基于高通量測序分析建曲發酵過程中微生物多樣性變化△

譚斯尹，潘禮業，羅宇琴，李國衛*，陳向東，孫冬梅，張軍

1.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；

2.廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

建曲始載于清代《藥性考》[1]，產自福建泉州，又名泉州神曲、百草曲、范志神曲，其制作始于明、清年間，已有四百多年歷史，清朝趙子敏、陳修園等名醫均著書詳述[2]?！侗静菥V目拾遺》曰：“建曲出福建泉州府開元寺造者佳，此由采百草號成，故又名百草曲……福建泉州府城內范志昊亦飛馳名萬應神曲……店住學院考棚邊桂壇巷內，觀音亭頂南畔第三間，范志吳牌匾記?！盵3]建曲有調胃健脾、消積進食、和中解酒、止瀉利水的作用，常用于治療四時不正之氣、感冒發熱、頭?？人约皞掣雇?、痞滿氣痛、嘔吐瀉泄痢疾、飲食不進等癥[3]。

根據《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》中建曲的制備方法，將廣藿香、蒼術、厚樸等23 味藥與麥麩、面粉混勻后制成方塊，經自然發酵后干燥而得[4]。從現代微生物學的角度，建曲的發酵過程實質是微生物生長、演替、互作和代謝的過程，通過微生物和酶的催化與分解，使藥物發泡、生衣，微生物產生的次生代謝物、蛋白酶、消化酶和低聚糖等新的活性成分為建曲的功能藥效提供了必要的支持；低聚糖、單糖等成分能協助腸胃發揮正常功能、預防胃炎和腸胃潰瘍[5-6]。在歷代《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）中，建曲均以“遍起白霉，有酒香氣”為其發酵炮制終點的判斷標準，人為主觀因素影響較大，況且有些廠家為了美觀會將建曲發酵終點提前，并未達到“遍起白霉”的發酵程度，無法保證用藥安全[7]。此外，自然發酵由于不同時期的溫濕度和發酵時長存在差異，造成發酵產物和微生物種類和數量不可控，導致同一產地不同批次或不同產地的建曲藥效和品質存在差異。

利用優勢菌種建立的發酵工藝，可改善自然發酵中雜菌多、時間長等不穩定性[8]。目前，關于建曲發酵菌群的研究較少[7,9]，尤其有關建曲中真菌的群落結構研究鮮有報道。因此，本研究參照《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》，以自然發酵條件下符合藥用標準的建曲為研究對象，從發酵微生物角度進行定性表征，通過高通量測序技術，揭示了在同一發酵條件下，建曲發酵過程中微生物結構和功能的變化，以及優勢物種，明確了建曲發酵中的主要功能微生物，為后續建立穩定可控的建曲現代發酵工藝提供參考。

1 材料

1.1 樣品

建曲原料藥材（辣蓼、蒼耳草、青蒿、苦杏仁、赤小豆、麥芽、炒山楂、陳皮、廣藿香、蒼術、厚樸、川木香、白芷、檳榔、麩炒枳殼、紫蘇、薄荷、谷芽、官桂、香附、甘草）來自廣東一方制藥有限公司，經廣東一方制藥有限公司孫冬梅主任中藥師鑒定，均符合《中國藥典》2020 年版及《四川省中藥材標準》2010年版的規定，樣品信息見表1。

表1 建曲原料藥材信息

1.2 試藥

FastDNA ? Spin Kit for Soil 試劑盒（批號：116560200-CF，MP Biomedicals 公司）；TransStart Fastpfu DNA 聚合酶（批號：AP221-01，TransGen公司）；AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（批號：APGX-250，AXYGEN 公司）；TruSeqTM DNA Sample Prep Kit（批號：FC-121-3001，Illumina公司）。

1.3 儀器

Nanodrop2000 型微量紫外-可見光分光光度計（Thermo Scientific公司）；GeneAmp? 9700型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Applied Biosystems公司）；Quanti Fluor? -ST型藍色熒光定量系統（Promega公司）。

2 方法

2.1 樣品制備

參照《中華人民共和國衛生部藥品標準·中藥成方制劑》中建曲的制備方法[4]，除麥麩、面粉外，將其余辣蓼等21 味藥材粉碎成細粉，與麥麩混勻，過三號篩，再將面粉制成適量稀糊，趁熱與上述藥粉揉合均勻，以手捏成團，擲之即散為宜，制成方塊，塊間留有空隙，上蓋麻袋，藥塊置密閉室內自然發酵3 d（發酵結束點為72 h），至藥塊遍起白霉，有酒香氣時取出，炕干。隨后，分別在0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h 進行取樣，每個取樣時間點分別隨機取3 個平行樣品，用無菌手術刀切取樣品2～3 g，切下的樣品放置于-80 ℃下保存備用。

2.2 樣品總DNA提取

建曲樣品用FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒進行提取，用Nanodrop2000型微量紫外-可見光分光光度計檢測DNA的濃度和純度，于-80 ℃保存。

2.3 Illumina MiSeq高通量測序

樣品送至上海美吉生物公司進行高通量測序?；贗llumina MiSeq 測序平臺，利用16S rRNA（338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAG CAG-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）和ITS（ITS1F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAA GTAA-3'和ITS2R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATG C-3'）通 用引物進行雙末端測。

2.4 數據分析

利用美吉生物云平臺（https://www.majorbio.com/web/www/index）對樣品序列按最小序列數進行抽平化后，利用QIIME 1.9.1 軟件過濾低質量序列和去除嵌合體，獲得有效序列。利用Usearch 11 軟件對操作分類單元（OTUs）進行聚類，聚類標準為核苷酸序列相似度＞97%。利用Silva 數據庫（http://rdp.cme.msu.edu/）和Unite數據庫（http://unite.ut.ee/index.php）分別對每個OTU 的代表性16S rRNA和ITS 基因序列的分類學位置進行分析，置信閾值為70%。利用Mothur 1.30.2 軟件對包括Shannon、Chao1和Good's coverage 在內Alpha多樣性指數進行計算。用Canoco 5.0 軟件進行細菌群落結構的非度量多維尺度分析（NMDS），并用ANOSIM/Adonis基于Bray-Crutis距離計算樣品間群落組成的差異性。運用Wilcoxon 秩和檢驗分析組間物種豐度的差異。所有統計學分析均利用SPSS v25.0 軟件計算，顯著性水平閾值為P＜0.05。使用PICRUSt 1.1.0 軟件對OTU 豐度表進行標準化，測序數據比對京都基因與基因組百科全書數據庫（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）對菌群代謝功能進行預測。

3 結果

3.1 物種注釋

從30個建曲發酵樣品DNA測序中共獲得1 695 154條真菌有效序列，平均長度為232 bp，522 個OTUs（表2）；共獲得1 563 314 條細菌有效序列，平均長度為414 bp，457 個OTUs（表3）?；贠TU 的Alpha 多樣性分析可知，所有樣品真菌和細菌的Good's coverage 分別為99.82%～100.00% 和97.04%～99.53%，表明測序數據可真實反映樣本的微生物多樣性。

表2 30個建曲發酵樣品中真菌的Illumina測序數據統計分析（±s,n=3）

注：與0 h比較，*P＜0.05，#P＜0.01；表3同。

表3 30個建曲發酵樣品中細菌的Illumina測序數據統計分析（±s,n=3）

表3 30個建曲發酵樣品中細菌的Illumina測序數據統計分析（±s,n=3）

本研究通過Shannon 指數和Chao 指數來表示菌群的多樣性和豐富度。在整個發酵過程中，建曲的真菌群落多樣性（P＜0.05）和豐富度（P＜0.05）顯著比細菌的高。發酵前24 h（0～24 h）的真菌和細菌群落多樣性（P＜0.05）和豐富度（P＜0.05）顯著比發酵后32 h（32～72 h）高。隨著發酵時間推移，真菌群落多樣性和豐富度呈下降趨勢，而細菌群落多樣性和豐富度則先降后升，表明了在建曲發酵過程中真菌和細菌群落存在明顯演替現象。

3.2 建曲發酵過程中微生物群落結構特征

在屬水平上（圖1A），建曲真菌的優勢類群為曲霉菌屬（Aspergillus），占總真菌的36.57%。發酵前24 h，真菌群落組成變化較小，主要由曲霉菌屬（平均相對豐度為17.21%）、鏈格孢霉菌屬（Alternaria，10.82%）、鐮刀霉菌屬（Fusarium，8.87%）、枝孢菌（Cladosporium，7.17%）、赤霉菌屬（Gibberella，5.33%）和節擔菌屬（Wallemia，4.84%）等真菌組成。自發酵后32 h，真菌群落結構發生較大的變化，曲霉菌屬的相對豐度隨著發酵時間延長而增加（49.49%，P＜0.05），而鏈格孢霉菌屬（2.44%，P＜0.05）、鐮刀霉菌屬（3.34%，P＜0.05）、枝孢菌屬（2.48%，P＜0.05）、赤霉菌屬（1.67%，P＜0.05）等主要真菌類群的相對豐度則減少。

圖1 屬水平上建曲真菌和細菌的群落結構

對于細菌群落其變化趨勢與真菌相似（圖1B），細菌群落組成同樣在發酵前24 h 變化較小，但種類較單一。建曲中主要由泛菌屬（Pantoea）、魏斯菌屬（Weissella）、紅球菌屬（Rhodococcus）、片球菌屬（Pediococcus）和不動桿菌屬（Acinetobacter）組成，其中泛菌屬作為優勢類群占總細菌的17.45%。發酵前24 h 的優勢類群為泛菌屬（24.32%）和紅球菌屬（29.65%），發酵后32 h 到結束，兩者相對豐度下降（P＜0.05），分別占總細菌的12.87%和4.78%，但魏斯菌屬（25.27%）、片球菌屬（19.52%）和不動桿菌屬（18.01%）的相對豐度明顯增加，在發酵結束時，不動桿菌屬成為絕對優勢菌屬，相對豐度達到36.71%。

在種水平上（圖2A），建曲真菌的變化趨勢與屬水平相似，主要由溜曲霉Aspergillus tamarii、小菌核曲霉Aspergillus minisclerotigenes、unclassifiedAspergillus和unclassifiedAlternaria這4 種真菌組成。發酵前24 h，溜曲霉和小菌核曲霉均不是優勢物種，但兩者在合適的發酵條件下快速繁殖，在發酵后32 h 成為最優勢菌群，分別占總真菌的22.30%和21.19%，而unclassifiedAspergillus（3.90%，P＜0.05）、unclassifiedAlternaria（2.41%，P＜0.05）、unclassifiedFusarium，（3.08%，P＜0.05）和Cladosporium delicatulum（2.21%，P＜0.05）等 真菌相對豐度則減少（P＜0.05）。

對于細菌群落（圖2B），與屬水平上的變化趨勢相似。發酵前24 h，建曲細菌由紅串紅球菌Rhodococcus erythropolis（29.56%）和unclassifiedPantoea（23.02%）占主要優勢。發酵后32 h，紅串紅球菌（4.69%，P＜0.05）和未分類泛菌屬（2.57%，P＜0.05）相對豐度顯著下降，而類腸膜魏斯 菌Weissella paramesenteroides、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus和約氏不動桿菌Acinetobacter johnsonii迅速成為優勢類群，分別占總細菌的25.24%、19.52%和13.99%，發酵結束時約氏不動桿菌占24.84%，成為絕對優勢菌。

基于OTU水平的NMDS分析可知（圖3），發酵前24 h 的建曲真菌（P＜0.05）和細菌（P＜0.05）群落與發酵后32 h的群落分別沿第二軸和第一軸分開，且不同發酵時間的建曲真菌和細菌群落結構差異也有統計學意義（P＜0.05），這些聚類趨勢與Alpha 多樣性指數（表2、表3）、微生物群落（圖1、圖2）結果一致，說明了發酵時間的延長會導致建曲微生物群落結構變化。

圖3 基于OTU水平的建曲真菌和細菌群落的NMDS分析

3.3 建曲發酵過程中微生物群落組成比較

通過韋恩圖分析建曲不同發酵時期所共有和獨有的OTU數目（圖4）。從分析結果可以看出，10組建曲樣品中真菌和細菌的OTUs 總共97 個和77 個，其中共有OTUs 數目分別為97 個和31 個。值得注意的是，真菌特有的OTUs 數為0 個，而細菌特有的OTUs 數為46 個，主要集中在發酵結束時，其特有的OTUs數為31個，其占細菌OTUs總數的40.26%。表明了盡管不同發酵時期建曲中的真菌的優勢類群有所變化，但其菌群種類基本一致，而細菌種類則在發酵結束出現較大變化。

圖4 不同發酵時期建曲真菌和細菌中共有的和特有的OTU數分析

3.4 建曲微生物群落功能預測分析

使用PICRUSt 對真菌進行功能分類有助于理解建曲在發酵中化學成分的轉化過程。從圖5 可知，真菌和細菌的功能代謝變化趨勢與其群落結構變化一致。在整個發酵過程，真菌中具有氧呼吸代謝功能的類群占比最高（10.61%），細菌則是具有轉運蛋白（transporters、ABC transporters）的類群最高（11.74%）。發酵前24 h，真菌和細菌的功能變化不明顯。發酵后32 h，尤其在發酵56 h 到結束階段，真菌中具有脂肪酸的β-氧化（fatty acid β-oxidation）功能、甲基酮生物合成（methyl ketone biosynthesis）功能、甘露糖生物合成（GDPmannose biosynthesis）功能、磷酸泛酸生物合成（phosphopantothenate biosynthesis Ⅰ）功能等相對豐度顯著升高（P＜0.05）；而細菌主要是DNA 修復與重組蛋白（DNA repair and recombination proteins）、嘌呤代謝功能（purine metabolism）增加。在發酵40 h 時，細菌中有關氨基酸合成代謝活躍，如核糖體功能（ribosome）、DNA 復制蛋白（DNA replication proteins）、丙酮酸代謝（pyruvate metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代謝（amino sugar and nucleotide sugar metabolism）等功能的相對豐度均明顯增加，這與類腸膜魏斯菌和紅串紅球菌相對豐度迅速上升有關。表明了建曲中含有豐富的代謝途徑相關的真菌和細菌功能基因，而且不同發酵時間點部分微生物所發揮的功能也不同。

圖5 真菌和細菌的基因功能預測熱圖

4 討論

傳統微生物分離技術是在特定的條件下利用培養基對微生物進行分離培養，方便直觀，由于環境條件的改變和微生物的自然協作方式改變[10]，使得很多菌類無法培養，難以全面反映樣品中整個微生物的結構情況，可能還會使得一些具有重要生物功能的微生物資源被忽視[11]。近年來，高通量測序技術已被國內外學者廣泛應用到環境、生物、食品等微生物多樣性研究中，也逐漸成為中藥微生物資源研究的熱門手段，如三七[12]、霍山石斛[13]、黃芪[14]等。本研究采用Illumina 高通量測序技術對發酵中建曲的真菌和細菌菌群進行鑒定，系統地揭示了建曲的微生物群落結構，初步了解建曲在發酵過程中菌群的變化與差異。

本研究共獲得真菌和細菌的有效序列為3 258 468條，充分反映了建曲發酵過程中微生物群落結構。Alpha 多樣性分析顯示（表2、表3），建曲的真菌群落有較高的多樣性和豐富度，與袁學剛等[15]對連梔礬溶液發酵炮制過程中真菌菌群的研究結果相似，表明建曲發酵過程主要由真菌主導。群落結構分析（圖1）顯示，建曲中的真菌主要由曲霉屬組成，細菌主要由泛菌屬、魏斯菌屬、紅球菌屬、片球菌屬和不動桿菌屬組成，與廖茜[9]的研究結果不同，其發酵中的建神曲主要由乳桿菌Lactobacillus、綠膿桿菌Pseudomonas、芽孢桿菌Bacillus、假黃色單胞菌屬Pseudoxanthomonas等12 種細菌屬組成，可能是由于建曲原料帶有的菌種和發酵環境的不同，導致獲得的微生物類群也不同。在發酵前24 h 的真菌和細菌種類均比發酵后32 h 多，進入發酵階段后優勢菌群逐漸顯現（圖1、圖2），這與陳彥琳等[5]的研究結果一致，反映了發酵初期建曲原料中營養物質豐富，各類群處于均衡狀態，自帶的物種多樣性較高。到了發酵中后期，營養物質開始減少，各類群開始掠奪養分，種內外斗爭激烈，且建曲中的辣蓼、蒼耳草、青蒿等藥材有抑菌作用，這些藥物成分在發酵過程中對微生物存在自然選擇作用，使得整個發酵過程存在明顯的菌群演替現象。

本研究發現建曲中有較多真菌具有降解生物質的能力，如鐮刀菌屬能產木質纖維素降解酶[16]、根霉菌屬具有極強的蛋白質分解能力[17]等。其中，真菌的優勢類群為曲霉屬，其微生物分泌酶系最廣泛，是目前酶制劑生產和工業發酵的最主要菌株，提高了發酵物中大分子物質向小分子物質的轉化速度[18]。而其中的優勢物種為溜曲霉和小菌核曲霉，溜曲霉屬于殼霉目（Discellaceae）杯霉科（Aspergullus）曲霉屬，主要生長在腐霉物、土壤、塑料管等各種不同基質上[19]。目前，關于溜曲霉和小菌核曲霉的次生代謝產物的研究較少，溜曲霉的代謝產物主要為生物堿和環肽類化合物，從浮木中的溜曲霉分離得到的五環辛吲哚類生物堿具有Ca2t-ATPase 抑制活性、組蛋白去乙?；敢种苹钚院蛯μ冱S微球菌Mycrococcus luteus的抗菌活性[20]；與藥用植物內共生的溜曲霉的活性物質主要為吲哚二酮哌嗪生物堿類化合物，該生物堿家族中具有很多抗腫瘤活性的天然產物，對腫瘤細胞的增殖有抑制作用[21]。此外，溜曲霉具有果膠酶、纖維素酶和半纖維素酶等多種酶系統，可通過纖維素產生蛋白[22]，而建曲中含有大量的纖維素，促進了該菌的生長和物質代謝，正因為溜曲霉和其他菌群的代謝產物功能多樣，使得建曲發揮著多種治療藥效。由于建曲屬于多藥材混合發酵，含有多種活性物質，發酵中菌群結構的變化會對建曲中的藥效成分產生不可避免的影響，且單一的特定菌種并不能達到混合菌種發酵的互補優勢。后續可嘗試利用優勢真菌溜曲霉、小菌核曲霉、優勢細菌約氏不動桿菌等菌種接種到建曲中，進行單獨和混合發酵，減少雜菌生長，縮短發酵周期，考察建曲的活性物質和藥效的變化，探索建曲質量和藥效更為穩定的發酵工藝方法。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。