雙黃連口服液質量一致性評價研究△

勞永真，徐凌川，趙桉熠，蘇江敏，郭叢，劉安，章軍*，劉艷*

1.中國中醫科學院 中藥研究所，北京 100700；

2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355

雙黃連口服液（SHLO）是由金銀花、黃芩、連翹按一定工藝制成的中藥制劑，方中金銀花清風溫熱、黃芩清腸中濕熱、連翹清心瀉火，主要用于外感風熱所致的發熱、咳嗽、咽痛等[1]。SHLO 的生產廠家有12家，市場規模超10億，但有研究表明，不同生產廠家產品質量存在差異[2]。目前，關于SHLO的質量評價方法較多，主要為采用紅外光譜法[3]、紫外光譜法[4]、高效液相色譜串聯質譜法[5]、核磁共振法[6]等方法對樣品中連翹酯苷A、綠原酸、咖啡酸、黃芩苷、木犀草素、黃芩苷、五?；ㄜ账岬瘸煞趾涂傸S酮[7-13]進行定性定量檢測。另有學者通過建立SHLO指紋圖譜評估樣品質量[14]，或利用生物效價評價方法測定SHLO 樣品的抗菌性[15]。雖然已有方法可從不同角度檢測SHLO 的有效成分、生物效應等，但這些數據基于不同平臺和不同樣品，彼此之間不能貫通使用，無法體現同類產品的優劣和一致性差異，無法區分市售產品的質量等級。

本研究旨在探索SHLO 的質量一致性，一方面將成藥指標成分與原料藥關聯，運用高效液相色譜法（HPLC）對來自SHLO 中3 味原料的6 個指標成分進行定性定量分析；另一方面將成藥指標成分與生產制造相關聯，考察樣本批內、批間質量差異，運用批內一致性差異值（PA）、批間一致性差異值（PB）、指紋圖譜相似率（PC）3個參數量化質量均一化水平，結合主成分分析（PCA）模型實現不同廠家SHLO 質量一致性評估，為SHLO 的質量提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司，包括G7117C 型四元梯度泵、G7129C 型自動進樣器、G7116A 型柱溫箱、G7104 型二極管陣列檢測器）；XSR105/A 型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-250DB 型超聲波清洗儀（蘇州昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品新綠原酸（批號：BCY-000316，純度≥98%）、綠原酸（批號：BCY-000315，純度≥98%）、連翹酯苷A（批號：BCY-000491，純度≥98%）、黃芩苷（批號：BCY-000376，純度≥98%）、連翹苷（批號：BCY-000490，純度≥98%）均購于江西佰草源生物科技有限公司；對照品漢黃芩苷（批號：1119-090905，純度≥98%，中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心有限公司）；乙腈（色譜純，上海星可高純溶劑有限公司）；磷酸（色譜純，北京邁瑞達科技有限公司）；甲醇（分析醇，天津富宇精細化工有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈飲料有限公司）。雙黃連口服液（每1 mL 相當于飲片1.5 g）來自8個生產廠家，產品信息見表1。

表1 雙黃連口服液樣品信息

2 方法

2.1 對照品溶液制備

分別取新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、連翹苷、漢黃芩苷對照品適量，用50%甲醇溶解，配制成質量濃度分別為35.3、29.9、41.9、41.3、18.9、41.3 μg·mL-1的混合對照品溶液和黃芩苷質量濃度為707.9 μg·mL-1的對照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

取本品1 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲提取5 min（功率為250 W，頻率為40 kHz），冷卻至室溫，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流速為0.9 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進樣體積為5 μL；流動相0.4%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，91%～88%A；10～12 min，88%～86%A；12～22 min，86%～83%A；22～48 min，83%～67%A；48～63 min，67%～36%A）；檢測波長為254 nm。HPLC圖見圖1。

圖1 對照品和SHLO樣品HPLC圖

2.4 質量一致性評價

為考察不同廠家樣品質量一致性情況，本研究引用PA、PB、PC3個一致性參數。PA為同批號5 個包裝單位樣品相同指標成分含量極差值與均值的百分比[16]，當所測指標數為n時，PA為n個指標成分一致性差異值的均值，按公式（1）計算。PB為5 個不同批號樣品相同指標成分含量極差值與均值的百分比[16]，當所測指標數量為n時，PB為n指標成分一致性差異值的均值，按公式（2）計算。

PC為各廠家5 個批號樣品指紋圖譜與生成對照圖譜的相似率，取供試品溶液在254 nm 下的色譜圖為指紋圖譜，將圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2.0 版），采用中位數法，時間窗寬度為0.1 min，經多點校正、全峰匹配后生成的圖譜為參照圖譜，計算各批樣品與生成圖譜的相似度，相似度最小值的百分值為PC。

2.5 化學計量分析

以8 個廠家3 個一致性參數為變量，采用SIMCA-P 13.0 軟件對變量以主成分特征值和累積方差貢獻率進行PCA。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 線性關系 計算各成分的線性回歸方程及范圍，結果見表2，在相應范圍內各成分的r均大于0.999 5，表明6 個成分的校準曲線表現出良好的線性相關性。

表2 SHLO中6個成分線性關系及范圍

3.1.2 精密度試驗 取批號為201208 的樣品制備供試品溶液，按2.3 項下色譜條件，連續進樣6 次，新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.2%、0.5%、0.3%、0.1%、0.7%、0.1%，表明儀器精密度良好。

3.1.3 穩定性試驗 選擇批號為201208 樣品的供試品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 分別進樣，新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷質量濃度的RSD分別0.5%、0.4%、0.2%、0.1%、0.3%、0.1%，表明供試品溶液24 h 內穩定性良好。

3.1.4 重復性試驗 取批號為201208 的樣品平行制備6 份供試品溶液，按2.3 項下色譜條件檢測，6 份供試品溶液中新綠原酸、綠原酸、連翹酯苷A、黃芩苷、連翹苷、漢黃芩苷質量濃度的RSD 分別0.4%、0.9%、0.9%、0.4%、0.9%、0.4%，表明該方法具有良好重復性。

3.1.5 加樣回收率試驗 精密稱取批號為201208的樣品0.5 mL，按2.2 項方法制備供試品溶液6 份。分別精密加入已知質量濃度的對照品溶液，按2.3項下條件測定，6 個成分的平均加樣回收率及RSD 見表2，說明該檢測方法準確性良好。

表2 SHLO中6個成分加樣回收率結果

3.2 含量測定

樣品中綠原酸、黃芩苷、連翹苷的質量濃度分別為0.66～1.25、12.71～21.89、0.39～0.66 mg·mL-1，依據《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》2020 年版（一部）對SHLO 的相關要求[17]，所有樣品均為合格品。樣品中新綠原酸、連翹酯苷A、漢黃芩苷的質量濃度分別為0.75～1.44、0.07～0.94、0.001 3～1.930 0 mg·mL-1（表3）。

表3 8個廠家40批SHLO中6個成分的質量濃度（n=2） mg·mL-1

對比不同廠家相同成分的質量均一性發現，不同廠家6 個指標成分質量濃度的RSD為0.5%～48.4%（綠原酸為2.3%～12.0%、黃芩苷為0.5%～3.6%、連翹苷為3.1%～10.6%、新綠原酸為3.2%～10.8%、連翹酯苷A為7.4%～39.7%、漢黃芩苷為10.3%～48.4%），即廠家間樣品含量控制水平不一，連翹酯苷A、漢黃芩苷的質量均一性較差。

為了比較不同廠家產品的質量、分析其與原料藥的關系，將6 個指標成分分為3 類并進行加和統計，以代表不同原料藥的含藥量結果。樣品含金銀花以新綠原酸和綠原酸總量計，含連翹以連翹苷和連翹酯苷A 總量計，含黃芩以黃芩苷和漢黃芩苷總量計。每個指標為來自同一廠家5 個批次的平均含藥量，結果見圖2。如圖2所示，各廠家樣品金銀花的含藥量為1.58～2.55 mg·mL-1，黃芩的含藥量為13.67～22.76 mg·mL-1，連翹的含藥量為0.60～1.29 mg·mL-1，各廠家產品質量存在明顯差異。連翹含藥量的差異達到每單位約2.2 倍。因采收時期不同，連翹可分為青翹和老翹?！吨袊幍洹?020年版規定，連翹苷質量分數不得少于0.15%，青翹的連翹酯苷A 質量分數不得少于3.5%，老翹的連翹酯苷A 質量分數不得少于0.25%，因此推測各生產廠家的連翹原料可能存在青翹、老翹混合使用的情況，導致質量差異較大。另外，不同廠家對產品質量的關注點不同，如T 廠家中金銀花和連翹成分含量較高，而X 廠家連翹和黃芩成分含量較高。

同一制造商不同指標組分的含藥量在限度要求之上變化無法直接比較產品質量，因此，統計SHLO 中3 個藥味的總含量以比較各樣品質量差異，結果見圖2D。8 個廠家SHLO 中代表性成分的總含藥量為16.47～26.16 mg·mL-1，其中X 廠家含藥量最高，Z 廠家最低，3 個成分中黃芩含藥量占比明顯高于其他藥味，表明其對產品質量影響最大，國家標準以其作為關鍵質量控制指標具有一定的合理性。

3.3 質量一致性

依據2.5 項下描述的質量一致性評價方法統計不同廠家產品的質量一致性參數，結果見表4。8 個廠家的PA為1.2%～7.7%，除Z廠家外，各PA≤3.6%，表明這些廠家批內一致性質量控制水平良好；PB為16.6%～39.1%，反映出不同廠家間批間質量控制存在差別，其中F、R 廠家的PB＜20%，T、S、X 3 個廠家20%＜PB＜30%，Z、L、J 3個廠家30%＜PB＜40%；各廠家PC均≥99.3%，表明其內部樣品整體相似度較高。

表4 8個廠家SHLO的質量一致性差異 %

3.4 PCA

以8 個廠家SHLO 的3 個一致性參數為變量進行性PCA 擬合，8 個廠家樣本的PCA 得分散點圖見圖3，2 個主成分累積方差貢獻率為88.7%，可以代表變量的大部分信息。

圖3 8廠家SHLO的PCA得分

對3 個一致性參數提取新的主成分，分別設置為p1 和p2，兩因子是不同樣本的第一和第二分量矩陣得分，新生成的主成分因子的表達公式分別為p1=0.604×PA+0.745×PB-0.284×PC、p2=0.537×PA-0.116×PB+0.836×PC。兩公式計算使用了成分矩陣的結果，有利于對不同樣本進行評分。隨后，以每個主成分的方差百分比作為權重，設置一致性區分因子（P），計算公式為P=0.504×p1+0.383×p2，各廠家得分結果見表5。根據分值可以將8個廠家分為3類，Z、L、J 3個廠家P值均大于30.0，分為一類；S、T、X 3個廠家25.0＜P＜30.0，分為一類；F、R 2個廠家P＜25.0，分為一類。由于P值越小一致性越好，該結果說明F 和R 2 個廠家產品一致性較好。

表5 8個廠家SHLO的主成分因子和一致性區分因子得分

4 討論

為盡可能對所選擇成分進行完全提取，本研究在樣品前處理部分（提取溶劑、料液比、提取時間）進行了詳盡的考察，為盡可能對各成分準確定量，將各成分在190～400 nm 掃描，發現連翹苷、黃芩苷和漢黃芩苷的最大吸收波長相差6 nm 以內，經綜合考慮最終選取278 nm 作為此3 個成分的檢測波長；新綠原酸、綠原酸及連翹酯苷A 的最大吸收波長相差4 nm 以內，故將330 nm 作為此3 個成分的檢測波長；在定性部分預先設定6 個檢測波長，比較不同波長下樣品的色譜峰數量、峰形、分離度后選取254 nm 作為樣品指紋圖譜的檢測波長。

定量指標中黃芩苷、連翹苷、綠原酸為《中國藥典》2020 年版必檢成分；新綠原酸作為綠原酸的同分異構體，有抗炎、增強免疫、心血管保護等作用[18]，且在金銀花中含量較高；連翹酯苷A為連翹中主要活性成分，有抗炎、抗氧化、改善肺損傷的作用[19]；漢黃芩苷為黃芩中重要活性成分之一[20]，具有抗炎、緩解急性肺損傷的作用[21]，因此將此6個成分作為定量指標?！吨袊幍洹?020 年版必檢成分與非《中國藥典》2020 年版規定成分相組合的方式，可以較真實地還原原料藥味的真實性，從而避免藥品質量唯《中國藥典》2020 年版指標成分是重的絕對性。

由研究結果可知，《中國藥典》2020 年版指標成分含量均合格且差異較小，非《中國藥典》2020年版指標成分含量則存在較大差異。尤其是漢黃芩苷，分析樣本產地發現，河南制造商（如F、T 和Z）生產的SHLO 樣品中該成分質量濃度相對穩定，為0.20～0.40 mg·mL-1，而東北制造商（如R、S、L、X）生產的樣品中漢黃芩苷質量濃度差異較大，為0.002 1～1.580 0 mg·mL-1，相差700 余倍。此結果值得筆者團隊更加深入分析研究。各制造商生產的SHLO 產品PA差異較?。ǎ?%），說明各廠家生產工藝相對成熟，在保證每次投料飲片質量均一的情況下，產品批內質量一致性能得到較好的控制；PB遠大于PA表明批間一致性控制較難，也說明原料質量差異是影響不同批次樣品質量的重點。在中藥制劑的生產過程中，中藥材的質量差異會傳遞至處方藥味、中間體及成品，直接影響中藥制劑批間質量的穩定性。為減少此類原因導致的質量波動、提高中藥制劑批間質量一致性，建議各生產廠家依據國家藥品監督管理局藥品評審中心2020 年發布的《中藥均一化研究技術指導原則（試行）》[22]，以減少批間質量波動、達到質量均一為目標，在不改變投料量的前提下，對不同批次具有一定質量波動的合格處方藥味采用合適的均一化投料的措施。根據P將廠家分為3 類，各廠家一致性（24.2≤P≤33.3）有差異但不明顯，且R、F廠家產品質量均一性較其他產品更好。

藥品是具有預防治療疾病功能的特殊商品，質量好壞關系到用藥人群的健康安全。本研究結果揭示了常見8 個廠家的SHLO 存在一定程度上的質量差異，此結果值得醫藥企業關注。該結果也反映出現階段僅依靠國家、地方標準難以使藥品質量均一穩定，期望更多的國家相關部門和專家同行一起關注中成藥質量的一致性問題并提出解決辦法，制定能體現藥品品質的相關標準，共同推進中成藥質量提升，保障中成藥的質量安全穩定。

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