UPLC-MS/MS同時測定麥冬配方顆粒中4個成分的含量及山麥冬成分的檢查△

劉斌，張力偉，王煦辰，孔令紅，趙海燕，周海燕，丁富娟

1.泰安市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 泰安 271000；

2.泰安市岱岳區疾病預防控制中心，山東 泰安 271000

麥冬配方顆粒是由百合科植物麥冬Ophiopogon japonicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根經炮制并按照標準湯劑的質量標準加工制成的配方顆粒，具有養陰生津、潤肺清心的功效，適用于肺燥干咳、津傷口渴、腸燥便秘等癥狀[1]。目前，麥冬配方顆粒的國家藥品標準和各企業標準中含量測定均采用紫外-可見分光光度法檢測，以魯斯可皂苷元代表麥冬總皂苷的含量，樣品處理步驟繁瑣、重復性差、準確度低、質量控制不夠全面。山麥冬（湖北麥冬或短葶山麥冬）與麥冬性狀相似，容易混淆，市售麥冬中混入山麥冬的情況時有發生，但現行的質量標準缺乏有效的檢查方法，無法對麥冬中混有山麥冬進行有效的質量控制[2-9]。本研究結合相關研究[10-19]，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜法（UPLCMS/MS），同時測定麥冬配方顆粒中麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、甲基麥冬黃烷酮A、甲基麥冬黃烷酮B 4個成分的含量并聚類分析，可以較為快速、全面地評價麥冬配方顆粒的質量，并對山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 這2 個山麥冬的專屬性成分進行檢測，以檢查麥冬配方顆粒生產用麥冬中是否混有湖北麥冬和短葶山麥冬，為其質量控制提供了一些科學依據。

1 材料

1.1 樣品

26 批麥冬（川麥冬）配方顆粒均為市售樣品，詳細信息見表1。麥冬（川麥冬）、山麥冬（湖北麥冬）、山麥冬（短葶山麥冬）購自安徽亳州中藥材市場，經泰安市食品藥品檢驗檢測研究院王海燕主任中藥師鑒別為正品。

1.2 試藥

對照品山麥冬皂苷B（批號：111907-201804，純度：100%）、短葶山麥冬皂苷C（批號：111908-202303，純度：100%）均購自中國食品藥品檢定研究院；麥冬皂苷C（批號：PS020821，純度：98.0%，成都普思生物科技股份有限公司）；麥冬皂苷D（批號：MUST-22051503，純度：98.72%）、麥冬甲基黃烷酮A（批號：MUST22042305，純度：98.42%）、麥冬甲基黃烷酮 B（批號：MUST22032304，純度：99.77%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈、甲酸為質譜純；水為超純水；甲醇為色譜純。

1.3 儀器

Vanquish UHPLC 型超高效液相色譜儀、TSQ Quantis Plus 型三重四極桿質譜儀均購于美國賽默飛世爾公司；XS205 DU 型十萬分之一電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多集團）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件和質譜條件

Acquity BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～0.5 min，20%A；0.5～10.0 min，20%～90%A；10.0～14.0 min，90%A）；流速為0.2 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL。離子源采用電噴霧離子源（ESI）；離子化電壓：正離子3.5 kV，負離子2.5 kV；離子源溫度為350 ℃ ；噴霧氣壓力為3.5×105Pa；輔助加熱氣壓力為1.0×105Pa；碰撞氣為氮氣；掃描模式采用多反應監測模式（MRM），質譜參數見表2。

表2 麥冬樣品檢測質譜參數

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備溶液和混合對照品溶液的制備精密稱取麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C 對照品適量，分別加甲醇制成質量濃度為203.6、204.6、226.6、195.6、211.2、202.6 μg·mL-1對照品儲備溶液。再分別精密量取對照品儲備溶液1 mL，置于同一20 mL 量瓶中，加甲醇制成麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C質量濃度分別為10.2、10.2、11.3、9.8、10.6、10.1 μg·mL-1的混合對照品溶液。色譜圖見圖1、圖2。

圖1 混合對照品和麥冬配方顆粒樣品的MRM離子流色譜圖（疊加圖）

圖2 6個對照品定量與定性離子對疊加圖

2.2.2 供試品溶液的制備 取麥冬配方顆粒，研細，精密稱取1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。色譜圖見圖1。

2.2.3 對照藥材溶液的制備 根據麥冬配方顆粒的制備工藝，分別取麥冬（川麥冬）、山麥冬（湖北麥冬）及山麥冬（短葶山麥冬）各1.1 g，加水100 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液減壓濃縮至干，殘渣按2.2.2 項下方法“置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL”起，同法制成麥冬（川麥冬）、山麥冬（湖北麥冬）和山麥冬（短葶山麥冬）的對照藥材溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密量取2.2.1 項下的混合對照品溶液0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL，分別置100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成不同質量濃度的標準溶液，在2.1 項下條件測定。以質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，結果見表3，6 個成分r≥0.995，表明在線性范圍內線性良好。

表3 6個待測成分的線性回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限

2.3.2 檢測限和定量限 精密量取2.2.1 項下的最低質量濃度混合對照品溶液，加甲醇稀釋至不同質量濃度，搖勻，按2.1 項下條件測定，以各化合物峰信噪比（S/N）為3 和10 分別作為檢測限和定量限，結果見表3。

2.3.3 專屬性試驗 分別取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、對照藥材溶液，按2.1 項下條件進樣測定。供試品溶液和麥冬（川麥冬）對照藥材溶液中的麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 與混合對照品溶液中的離子峰一致，且無與山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C一致的離子峰，山麥冬（湖北麥冬）對照藥材溶液中的山麥冬皂苷B 與混合對照品溶液中的離子峰一致，山麥冬（短葶山麥冬）對照藥材溶液中的短葶山麥冬皂苷C 與混合對照品溶液中的離子峰一致，陽性供試品溶液檢出與混合對照品溶液中山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C一致的離子峰，結果見圖3。由此可以判斷，山麥冬皂苷B為山麥冬（湖北麥冬）的專屬性成分，短葶山麥冬皂苷C為山麥冬（短葶山麥冬）的專屬性成分，可以通過檢測山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 來準確判定麥冬配方顆粒中是否含有山麥冬（湖北麥冬）和山麥冬（短葶山麥冬）。

2.3.4 精密度試驗 精密量取2.2.1 項下的混合對照品溶液1 mL，置100 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，在2.1項下條件測定，重復測定6次，結果麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 峰面積的RSD 分別為1.19%、1.32%、0.92%、0.73%、1.58%、1.79%，表明儀器的精密度良好。

2.3.5 穩定性試驗 取麥冬配方顆粒（S1），按2.2.2 項下方法制備，分別于0、4、8、12、16、20、24 h，按2.1 項下條件測定，結果麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C峰面積的RSD分別為1.51%、1.68%、1.40%、1.78%、1.60%、1.43%，表明6個成分在溶液中24 h內穩定性良好。

2.3.6 重復性試驗 取麥冬配方顆粒（S1），按2.2.2 項下方法平行制備6 份，按2.1 項下條件測定，分別計算麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C 的含量，結果6 個成分平均質量分數分別為14.1、24.4、14.7、8.7、22.4、3.2 μg·g-1，含量的RSD分別為2.02%、1.91%、1.52%、1.85%、1.70%和1.33%，表明方法的重復性良好。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知含量的麥冬配方顆粒（S1）0.5 g，精密稱定，平行稱取6 份，分別精密加入2.2.1 項下的混合對照品溶液1 mL，按2.2.2 項下方法制備，按2.1 項下條件測定，計算麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B 和短葶山麥冬皂苷C 的平均加樣回收率，見表4。

表4 麥冬配方顆粒6個成分的加樣回收試驗結果

2.3.8 含量測定 分別取26 批麥冬配方顆粒，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下條件測定，計算各批次樣品中麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C的含量，結果見表5。麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 的質量分數分別為6.4～17.3、15.1～29.1、9.0～22.6、4.5～14.4 μg·g-1，不同批次間4 個成分的含量有一定差異，因樣品檢測均執行企業標準，其規格（每1 g 配方顆粒相當于飲片）有1.10、1.11、1.20、3.30、3.33 g·g-15 種，分析差異可能與麥冬原料藥材和規格不同有關。以儀器的定量限換算設定麥冬配方顆粒中山麥冬皂苷B 的限度為0.29 μg·g-1、短葶山麥冬皂苷C的限度為0.10 μg·g-1，有3 批次樣品中檢出山麥冬皂苷B，其中2 批同時檢出短葶山麥冬皂苷C，表明原料中混入了湖北麥冬、短葶山麥冬。

2.4 聚類分析

以麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 4 個共有成分為變量，運用SPSS 24.0 軟件，以平方歐氏距離為測度對26 批麥冬配方顆粒進行聚類分析，結果見圖4。由圖4可知，當類間距為15、10 和5 時，26 批樣品聚類數目分別為2、4、8類。當類間距為5時，廣東一方制藥有限公司、青州堯王制藥有限公司的樣品分別聚為一類；當類間距為15 時，江陰天江藥業有限公司、山東一方制藥有限公司、華潤三九醫藥股份有限公司的樣品分別聚為一類。由此可見，不同批次間4 個成分的含量和總量存在差異，不同廠家樣品間的差異較大，表明麥冬配方顆粒的質量有一定差異，分析可能與麥冬原料和生產工藝有關，也可能與質量控制標準中規格不一致有關，北京康仁堂藥業有限公司的2批次間差異亦較大，其S1 樣品檢出山麥冬成分，分析主要與麥冬原料質量有關。

圖4 26批麥冬配方顆粒的聚類分析

3 討論

3.1 提取方式的選擇

本研究分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇作為提取溶劑，分別采取超聲（15、30、60 min）或加熱回流（30、60、90 min）提取麥冬配方顆粒樣品，取續濾液作為供試品溶液，按2.1 項下條件測定。結果顯示，采用50%甲醇為提取溶劑時各色譜峰峰形及響應值均較好，且超聲提取30 min已提取完全，因此，采用50%甲醇超聲30 min 作為提取方法。

3.2 質譜條件的優化

分別對麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B、山麥冬皂苷B和短葶山麥冬皂苷C 6 個成分進行了正、負離子模式掃描，結果顯示山麥冬皂苷B 在正離子檢測模式下的響應較強，且穩定性較高，因此，選用正離子模式檢測；其他5 個成分在負離子檢測模式下響應較強，因此，選用負離子模式檢測麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 和短葶山麥冬皂苷C。采用MRM 掃描，通過對子離子的射頻電壓和碰撞能量進行優化，分別選擇豐度高的子離子作為定量離子。

3.3 色譜條件的選擇

分別考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相，發現0.1%甲酸水溶液離子化效果更好，乙腈比甲醇分離效果更好，因此，選用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相，并采用梯度洗脫方式優化，使色譜峰分離效果更好、峰形較好，且出峰時間與柱平衡時間較短，提高了實驗效率。采用優化的色譜條件，分別使用賽默飛世爾TSQ Quantis Plus和島津LCMS8050 兩種液相色譜-質譜聯用儀，Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Shimadzu Shim-pack Velox C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity UPLCHSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3種色譜柱考察6個成分的分離效果，結果均較好。

3.4 結果分析

本研究通過對26批麥冬配方顆粒中麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 4 個成分進行含量測定和聚類分析后發現，5 個廠家中同廠家樣品之間4 個成分含量和總量的差異較小，不同廠家樣品間4 個成分的含量和總量的差異較大，說明不同廠家對于原料的質量和生產的控制還缺少統一的標準。通過對26 批麥冬配方顆粒檢查發現有3 批次樣品檢出山麥冬皂苷B，其中2 批同時檢出短葶山麥冬皂苷C，說明其生產使用的麥冬原料中存在混入湖北麥冬、短葶山麥冬的情況，需要提高麥冬的檢驗標準并加強對原料的質量控制。

4 結論

本研究建立了UPLC-MS/MS 同時測定麥冬配方顆粒中麥冬皂苷C、麥冬皂苷D、麥冬甲基黃烷酮A、麥冬甲基黃烷酮B 4 個成分的含量，并通過測定山麥冬皂苷B、短葶山麥冬皂苷C 來檢查是否混有山麥冬的方法，該方法樣品處理快速、簡單，檢測靈敏度高，準確度好，可用于評價和控制麥冬配方顆粒的質量，同時用于檢查麥冬原料是否混入山麥冬，為麥冬配方顆粒的質量控制提供可靠的分析方法和參考依據。

[利益沖突]本文不存在任何利益沖突。