病學研究中心;通訊作者,E-mail:7063946@qq.com)

宮頸疾病是指發生在宮頸組織區域的病變,常見包括宮頸上皮內瘤樣變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)、宮頸癌(cervical cancer,CC)等,CC是目前臨床常見的女性惡性腫瘤,世界衛生組織(World Health Organization,WHO)統計顯示,2020年全球估計有60.4萬新發病例和34.2萬死亡病例,其中80%的病例發生在發展中國家,我國每年新發病例約占全球新發病例的20%左右,發病率及死亡率均高居全球范圍內女性惡性腫瘤的第4位[1,2]。CC的發展是一個逐步的過程,CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ級作為癌前病變可逐漸進展為子宮頸浸潤癌,早期篩查宮頸疾病對提高治療效果、改善患者預后至關重要[3,4]。既往研究發現,微生物群通常附著于人體中形成共生體,在宿主的功能、免疫力和飲食方面可發揮共生體或互惠體的作用,目前發現微生物群寄生的常見部位包括陰道及腸道[5,6]?，F代研究表明,微生物群的改變誘發相關疾病,包括炎癥和癌癥。女性陰道微生物環境在正常情況下處于平衡狀態,而陰道微生物群落是維持陰道微生態環境平衡的核心部分[7,8]。但目前的研究只是定性的描述了宮頸疾病治療或手術后陰道菌群失調,未定量分析陰道微生物群落組成的變化。針對這個問題,本研究旨在分析不同級別宮頸病變女性陰道微生物的分布特征和群落結構變化,探討陰道微生物群在宮頸病變中的作用及潛在的臨床應用價值,篩選出與宮頸病變相關的關鍵微生物種類,為揭示宮頸病變的發病機制、探索有效的防治手段以及開發基于陰道微生物群落的診斷和治療方法提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2021年1月至2023年6月于內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院收治的宮頸病變患者70例為觀察對象,納入標準:①患者均行宮頸液基細胞學、高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)篩選法及宮頸活檢病理,結果顯示存在宮頸病變;②患者年齡在20～45歲之間;③1月內未行抗生素及陰道沖洗藥物;④1周內無性生活。排除標準:①患者合并泌尿系統疾病;②合并其他惡性腫瘤;③合并糖尿病或重要器官嚴重功能障礙;④合并陰道炎癥或盆腔炎癥。根據病理類型分為CIN Ⅰ組(n=20)、CIN Ⅱ組(n=20)、CIN Ⅲ組(n=20)、CC組(n=10),本研究均經內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院倫理會批準同意(倫理批準號:2019031607)。

1.2 檢查方法

陰道微生物群落結構檢測:采用無菌棉拭子放置于受檢者陰道后穹窿處旋轉10～15 s,放置-80 ℃冰箱中保存,采用細菌基因組DNA試劑盒提取樣本總DNA,提取后放置-20 ℃冰箱中冷凍保存,使用PCR擴增儀提取稀釋后基因組的DNA,同時擴增16S rRNA的V3、V4區基因片段,實施PCR反應,置于4 ℃冰箱中保存,采用Illumina Miseq測序平臺檢測陰道微生物群落。

陰道微生物分布特征:采用無菌棉拭子放置于受檢者陰道后穹窿處旋轉10～15 s,常規行涂片、干燥、固定及革蘭氏染色等操作,用顯微鏡觀察陰道菌群密集度及多樣性。陰道菌群密集度:采用油鏡觀察視野下細菌數目,放大倍數為10×100倍,其中視野下細菌數目1～9個為Ⅰ級,10～99個為Ⅱ級,≥100個為Ⅲ級,細菌聚集成團或密度覆蓋于黏液為Ⅳ級。陰道菌群多樣性:采用油鏡觀察視野下細菌類型數目,放大倍數為10×100倍,其中視野下細菌類型1～3種為Ⅰ級,4～6種為Ⅱ級,7～10種為Ⅲ級,≥11種為Ⅳ級。

1.3 觀察指標

①比較各組受檢者陰道群落結構,其中微生物菌門包括厚壁菌門、放射菌門、擬桿菌門及其他菌門類型,微生物菌群包括乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬及其他菌屬;②比較各組受檢者菌落密集度、菌群多樣性情況,其中Ⅱ-Ⅲ級為正常,Ⅰ級或Ⅳ級為異常;③CC組患者隨訪治療后3個月,比較CC患者治療前后陰道微生物分布特征、群落結構變化。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組受檢者一般資料比較

各組受檢者年齡、BMI等差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 各組受檢者一般資料比較Table 1 General information of subjects in each group

2.2 各組受檢者群落結構比較

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組患者菌門分布以厚壁菌門為主,分別占99.08%,96.13%,80.60%,73.32%,59.19%,放射菌門、擬桿菌門、其他菌門等微生物占比逐漸增加,5組菌門分布情況兩兩比較差異具有統計學意義(P<0.05,見表2)。

表2 各組受檢者菌門分布情況比較 菌門數(%)Table 2 Comparison of the distribution of bacterial phyla in subjects among five groups counts(%)

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組乳酸桿菌屬占比逐漸下降,健康組、CINⅠ組、CINⅡ組和CINⅢ組患者菌屬分布以乳酸桿菌屬為主,分別占88.90%,73.43%,60.84%,54.37%,CC組患者以加德納菌屬為主,占比25.24%,5組菌屬分布情況兩兩比較差異具有統計學意義(P<0.05,見表3)。

表3 各組受檢者菌屬分布情況比較 菌屬數(%)Table 3 Comparison of the distribution of bacterial genera in subjects among five groups counts(%)

2.3 各組受檢者微生物分布特征比較

健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組患者菌落密集度正常占比分別為95.00%,80.00%,60.00%,50.00%,40.00%,CIN Ⅱ組和CIN Ⅲ組患者菌落密集度正常占比明顯低于健康組,CC組患者菌落密集度正常占比明顯低于CINⅠ組和健康組,差異均有統計學意義(P<0.05);健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組、CC組五組患者菌群多樣性正常占比分別為90.00%,65.00%,55.00%,30.00%,20.00%,CIN Ⅱ組、CIN Ⅲ組、CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于健康組,CIN Ⅲ組、CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于CINⅠ組,差異均有統計學意義(P<0.05,見表4)。

表4 各組患者微生物分布特征比較 例(%)Table 4 Comparison of microbial distribution characteristics in subjects among five groups cases(%)

2.4 CC患者治療前后群落結構比較

相較于治療前,治療后CC組患者厚壁菌門占比明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見表5);相較于治療前,治療后CC組患者乳酸桿菌屬占比明顯降低,差異具有統計學意義(P<0.05,見表6)。

表5 CC患者治療前后菌門分布情況比較 菌門數(%)Table 5 Comparison of the distribution of bacterial phyla in CC patients before and after treatment counts(%)

表6 CC患者治療前后菌屬分布情況比較 菌屬數(%)Table 6 Comparison of the distribution of bacterial genera in CC patients before and after treatment counts(%)

2.5 CC患者治療前后微生物分布特征比較

治療前CC組患者菌落密集度異常和菌群多樣性異常占比分別為60.00%和80.00%,治療后CC組患者菌落密集度異常和菌群多樣性異常占比分別為70.00%和90.00%,治療前、后菌落密集度和菌群多樣性異常情況比較差異無統計學意義(P>0.05,見表7)。

表7 CC患者治療前后微生物分布特征比較 例(%)Table 7 Comparison of microbial distribution characteristics of CC patients before and after treatment cases(%)

3 討論

宮頸疾病是目前臨床常見的女性生殖系統疾病,從CIN發展至CC是一個持續性、漫長的過程,但臨床癥狀不典型,無法引起患者的重視,部分患者就診時已處于癌癥階段,治療效果及預后普遍較差[9,10]。目前研究認為,陰道微生物分布特征及群落結構變化與宮頸病變的發生及發展密切相關[11,12],分析陰道微生態結構與宮頸疾病的關系有助于早期篩查宮頸疾病,對臨床診斷及治療方面發揮一定指導作用。

微生物群落平衡一般被認為是健康的標志。既往研究發現,健康女性的陰道菌門大部分由厚壁菌門組成,乳酸桿菌屬是育齡婦女健康陰道細菌群落中發現的優勢微生物屬群,被認為是對抗病原體的第一道防線[13,14]。乳酸桿菌屬在陰道中寄生,通過競爭營養來源、產生乳酸、細菌素及生物表面活性物質等代謝物對抗其他細菌的黏附和生長,達到一種微生態動態平衡,保護宿主陰道上皮細胞免受性傳播感染,還可增強子宮頸到子宮的精子的活力[15,16]。據報道,在健康的陰道里還可生存25種其他微生物,包括加德納菌屬、奇異菌屬、葡萄球菌、鏈球菌等,當乳酸桿菌屬相對豐度下降,其他厭氧菌及雜菌快速生長,不僅破壞陰道防御機制,還可導致有害代謝物質堆積,外來病毒侵襲能力增強,最終誘導宮頸疾病的發生及發展,最終誘發CC[17,18]。本研究中,健康組、CCINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組受檢者菌門分布以厚壁菌門為主,但占比逐漸下降,放射菌門、擬桿菌門、其他菌門占比逐漸增加。健康組、CINⅠ組、CINⅡ組、CINⅢ組和CC組菌屬分布以乳酸桿菌屬為主,但占比逐漸下降,加德納菌屬、奇異菌屬、其他菌屬占比逐漸增加,CC組患者以加德納菌屬為主,占比25.24%。說明當厚壁菌門、乳酸桿菌屬相對豐度下降,微生物群落結構紊亂時,其他厭氧菌及雜菌過度生長,可誘導CIN及CC的發生及發展,早期監測女性陰道微生物群落結構變化,有助于早期預測宮頸疾病的發生風險,在臨床篩查CIN及CC等宮頸疾病具有一定指導意義,適當調節陰道微生物變化有助于增強陰道防御系統,降低宮頸疾病的發生。

1994年,學者首次發現陰道微生物群分布改變與HR-HPV感染存在密切聯系[19],當機體陰道乳酸桿菌屬占比降低,厭氧菌過度生長時,陰道防御系統降低,HR-HPV感染風險越高,HPV病毒表達越強[20,21]。aniewski等[22]研究認為,泌尿生殖器微生物群與婦科癌癥有關,特別是與CC的發生及發展密切相關。本實驗中,CC組患者菌落密集度正常占比明顯低于CINⅠ組;CIN Ⅲ組和CC組患者菌群多樣性正常占比明顯低于CINⅠ組。說明陰道微生物分布改變與宮頸疾病的發生、發展密切相關,與Mitra等[23]研究結果相近,該研究認為,陰道微生物群成分可能是未來預測宮頸疾病治療效果及預后監測的生物標記物,同時也為制定新的預防和治療戰略提供參考。另外本研究發現,相較于治療前,治療后CC組患者厚壁菌門占比明顯降低;治療后CC組患者乳酸桿菌屬占比明顯降低。治療后菌落密集度、菌群多樣性異常占比較治療前加重,但差異無統計學意義。說明CC治療過程中可能影響陰道微生物的分布及群落結構改變,對陰道微生態造成不良影響,導致陰道乳酸桿菌屬進一步減少,容易造成感染等并發癥,究其原因,放化療或手術治療可對陰道優勢菌群造成直接破壞,增加菌群多樣性[24],另外放化療也可通過損傷機體免疫功能及內分泌功能損傷陰道微生態[25],治療期間監測陰道微生態改變可能幫助降低感染等并發癥發生風險,有助于改善患者預后情況。

綜上所述,在不同階段宮頸病變中,陰道微生物分布特征、群落結構出現明顯改變,CC治療可能對陰道微生物分布特征、群落結構造成不良影響,因此治療期間需關注陰道微生態失衡情況。但由于本研究納入對象均為我院就診人員,樣本量較少,研究結果可能存在一定誤差,另外由于本研究時間較短,尚未分析遠期預后與宮頸病變女性陰道微生物分布特征、群落結構變化,未來將以此為方向進一步進行探究。